危重患者全血内毒素血症检测的内毒素活性测定法

摘要

本文介绍一种在床旁测定人全血样本内毒素活性的实验方案。内毒素活性检测操作简便，可作为脓毒症危重患者中有用的生物标志物。

摘要

脂多糖（Lipopolysaccharide），也称为内毒素，是革兰氏阴性菌的基本组分，在脓毒症和感染性休克的发生发展中起着关键作用。对迅速进展为危重症的感染过程进行早期识别，可能促使更快速、更强化的治疗干预，从而有望改善患者的预后。内毒素活性（Endotoxin Activity, EA）检测可作为床旁评估全身性内毒素血症的可靠生物标志物。已有大量研究表明，内毒素活性水平升高与脓毒症及感染性休克患者病情严重程度增加密切相关。该检测操作快速且简便。简而言之，在采样后，取一份全血样本与抗内毒素抗体及外源添加的脂多糖（LPS）混合。通过化学发光法检测经致敏的中性粒细胞产生的相对氧化爆发反应，从而测定内毒素活性。检测结果以0（无）至1（最大）的数值范围表示，并分为“低”（<0.4 单位）、“中等”（0.4–0.59 单位）或“高”（≥0.6 单位）三类。本文详细阐述了EA检测的实施方法及其科学依据。

引言

脂多糖（LPS），也称为内毒素，是革兰氏阴性（GN）细菌膜结构的关键组分。它约占细胞壁的10%，对维持外膜完整性和稳态至关重要。此外，它还是宿主先天免疫系统的强效激活剂^1,2。

将固有免疫系统细胞在体外暴露于脂多糖（LPS）可导致多种基因表达发生变化³。在健康人体志愿者中给予极少量LPS可触发急性全身性炎症级联反应，而较高浓度的内毒素则可能引发脓毒症和感染性休克^4,5。

脓毒症是一种危及生命的疾病，若不能及时识别，可能导致多器官衰竭和死亡。脓毒症患者必须得到及时治疗，包括积极的复苏、充分的抗生素治疗、最佳的感染源控制以及及时的器官支持策略。脓毒症病因的诊断主要依赖于临床识别和基于培养的病原体检测⁶。然而，微生物培养结果可能需要长达48小时，且在多达30%的病例中无法得出明确结论⁷。早期识别和干预可能改善患者预后。对于疑似脓毒症的患者，临床决策往往基于生理学和生物化学参数，而缺乏明确的内毒素血症征象。

通过商用检测试剂盒（参见材料表）可在全血中测定内毒素活性（EA）。EA可作为系统性内毒素血症的生物标志物，用于对疾病严重程度进行早期分层，特别是在有发生感染性休克风险的患者中⁸。在最近发表的一项针对感染性休克患者的双盲随机对照临床试验中，该检测被用于指导多粘菌素B血液灌流治疗⁹。在重症患者中，MEDIC研究显示，EA水平升高与多器官功能障碍、重症监护病房（ICU）住院时间延长以及死亡率相关¹⁰。

目前已开发出多种检测内毒素的实验方法。其中，鲎试剂（Limulus Amoebocyte Lysate, LAL）检测法，包括凝胶法、浊度法或显色法，是迄今为止最常用于血清内毒素定量的方法。该方法基于内毒素可诱导鲎（Limulus polyphemus）血淋巴发生凝固的特性。然而，该检测法在特异性方面存在一定的局限性。特别是，除内毒素外，其他微生物产物（如真菌细胞壁组分）也可能激活该反应，同时该反应还可能受到多种人血浆蛋白的抑制¹¹。

在过去的十年中，内毒素活性（EA）的检测已被开发并验证为循环内毒素血症的一种生物标志物。与鲎试剂（LAL）检测相比，EA检测在临床环境中实施起来更快、更简便。此外，研究已证明，在全血中EA检测比LAL检测更准确，无论是在体外还是在体内，均具有更高的灵敏度和特异性¹²。

尽管最初将EA水平作为快速鉴定革兰氏阴性菌（GN细菌）以诊断败血症病因的早期诊断工具，但EA水平也已被研究作为疾病严重程度的生物标志物。在此背景下，研究表明EA在评估因重症疾病（如感染性休克或心脏骤停后综合征）导致的组织低灌注状态方面具有特别价值¹³。近年来，随着血液净化系统的开发，阳性EA结果还被提议作为筛选潜在适合接受此类治疗患者的筛查工具¹⁴。我们近期开展了一项针对107名感染性休克患者中EA早期高水平的流行情况及其临床意义的观察性回顾研究。与其他近期研究结果一致，我们发现EA是评估感染性休克患者疾病严重程度的有前景的指标¹⁵。

本文的目的是描述在床旁或实验室中进行EA检测的方法，并阐述其在脓毒性休克代表性场景中的潜在应用。该技术通过检测中性粒细胞在抗内毒素抗体与脂多糖（LPS）形成的复合物预刺激后氧化爆发增强的程度，从而检测LPS活性。增强的呼吸爆发由化学发光仪检测，所发射光的强度被认为与血液样本中内毒素的含量成正比。该检测所需试剂较少，操作耗时约30分钟，仅需40 µL全血即可完成¹²。

方案

本方案根据机构关于人源生物样本处理的指导原则，并遵循本临床实验室现行的标准操作程序进行。患者检测所涉及的EA数据及临床信息的使用，均符合本机构人体研究伦理委员会的指导原则。

1. 实验室设备和检测试剂盒内容

1. 未使用时，将EA试剂盒置于2–8 °C保存。
2. 每个EA检测包含5种不同的试管；每种试管用于检测的不同部分（见第2节）。
   1. 使用试管#1（“对照”管）测定患者中性粒细胞在无特异性抗体存在时非特异性氧化爆发的基础活性。
   2. 使用试管#2（“样本”管）测定中性粒细胞对LPS-抗体复合物产生的氧化爆发反应。
   3. 使用试管#3（“最大值”管）测定患者中性粒细胞在过量内毒素刺激下产生的最大氧化爆发活性。
   4. 使用试管#4（“LPS”管）作为外源性内毒素的来源。
   5. 使用试管#5（“分装”管）用于血液储存。
      注意：为试管#1、#2和#3各提供了一份重复管，每份血液样本检测共需使用8支试管（EA试剂瓶和质控测试可用于同一包装内的所有检测）。
3. 使用含EDTA抗凝剂的无菌试管采集患者血液样本。进行EA检测前，将血液样本置于室温保存。
4. 开始检测前，打开化学发光仪和恒温振荡培养箱，并将培养箱预热至37 °C。
5. 理想情况下，应在采血后30分钟内开始处理样本。

2. 内毒素活性检测

1. 为需要检测的每位患者的血液样本准备相应的EA试管，并将试管放入试管架中，然后取下管盖。
2. 使用排枪从试剂瓶中吸取1 mL EA试剂，分别加入试管#1（对照管）、#2（样本管）和#3（最大值管），每管均做复孔。
   注意：沿试管内壁加样，以避免溶液溅出。
3. 轻轻倒置血液采集管20次以混匀患者血液样本。然后吸取0.5 mL患者血液加入试管#4（LPS最大值管）和试管#5（分样管）中。将试管#4涡旋振荡10秒。
4. 将装有所有EA试管的试管架放入恒温振荡培养箱中，盖上盖子，在37°C条件下孵育10分钟。
5. 打开盖子，从恒温振荡培养箱中取出试管架。涡旋振荡试管#5（分样管）。使用无菌吸头吸取40 µL血液，分别加入试管#1和#2中，每管均做复孔。
6. 涡旋振荡试管#4（LPS管）。使用同一吸头从试管#4中吸取40 µL血液加入试管#3（最大值管）中，每管均做复孔。
7. 对最终的六支试管（#1、#2、#3及其复孔）进行涡旋振荡，然后将其放回试管架中。
   注意：确保所有试管的涡旋振荡时间相同。
8. 将试管架重新放回恒温振荡培养箱中并盖上盖子。将振荡速度设为100 rpm，开始振荡孵育14分钟。
9. 将标记好的EA芯片卡插入化学发光仪中并按下启动键。在14分钟孵育结束后，按照化学发光仪屏幕上显示的指示，按正确顺序读取EA试管。
10. 在将每支试管放入化学发光仪样品架之前，先轻轻涡旋振荡10秒。打开样品抽屉，将试管#1放入样品架中，然后关闭抽屉，等待相对光单位（RLU）读数。
11. 对试管#2和试管#3重复步骤2.10。
12. 对复孔试管1、2和3重复步骤2.10。
    注意：在步骤2.10至2.12中，尽量使所有试管的涡旋振荡时间保持一致。
13. 所有试管检测完成后，EA结果将自动计算并打印输出。结果以EA单位表示，取自同一样本复孔测定值的平均值。
14. 对每个需要检测的血液样本重复步骤2.2至2.13。
15. 检测完成后，将剩余的试管和EA试剂储存于2–8 °C，可保存最多30天。

结果

一名72岁男性被收治于一家城市教学医院的急诊科（ED）。数天前，他因排尿时有烧灼感前往其初级保健医生处就诊，医生建议其接受短期口服磷霉素治疗。该患者的既往病史包括高血压、无并发症的2型糖尿病以及良性前列腺增生。其正在使用的药物包括依那普利、阿托伐他汀、坦索罗辛和二甲双胍。

在急诊科，患者表现为精神萎靡，唤醒时意识模糊。体温为39.1 °C，心率为125次/分钟，血压为80/40 mmHg，呼吸频率为20次/分钟，室内空气下血氧饱和度（SpO₂）为94%，经鼻导管以4 L/min给予氧气后升至99%。腹部查体正常，仅存在定位不清的轻度耻骨上压痛。经努力后置入导尿管，引流出少量深色脓性尿液。

全血细胞计数显示白细胞计数为 18.5 x 10³。肌酐为 2.7 mg/dL，葡萄糖为 250 mg...

讨论

目前，尽管不同研究报告的数据有所差异，但脓毒性休克的死亡率仍高达40%¹⁶。该领域的大多数专家呼吁需要开发新的、更有效的生物标志物，以帮助临床医生对脓毒性休克患者进行早期诊断、优化管理和预后评估⁶。

进行EA检测无需既往技术知识或复杂的实验室设备，任何医疗保健提供者均可轻松快速地学会如何操作。快速识别出高循环EA水平可能有助于对患者风险进行分层，从而启动更早期且更积极的治疗方案。相反，若EA检测结果低于0.40 EA单位，则可能提示进展为多器官衰竭的风险较低¹⁷。采用患者自身样本作为对照的方法简便，可提高该检测的敏感性，并更准确地反映血液中内毒素血症的真实水平。

使用LPS-抗体复合物及患者自身的中性粒细胞可保护EA试验免受其他因素（如血浆蛋白）可能产生的抑制作用。这一点不适用于其他检测方法，例如LAL试验，后者需要激活凝血级联反应。当内毒素未与特异性受体结合时，LAL试验表现良好；但...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
必需氨基酸检测试剂盒	Spectral Medical Inc.	EAAST-20	包含20次检测及1次质控的套装
Smart Line TL	Berthold	EAASL	发光检测仪
恒温振荡培养箱	GRANT	ES-20	小型恒温振荡培养箱
涡旋混合器	VWR	444-2790	涡旋仪