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方法文章

使用点击器训练与社会观察法教会大鼠自愿更换笼子

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⸱

DOI：

10.3791/58511

⸱

2018年10月25日

 ,  ,  , 
1Translational Animal Research Center, University Medical Centre, Johannes Gutenberg-University Mainz

本文内容

摘要

本方案介绍了一种通过响片训练实现大鼠笼具更换的方法。大鼠不仅可以通过直接训练学习目标行为，还能通过观察学习掌握该行为。实施这一快速且简便的方案，可能有助于改善啮齿类动物饲养设施中的福利与卫生状况。

摘要

笼具清洁是一项常规的饲养管理操作，已知会引发实验大鼠的应激反应。由于应激可能对动物福利产生负面影响，并影响研究结果的可比性和可重复性，因此应尽可能减少或避免实验动物所经历的应激。此外，在更换笼具过程中，大鼠与动物饲养人员的直接接触存在卫生风险，因而可能对大鼠的福利和研究质量产生不利影响。

本方案旨在改进常规的换笼操作。为此，我们提出了一种可行的方案，使大鼠通过响片训练和观察学习，主动自愿地转移到清洁的笼子中。该训练有助于减少因换笼过程中的物理干扰和抓握操作所引起的压力，同时在训练阶段完成后，可减少实验动物与饲养人员之间的直接接触。

对大鼠实施点击器训练快速且简便。大鼠通常对训练表现出兴趣，并能高效地学会期望的行为，即通过管道更换笼子。即使未经直接训练，大鼠也能通过观察学习掌握该行为，因为在测试中，观察学习组有80%的大鼠成功完成了笼子更换。训练还有助于在训练者与动物之间建立信任关系。由于动物实验中卫生与动物福利均至关重要，本方案可能有助于提升高质量研究的实施水平。

引言

常规操作可能会引起实验动物的应激反应1,2,3,4。已有研究表明，更换笼具会增加大鼠的心血管参数和总体活动水平4,5,6。此类应激反应至少部分可能源于更换笼具过程中伴随的物理干扰和抓取操作，而非仅仅由于进入新的陌生环境2,4。尤为重要的是，应激对实验动物福利产生的负面影响7。此外，应激会引起动物行为及其他生理参数的变化，包括自主神经系统、神经内分泌系统和免疫系统的改变。因此，在高质量的动物实验研究中，应激常被视为导致实验结果出现意外偏差的潜在来源，应尽可能避免7,8。减少实验动物应激的方法之一是训练。对动物进行训练通常是实验动物管理中非常有用的工具，事实上也是欧盟指令2010/63/EU所要求的内容9。训练可作为一种环境丰富化手段，并有助于动物更好地适应实验过程，从而有助于维持和提升实验环境中的动物福利10,11,12。一种可行的训练方法是正向强化训练（PRT）。PRT是一种操作性条件反射训练方式，将奖励（例如食物奖励）与期望的行为联系起来13。这种训练方法已在非人灵长类动物的实验环境中广泛应用，以减轻应激并提高动物福利，并逐渐在其他多种动物物种中得到推广10,13,14,15,16。自愿移动行为的训练也常用于优化动物饲养管理17,18,19。正向强化训练不仅是在与动物合作时的有用工具，而且无论所训练的行为是否被直接应用，其本身对动物福利普遍具有积极益处20。本文所述的正向强化训练方案旨在通过让大鼠自愿参与操作过程，从而避免在常规更换笼具期间产生任何形式的应激。

除了可能给动物带来应激外，动物设施中的操作流程在维持生物安全等级方面始终存在隐患，尤其是实验动物与饲养人员之间的直接接触，会带来卫生污染的风险。在以啮齿类动物为主的动物设施中，将动物从污染 cage 转移到清洁 cage 是一项常规且工作量较大的任务。该操作通常涉及动物与人类的直接接触，因而由于可能将定植于人体皮肤上的病原体传播给动物，构成了一项卫生学风险因素21。除来自其他动物媒介的传播外，病原性和非病原性微生物侵入动物设施最主要的途径是通过人类22，23。由于健康状况下降常伴随动物福利水平降低，即使是亚临床感染也可能导致实验结果不可重复，这一点必须明确避免24，25。因此，通过训练动物主动配合更换 cage，可在训练完成后几乎无需动物与饲养人员之间的直接接触即可完成换 cage 操作，从而在开展实验操作时降低潜在的卫生风险。

我们训练大鼠自愿更换笼具的方案可作为实验室大鼠管理的有用工具，该方案将训练作为认知丰富化的一种形式与常规操作相结合。因此，本方案是一种对动物友好的操作程序，有助于提高实验动物设施中大鼠的福利水平。由于训练阶段后的笼具更换几乎无需动物与饲养人员之间的直接接触，该方法还可能有助于维持高水平的卫生状况，从而进一步改善动物实验的质量。

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方案

大鼠的处理及实验操作均遵循欧洲、国家和机构关于动物护理的指南。

1. 适应性驯化与习惯化

注意：如果大鼠未经过运输，适应和习惯化时间可以缩短。对于无创性识别，可使用对皮肤友好的标记笔标记尾部。

  1. 第1周：适应期
    注意：第一周应进行两次操作，分别在大鼠到达当天进行一次，第二次在到达后两天进行。
    1. 在大鼠到达当天：
      1. 将大鼠以两只为一组转移至新的饲养笼中。同时转移部分原有的垫料和筑巢材料，以及一些它们熟悉的食物颗粒，以促进其对新环境的适应。
      2. 避免抓住大鼠尾巴将其提起。尽可能将一只手置于大鼠腹部下方或环绕其胸部，另一只手托住后肢以安全提起大鼠（图1）26。
    2. 在大鼠到达后的第二天：
    3. 打开大鼠的饲养笼，将手放入笼内，让大鼠嗅闻并探索手部。如果大鼠试图逃出笼子，可轻轻将其推回笼内。此操作持续四分钟。
    4. 如果大鼠表现出恐惧且未开始探索环境，则需每天重复该操作一次，直至大鼠开始主动探索。在此情况下，可能需要对响片（clicker）进行适应训练。
      注意：大鼠会使用所有感官探索新事物，因此经过一段时间后，它们会识别出实验人员是熟悉的。大鼠可能会用口部探索手部，但不应具有侵入性。若出现此情况，应缓慢移开手，以防止手套被破坏。
    5. 将少量计划用作奖励的食物小块添加到饲养笼中。
      注意：食物奖励必须符合实验动物营养要求。本方案中使用白巧克力（置于注射器末端），但也可使用其他食物，如干果、新鲜水果或谷物类食品。若动物设施的卫生要求有特殊规定，可从多种专供实验动物使用的零食供应商中选择。应优先选择最健康的食物，但高脂肪和高糖的组合可能更能提高动物参与实验的积极性。
  2. 第2周：适应实验人员及食物奖励
    1. 继续进行上一周开始的手部接触和食物奖励适应训练。每日互动时间限制为两分钟。
    2. 对于极度焦虑的大鼠，可能需要进行响片适应训练。
      1. 为评估该行为，在第1天训练结束后，每隔五秒点击响片一次。若大鼠表现出与恐惧相关的行为，则需进行响片适应训练。
      2. 进行响片适应时，在大鼠进食放置于笼内的奖励食物期间，连续点击响片五次。当大鼠不再表现出任何与恐惧相关的行为时，即完成响片适应。
  3. 第3周：适应高强度操作
    1. 在第1至第3天，开始对大鼠进行短暂提起或抚摸操作（持续数秒），并逐渐延长操作时间（每只大鼠最长不超过两分钟）。若大鼠出现冻结、躲避或躲藏等厌恶行为，应立即停止操作。
    2. 在第4和第5天，以Cloutier 等（2012）27描述的搔痒方式结束操作。
      注意：成功适应的指标包括大鼠愿意从实验人员手中取食奖励，或主动靠近手部、探索手部或触碰手部等行为。

2. 点击器训练

注意：一次训练持续四分钟，由30秒训练和15秒休息交替组成。在休息期间移除任何添加的材料。观察大鼠可自由活动，允许其参与并摄取奖励，但注意力应完全集中在另一只大鼠身上。所有大鼠在第一天和第五天均接受搔痒刺激。训练成功的关键在于实验者需密切关注动物行为，并保持镇定。训练效果高度依赖实验者对时机的把握和观察能力。训练过程中不给予口头反馈，与动物的口头交流仅可在训练 session 之外进行。目标行为被重复执行是学习成功的指标。

  1. 准备
    1. 准备好所需材料，例如奖励物、响片/目标棒组合、计时器、清洁的笼子、金属管以及任何其他特定训练材料。
    2. 将饲养笼转移到安静的地方。
    3. 从笼中移除所有物品，仅保留两只大鼠（训练鼠和观察鼠）及垫料。
  2. 训练第1天：建立初级强化物与次级强化物之间的关联
    1. 在饲养笼中放置一个短隧道，最好选择大鼠熟悉的类型。
    2. 等待大鼠进入隧道并坐下后，给予奖励食物。
      注意：如果大鼠在训练情境下不进食，则必须延长或调整习惯化阶段。
    3. 一旦大鼠对奖励表现出兴趣并即将开始啃食时，立即按响响片，然后让大鼠食用奖励。为确保两种强化物成功配对，在15秒内重复“响片-奖励”操作，本次训练至少进行两次。
    4. 如果大鼠参与了训练，需检查其是否已建立初级与次级强化物之间的关联。判断的主要标准是大鼠是否表现出对食物奖励的预期行为，例如嗅探、四处张望、注视递送食物的手，或以后肢站立以寻找奖励（图2）。若出现上述行为，则进入下一阶段；否则，重复"训练第1天"。
  3. 训练第2至5天：穿过短隧道
    注意：一次训练会话包括交替进行的30秒训练期和15秒休息期，持续四分钟。
    1. 在饲养笼中放置一段与首次使用或原始隧道材质相同的短隧道，该隧道将用于连接两个笼子。
    2. 启动计时器，并立即开始第一个30秒的训练。
      1. 当大鼠第一次进入隧道时，在隧道末端出示奖励物。一旦大鼠进入隧道，立即按响响片并让其食用奖励。
      2. 收回食物奖励，等待大鼠再次对隧道表现出兴趣。当大鼠一进入隧道，立即按响响片，并在隧道末端出示奖励物（图3）。
      3. 30秒训练结束后，进行15秒休息（移除隧道）。
    3. 重复进行30秒训练与15秒休息，共持续四分钟。
    4. 如果大鼠每分钟表现出目标行为超过四次，则停止使用响片，仅用初级强化物进行奖励。
    5. 四分钟后停止训练。
  4. 训练第2周：触碰目标棒
    1. 启动计时器，并立即开始第一个30秒的训练。每15秒加入一次休息，然后继续训练。
    2. 将目标棒的球状端靠近大鼠。
    3. 一旦大鼠对球状端表现出兴趣，立即按响响片并给予奖励。重复此操作数次。
    4. 如果大鼠每分钟对球状端表现出兴趣超过四次，则下一步需强化的行为为"用鼻子触碰球状端"。
    5. 如果大鼠每分钟重复该行为超过四次，则停止使用响片，仅用初级强化物进行奖励。
    6. 四分钟后停止训练。
  5. 训练第3周（五天）和第4周（三天）：通过隧道更换笼子
    注意：本阶段仅对从饲养笼经隧道进入清洁笼的行为进行强化。第4周的训练缩短为三天，此时间已足以达成训练目标，并为后续实验的数据采集或评估预留出额外一天。
    1. 使用一根比之前更长但大鼠已熟悉的隧道，将饲养笼与一个新的清洁笼连接起来。
    2. 第一天不进行训练，仅让大鼠自由探索隧道。它们很可能自行穿过隧道。
    3. 第二天，给予大鼠两分钟时间，让其自行从脏侧穿过隧道到达清洁侧。如果大鼠能自由通过隧道，则跳至步骤2.5.8。
    4. 否则，开始第一个为期四分钟的训练会话（交替进行30秒训练和15秒休息）。
    5. 一旦大鼠对隧道表现出兴趣，立即按响响片并给予奖励。
    6. 接下来，当大鼠进入隧道时进行响片-奖励。
    7. 当大鼠进一步深入隧道时，继续进行响片-奖励。
    8. 以类似方式逐步强化，直至大鼠能够跑完整个隧道。当大鼠开始从隧道末端探头进入清洁笼时，出示目标棒的球状端，按响响片，并在其触碰球状端时给予奖励。
    9. 最后，引导大鼠离开隧道。使用目标棒的球状端进行引导：将球状端置于新笼子中央前方，当大鼠踏入新笼并触碰球状端时，立即按响响片并给予奖励。
    10. 将大鼠重新转移回"脏"的饲养笼。一只手托住大鼠腹部或环绕胸部，另一只手支撑其后肢，将其提起（图1）。在清洁笼中央出示目标棒的球状端，当大鼠跑过隧道并触碰目标棒时，按响响片并给予奖励（图4）。
    11. 如果大鼠每分钟重复该行为超过四次，则停止使用响片，仅用初级强化物进行奖励。
    12. 四分钟后停止训练。

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结果

训练在一组十只雌性Lister hooded（LD）大鼠中进行。另设一组十只未经训练但经过温和抓握处理的雌性LD大鼠作为对照组。温和抓握处理是指仅用手托住大鼠身体进行移动，而不抓其尾根部。为了评估观察学习的效果，我们增设了第三组十只雌性LD大鼠，该组大鼠未接受直接训练，但与受训大鼠同笼饲养，能够观察训练过程。所有大鼠均完成了适应性训练及抓握习惯化过程。训练内容包括通过一根金属管移动到新笼子中（图4）。当演示出目标行为时，给予奖励（图4）。每次训练均进行评估，并将训练结果分为三类：参与、未参与和探索性行为。受训大鼠总体上对训练表现出兴趣，同时也展现出强烈的新环境探索动机。尤其在训练初期，探索性行为尤为明显（图5）。仅经过三天训练后，大多数大鼠已表现出目标行为，能够通过金属管更换笼子（图5）。完成五天训练后，所有受训大鼠均能成功执行该行为（...

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讨论

上述方案是我们先前所描述的实验小鼠响片训练方案的一种有益扩展应用10。该方案每天仅需数分钟，总计持续七周，包括适应、习惯化和响片训练阶段。为便于实施，本方案限定在工作日进行，每对大鼠的训练时间约为十分钟。尽管在大规模大鼠群体中建立该流程看似耗时，但如果动物将用于长期实验或作为种鼠，该方案长期来看有助于改善换笼操作。此外，在实验过程中减少干扰可提高实验结果的质量。需要说明的是，本方案中所有标注的时间均为建议值，可根据各实验室的具体需求进行调整。若动物学习速度较快，或大鼠已充分习惯化，训练时间可相应缩短。通常情况下，大鼠对训练表现出兴趣，仅需少数几次重复即可掌握目标行为"通过管道换笼"。即使未经直接训练，通过观察学习的大鼠中也有80%在测试时能够主动完成目标换笼行为。本文介绍了一种经过训练的换笼方法，因为换笼是动物饲养中频繁进行的常规操作，已知会对动物造成应激。这种应激至少部分源于换笼过程中的身体干扰2,4。训练使大鼠能够主动自愿地配合完成这一饲养操作。研究表明...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者非常感谢 Thomas Wacker 提供的技术支持。我们还感谢 Dr. Mirjam Roth 的大力支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带点击器的目标棒Trixie2282
金属管（Alu Flexrohr nw 100）Rotheigner可在建材市场购得
白巧克力/白巧克力奶油公司品牌不限，建议选用有机品质
Prism 6.0 for MacGraphPad Software

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