本文介绍了一种通过向睾丸内注射菊粉-异硫氰酸荧光素（inulin-FITC）来评估血睾屏障完整性的实验方案。该方法高效 体内 研究可受遗传和环境因素影响的血睾屏障完整性的方法。
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本文内容
摘要
摘要
精子发生是指精原细胞在睾丸曲细精管中发育为成熟精子的过程。该过程依赖于支持细胞在血睾屏障（BTB）处形成的细胞连接结构。血睾屏障是哺乳动物体内最紧密的组织屏障，可将曲细精管上皮分为基底室和近腔室两个区室。BTB为处于减数分裂I/II期的生殖细胞以及经精子形成过程由减数分裂后精细胞发育为精子提供了独特的微环境。本文介绍一种可靠的小鼠睾丸血睾屏障完整性检测方法。 体内完整的血睾屏障（BTB）可阻止荧光素异硫氰酸盐标记的菊粉（FITC-conjugated inulin）从生精小管的基底室向顶室扩散。该技术适用于研究可能影响BTB功能或完整性的候选基因、病毒或环境毒物，与替代方法相比，操作简便且对外科技术要求较低。
引言
哺乳动物的精子发生被认为是一个高度有序的过程，包括精原细胞通过有丝分裂、减数分裂和精子形成，从自我更新和分化为单倍体精子细胞，在此过程中发生显著的生物化学和形态学变化。发育中的生殖细胞从曲细精管的基底部逐步向管腔方向迁移。该过程受到生殖细胞与支持细胞之间细胞间连接的调控1,2。相邻的支持细胞在曲细精管基部附近形成血睾屏障（BTB），该屏障在结构上将上皮分为基底室和近腔室。在上皮周期的第VIII至IX期，来自基底室的前细线期/细线期精母细胞迁移穿过BTB，进入近腔室3。因此，BTB的功能是为减数分裂和精子形成的完成提供一个免疫豁免的微环境4,5,6。与其他仅由紧密连接（TJs）构成的血-组织屏障（例如，血脑屏障）不同，BTB由支持细胞之间的四种不同类型的连接结构共同构成，包括紧密连接（TJs）、胞质特殊化结构、缝隙连接和基于中间纤维的桥粒1,7。
许多研究采用基因修饰小鼠、病毒感染以及环境毒物来探究血睾屏障完整性的机制7,8,9BTB的破坏会导致生精功能障碍以及生育力下降或不育。由于已证实BTB的形成和完整性受到支持细胞之间相互接触的影响8，一个 体外 基于分离的塞尔托利细胞原代培养的模型已被用于血睾屏障研究。然而，该模型无法准确模拟血睾屏障的动态变化 体内此外，目前尚未建立能够反映血睾屏障所有相关结构和功能组分的生精细胞与支持细胞共培养体系10,11.
通常，体内 血睾屏障（BTB）完整性检测主要基于小分子化合物，例如 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 和荧光素异硫氰酸酯标记的菊粉（inulin-FITC）。正常情况下，生物素或 inulin-FITC 无法从基底室扩散，因其扩散受到 BTB 结构的阻隔。因此，我们可通过该方法评估实验组相对于对照组的 BTB 损伤程度。当 BTB 受到特定刺激（如氯化镉（CdCl2）处理）而受损时12，小分子即可穿透 BTB 并进入管腔侧室，从而作为屏障通透性的指示剂。
早期 体内 血睾屏障完整性检测需要将生物素或荧光素标记的菊粉（inulin-FITC）注入颈静脉，该过程需手术操作，具有侵入性，且步骤复杂、耗时较长。此外，由于示踪物质通过血液循环扩散至全身，生精小管局部的生物素或inulin-FITC浓度受限。同时，全身暴露可能引发免疫反应。本文介绍一种简便且有效的 体内 血睾屏障完整性检测，通过直接将少量荧光素标记的菊粉（inulin-FITC）注入睾丸间质组织实现。采用荧光标记方法，染色过程简便，无需使用二抗。此处可直观观察荧光染料进入睾丸的过程。
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方案
所有动物实验均已获得南京医科大学委员会的批准。雄性C57BL/6小鼠在受控的光周期条件下饲养，并自由摄取食物和水。
1. 准备工作
- 显微注射毛细管
- 使用外径、内径和长度分别为 1.0 mm、0.8 mm 和 10.0 cm 的显微注射毛细管。
- 使用毛细管拉制仪将玻璃毛细管拉制（图 1A）。根据所使用的毛细管拉制仪型号测试并调整参数设置。
- 用镊子折断移液管尖端，使毛细管尖端直径约为 50 µm。
注意：尖端可能过长，难以刺入睾丸。 - 使用微移液管斜面打磨仪将尖端打磨成 30° 角（图 1C）。
- 试剂
- 配制 1% 戊巴比妥钠溶液：将 100 mg 戊巴比妥钠溶解于 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中（步骤 2.3.3）。
- 配制 10 mg/mL 菊粉-FITC 溶液：将 1 mg 菊粉-FITC 溶解于 100 μL PBS 中（步骤 2.1.6）。
- 配制 4% 多聚甲醛溶液：将 4 g 多聚甲醛（PFA）溶解于 100 mL PBS 中（步骤 2.3.3）。
- 配制 30% 蔗糖溶液：将 3 g 蔗糖溶解于 10 mL PBS 中（步骤 2.3.4）。
- 配制 0.1% 氯化镉溶液：将 10 mg 氯化镉溶解于 10 mL PBS 中（步骤 2.1.1）。
2. 方法
- 麻醉与术前准备
- 称重8周龄C57BL/6雄性小鼠，并计算所需CdCl₂剂量2. 处理一组小鼠（n = 3）与 CdCl2 （5 mg/kg 体重，腹腔注射）连续3天。另取一组8周龄C57BL/6雄性小鼠，n = 3），以PBS作为对照。
- 在无菌条件下进行手术，使用无菌注射器、针头、剪刀和镊子。
- 新鲜配制麻醉工作液。所需麻醉剂量为每千克体重70 mg戊巴比妥钠。通常，8周龄成年C57BL/6小鼠体重约为25 g，相当于175 μL的1%戊巴比妥钠溶液（每只小鼠1.75 mg）。
注意： 戊巴比妥钠溶解于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。使用前，溶液经0.22 μm滤器过滤。 - 用75%乙醇清洁手术区域，并用干净的纱布覆盖该区域。
- 打开恒温加热器，并将温度调节至 37 °C。
- 手术当天配制菊粉-FITC工作液（10 mg/mL）。
- 手术操作
- 称重8周龄C57BL/6雄性小鼠，并计算所需麻醉剂剂量。
- 使用1 mL无菌注射器进行戊巴比妥钠腹腔注射。将小鼠置于洁净的笼子中。
- 观察小鼠的眼部反射反应和呼吸模式，以确认其已处于完全麻醉状态。
注意：通常需要 10 - 15 分钟，直到小鼠深度麻醉，完全无脚趾夹捏反应，并保持缓慢、稳定的呼吸。 - 将小鼠移至操作区域，并用湿润的纸巾覆盖其眼部，以避免麻醉期间眼睛干燥图2A).
- 用剃刀剃除其腹部的毛发 用剃刀剃除手术区域的毛发，并用75%乙醇消毒。
- 用锋利的剪刀在包皮腺上方做一条1 cm的皮肤切口，以暴露腹壁。用小镊子提起腹壁，做一条0.5 cm的切口，以暴露腹膜腔。图2B).
- 使用镊子寻找附睾和睾丸周围的脂肪垫。小心地将脂肪垫拉出，以清晰暴露相连的睾丸。图2C 和 二维通常一次只对一个睾丸进行操作。
注意：避免用手触碰脂肪垫和睾丸。 - 在脂肪垫和睾丸下方放置一张直径为9 cm的滤纸图2C).
- 将菊粉-FITC注入显微注射移液管，并连接至显微操作仪装置（图1D）。轻轻将显微注射针插入白膜下方，并向睾丸间质中注入总共 20 μL 的荧光素标记菊粉（inulin-FITC）图2E 和 2F).
注意：应小心下压显微注射移液管，避免其发生移动。 - 监测肌酐-FITC 在睾丸中的移动图2G).
- 注射完成后立即将睾丸放回腹腔内。
- 对对侧睾丸重复上述操作。该睾丸注射20 μL PBS作为对照。
- 用外科缝线闭合皮肤，并将小鼠转移至恒温加热器的加热垫上图1B). 通过皮下注射给予每1 kg体重1 mg的镇痛剂（丁丙诺啡）。
- 睾丸的采集与冷冻切片制备
- 注射后40分钟，根据动物护理与使用指南，通过颈椎脱位法处死受体小鼠。
- 使用一把锋利的剪刀采集睾丸。将睾丸放入1 mL预冷的PBS中，以去除任何血液污染。
- 在4 °C下用4%多聚甲醛（PFA）固定睾丸组织12–24小时。弃去4% PFA，于室温下用1.5 mL 1% PBS洗涤组织3次。
- 将组织置于30%蔗糖中过夜脱水。将睾丸放入包埋框中，并用最佳切割温度化合物（OCT）覆盖组织。待OCT冻结后，向包埋框中加满OCT，使整个睾丸完全被OCT覆盖。
- 在-20 °C下用冷冻切片机对睾丸组织进行冷冻横切，切片厚度为5 μm，并使其贴附于显微镜载玻片上。
注意：将包埋的组织在干冰中重新冷冻可能会增加切割时的硬度。
- 图像申请
- 将载玻片放入湿盒中，在室温下孵育10分钟。
- 用Tris缓冲盐水（TBS）在室温下洗涤切片3次。
- 在避光条件下风干5分钟。用无尘纸擦去残留的TBS。
- 用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）覆盖横截面。将倒置的盖玻片置于显微镜载玻片上。
- 使用共聚焦显微镜采集图像。通常，20倍放大倍数足以检测强荧光信号。
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结果
进行BTB完整性检测的实验装置如图1所示。分别使用毛细管拉制仪和微电极斜面抛光仪来牵拉并 sharpen 微注射毛细管（图1A 和 1C）。恒温加热装置及微注射设备如图1B 和 1D 所示。
图2展示了注射荧光素标记的菊粉（inulin-FITC）过程中的几个关键步骤。在小鼠完全麻醉后，使用剪刀做一小切口（图2A 和 2B）。暴露小鼠睾丸，并使用显微注射移液器注入荧光染料（图2C -
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讨论
精子发生发生在生精上皮中，是一个由生殖细胞和体细胞共同调控的高度有序且动态的过程（例如, 支持细胞13血睾屏障结构由支持细胞构成，将生精上皮分为基底室和顶腔室。减数分裂及单倍体生殖细胞的发育发生在顶腔室，该结构形成一道免疫屏障。14.
血睾屏障功能可能因毒性物质或参与细胞连接形成的基因缺陷而受损，从而导致男性不育。为了检测血睾屏障的完整性，一种 体外 支持形成功能性上皮的Sertoli细胞培养体系已建立，该上皮可紧密模拟血睾屏障（BTB） 体内15。这一点 体外 系统为研究支持细胞连接的结构与功能提供了一个简单的模型。然而，从睾丸中分离并培养的支持细胞 体外 在动物年龄和细胞密度方面存在局限性15,16此外，必须监测支...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由国家关键研发计划&中国国家重点研发计划（2016YFA0500902）、国家自然科学基金（31471228，31771653）、江苏省杰出青年科学基金（BK20150047） 江苏省自然科学基金（BK20140897，14KJA180005）以及江苏省创新创业计划对 K.Z. 的资助
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 毛细管拉制仪 | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | 用 ddH2O 稀释至 1× |
| 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma (USA) | F6057 | |
| 黏附性显微镜载玻片 | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| 氯化镉 | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| 无尘纸 | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| 菊粉-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| 显微注射毛细管 | 正天仪 (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| 微电极斜面抛光仪 | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT 包埋剂 | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| 多聚甲醛 | Sigma (USA) | P6148 | |
| 戊巴比妥钠 | Merck (Germany) | P11011 | |
| 剃毛器 | 雅森 (China) | ||
| 体视显微镜 | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| 蔗糖 | 生工生物 (China) | A610498 | |
| 手术器械 | Stronger (China) | 剪刀、镊子、持针器 | |
| 注射器 | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| 恒温加热器 | KELL (中国南京) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | 生工生物 (China) | A600194 | |
| 1.37 M NaCl | 生工生物 (China) | A610476 |
参考文献
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