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方法文章

小鼠经颅直流电刺激（tDCS）

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DOI：

10.3791/58517

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2018年9月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Tecnologia em Medicina Molecular (CTMM), Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais

本文内容

摘要

经颅直流电刺激（tDCS）是一种用于治疗精神疾病的研究性治疗技术。建立动物模型对于理解tDCS所引发的特定生物学改变至关重要。本方案描述了一种采用慢性植入电极的小鼠tDCS模型。

摘要

经颅直流电刺激（tDCS）是一种非侵入性神经调节技术，被提出作为多种神经精神疾病的一种替代或辅助治疗方法。tDCS 的生物学效应尚未完全阐明，部分原因在于难以获取人脑组织样本。本方案描述了一种使用慢性植入电极的小鼠 tDCS 模型，可用于研究 tDCS 长期存在的生物学效应。在此实验模型中，tDCS 可改变皮层基因表达，从而为理解其治疗应用的科学依据提供了重要贡献。

引言

经颅直流电刺激（tDCS）是一种非侵入性、低成本的治疗技术，通过使用低强度持续电流来实现神经元调节1。目前tDCS有两种配置方式（阳极和阴极）。尽管阳极刺激产生的电场强度过弱而无法引发动作电位，但电生理学研究已表明该方法可引起突触可塑性的改变2。例如，有证据显示tDCS可诱导出类似长时程增强（LTP）的效应，如兴奋性突触后电位峰值幅度增加3,4，以及皮层兴奋性的调节5。

相反，阴极刺激可诱导抑制效应，导致膜电位超极化6该机制的假设基于生理学研究发现，即tDCS被证实可调节神经元胞体的动作电位频率和持续时间3值得注意的是，这种效应并不直接引发动作电位，但可改变去极化阈值，从而促进或抑制神经元放电。7这些相反的作用此前已有报道。例如，阳极和阴极刺激在记录到的条件反应中产生了相反的效果 通过 家兔的肌电图活动8然而，研究也表明，长时间的阳极刺激可能会降低兴奋性，而增加阴极电流则可能提高兴奋性，表现出自相矛盾的效果3.

阳极和阴极刺激均采用电极对进行。例如，在阳极刺激中，将“"活性"”或“"阳极"”电极置于目标调节的脑区上方，而“"参考"”或“"阴极"”电极则置于电流效应被认为可忽略的脑区9。在阴极刺激中，电极的放置位置相反。有效的经颅直流电刺激（tDCS）刺激强度取决于电流强度和电极尺寸，这两者对电场的影响不同10。在大多数已发表的研究中，人体的平均电流强度为0.10至2.0 mA，小鼠则为0.1 mA至0.8 mA6,11。尽管人体通常使用35 cm2的电极尺寸，但目前对啮齿类动物的电极尺寸尚无明确认识，仍需更深入的研究6。

经颅直流电刺激（tDCS）已在临床研究中被提出，旨在为多种神经及神经精神疾病提供替代或辅助治疗方案11，例如癫痫12、双相情感障碍13、脑卒中5、重度抑郁症14、阿尔茨海默病15、多发性硬化16和帕金森病17。尽管人们对tDCS及其在临床试验中的应用兴趣日益增加，但其在脑组织中引发的细胞与分子层面的具体改变、短期与长期效应以及行为学结果，仍有待进一步深入研究18,19。由于直接在人体上深入研究tDCS并不可行，因此采用tDCS动物模型可能提供有价值的见解，有助于揭示tDCS治疗机制背后的细胞与分子事件，这得益于动物脑组织的可及性。

目前关于小鼠tDCS模型的证据较为有限。大多数已报道的模型采用了不同的植入布局、电极尺寸和材料。例如，Winkler et al.（2017）将头部电极（Ag/AgCl，直径4 mm）用生理盐水填充后植入，并使用丙烯酸树脂水泥和螺钉将其固定在颅骨上20。与我们的方法不同，他们的胸部电极为植入式（铂金材质，20 × 1.5 mm）。Nasehi et al.（2017）采用的方法与我们非常相似，但胸部电极由浸有生理盐水的海绵（含碳，9.5 cm2）制成21。另一项研究将两个电极均植入动物头部，通过固定板并用导电水凝胶覆盖动物头部实现22。本文中，我们描述了一种小鼠tDCS模型，该模型通过简单的外科手术和tDCS装置设置，使用慢性植入电极完成（图1）。

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方案

使用单独饲养的雄性成年（8-12周龄）C57BL/6小鼠进行本实验。实验前后及实验过程中均对动物给予适当护理，并提供食物和水 随意摄取 所有实验程序均经米纳斯吉拉斯联邦大学动物伦理委员会批准 （方案编号 59/2014）

1. 电极放置

  1. 将动物麻醉并固定于立体定位仪上
    1. 对所有必要的手术器械进行灭菌。
      注意：手术器械在440 °C下灭菌3分钟。棉签在121 °C、20 psi（磅/平方英寸）条件下高压灭菌20分钟。
    2. 将热平台控制器调节至 37 °C。
    3. 称重动物并计算合适的麻醉诱导剂量。腹腔注射给予氯胺酮和赛拉嗪混合物，剂量为每千克体重100 mg氯胺酮和8 mg赛拉嗪（针头规格：31 G）。动物应在2至3分钟内入睡。
    4. 使用电动剃须刀或剃刀剃除手术区域的毛发。
    5. 将动物放置于预热的加热板上的立体定位仪中。
    6. 固定动物头部，并将耳棒尖端插入动物两侧耳道，以将其固定在立体定位仪平台上。
    7. 通过缓慢调整动物头部位置，确认无横向头部偏移且垂直方向移动极小。
    8. 轻轻将麻醉面罩滑至小鼠鼻部，并通过拧紧螺丝将其固定。
    9. 将异氟烷浓度设定为1%，氧流量为1.0 L/min2.
    10. 手术过程中，为防止角膜干燥，需在动物眼部涂抹眼药膏。
  2. 将植入物固定到动物头部
    1. 使用棉签交替涂抹聚维酮碘（或2%氯己定）和70%乙醇，对手术部位进行三次交替消毒。
    2. 使用镊子轻轻夹捏动物的脚趾，通过观察其足部退缩（脚趾夹捏）反射是否消失来验证麻醉深度。
    3. 在动物耳线后方约3毫米处做切口，至眼线处停止。切口长度应约为1厘米，以确保足够容纳植入物。
    4. 用骨刮匙轻轻刮擦颅骨，以增加胶水和粘固剂的附着力。操作时手法宜轻，旨在产生微小划痕。
    5. 小心地将手术钩置于松弛的皮肤上，以保持手术视野开放，避免皮肤和毛发等障碍物遮挡。
    6. 使用无菌棉签擦干动物的头皮。
    7. 使用解剖显微镜观察动物颅骨顶部。
    8. 将针头连接至立体定位仪持针器上，找到前囟。将针头置于动物头部正上方，正对前囟位置并轻微接触前囟。
    9. 将数字追踪仪的所有坐标归零，然后抬起针头。
    10. 将tDCS植入物固定在立体定位仪夹持器上。将植入物置于动物头部上方，根据正确的立体定位坐标，缓慢下降至目标区域。
    11. 使用针头将1滴（约35 μL）超级胶水均匀涂抹在植入物基部。
    12. 缓慢地将固定器向下移动，直至其接触颅骨。确保植入基座完全与颅骨表面接触。
    13. 根据制造商的说明制备外科水泥。
    14. 精确定位后，使用毛刷逐滴将水泥均匀涂抹于颅骨及植入物的下部区域，共涂抹三层，每层应薄而均匀。各层需形成丘状结构，以进一步增强植入物的结构支撑。
    15. 保持植入物的螺纹部分无骨水泥残留，以确保连接顺畅且无阻碍。
    16. 让每一层干燥约4分钟。
    17. 干燥后，小心取下固定器，直至其完全与植入物分离。操作植入物时务必格外谨慎，以防其意外从动物颅骨中脱出。
  3. 完成手术与术后护理
    1. 用生理盐水浸湿的棉签润湿动物手术切口部位的皮肤。
    2. 在tDCS植入物基部的皮肤表面进行包被。
    3. 使用镊子将组织对合，每0.2 cm组织用一滴外科组织胶水闭合切口。
    4. 在切口部位及下方组织浸润1-2%利多卡因。
    5. 皮下注射 500 µL 乳酸林格液以对小鼠进行水化。
    6. 将小鼠放入已预热至37 °C的清洁单养笼具中。
    7. 在笼内放置一个装有湿润食物颗粒的小碟，以便在接下来的几个小时内方便取食。
    8. 记录动物术后体重。
    9. 手术后及术后接下来的2天，皮下注射酮洛芬（5 mg/kg）给动物。
    10. 密切监测动物恢复情况至少1周。评估任何痛苦迹象，例如毛发竖立、缺乏理毛行为、活动减少、抓挠伤口及手术部位炎症。

2. tDCS 设置与刺激

  1. tDCS 设置（参见 图2）
    ​注意：确保 tDCS 刺激器已完全充电。
    1. 将阳极和阴极导线连接至 tDCS 刺激器，并将其放置在刺激部位附近。将针型电极固定在立体定位仪夹持器上。
    2. 将加热平台设定为 37 °C。
    3. 打开吸入麻醉系统的氧气流量计，调节至 1 L/min。
    4. 将小鼠放入麻醉诱导室中。
    5. 开启异氟烷蒸发器至 3%。让动物接受异氟烷作用 4 分钟。
    6. 在动物处于诱导室期间，使用无菌注射器将体表电极填充 0.9% 生理盐水溶液。
    7. 将动物从诱导室中取出，并将其胸部置于体表电极上方。
    8. 轻柔地将麻醉面罩滑至小鼠鼻部并固定。将异氟烷输出浓度下调至 1.5%。
    9. 用生理盐水填充植入电极和针型电极，并小心连接。
    10. 调节刺激时间和电流强度。
    11. 在 tDCS 刺激器上检查接触质量。理想的接触质量评分为 1 到 10 分之间的 7 至 10 分。
  2. 刺激过程
    1. 开始刺激。
    2. 观察电流在 30 秒内逐渐上升至设定值，并在规定时间内保持稳定，随后在刺激结束时再次逐渐下降。
    3. 对对照组小鼠激活伪刺激按钮。
    4. 观察电流在 30 秒内上升至设定值，随后下降至 1，并在整个剩余刺激期间维持该状态，最后再次短暂上升至设定值，紧接着迅速下降。
    5. 刺激结束后，小心将动物转移至预热（37 °C）的笼子中，静置 10 分钟。
      注意：动物通常在 3 分钟后开始苏醒。
    6. 关闭吸入麻醉系统。

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结果

该手术方案实现了至少一个月的长期植入稳定性，在刺激部位未观察到炎症信号或其他不良反应。所有动物均成功存活手术及经颅直流电刺激（tDCS）过程（n = 8）。本实验中，tDCS植入物被放置于M1和M2皮层区域（前囟前后向+1.0 mm，左右向0.0 mm）。一周后，对tDCS组（n = 3–4）和假刺激组（n = 3）小鼠连续5天每天进行10分钟、0.35 mA的刺激。记录接触质量（CQ）值以评估植入物的可用性，在为期5天的刺激过程中，各组之间未发现显著差异。图3A）。通过使用该动物模型，可通过评估脑源性神经营养因子（BDNF胶质纤维酸性蛋白 (GFAP）。两者 BDNF 和 GFAP 与假刺激组相比，植入物下方皮层区域的mRNA水平显著升高。tDCS对基因表达的影响似乎仅限于特定基因，因为活性调节细胞骨架相关蛋白（ARC）以及突触素1（synapsin 1）SYN1）基因未发生改变（

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讨论

近年来，神经刺激技术作为治疗神经精神疾病的一种前景广阔的手段，正逐步进入临床实践23。为了减轻因对神经刺激机制了解不足所带来的限制，本文介绍了一种携带可靶向脑区电极的经颅直流电刺激（tDCS）小鼠模型。由于该电极可长期植入，此动物模型可用于研究tDCS在复杂刺激模式下诱导的持久生物学效应（至少持续1个月）。所述tDCS动物模型具有较高的植入耐受性，若操作得当，感染风险极低。总体而言，植入手术步骤简便快捷（每只动物约30分钟）。该tDCS模型的另一优势在于，能够实时监测电极接触质量以及实际的电流刺激值。

该动物模型的主要缺点在于植入物在小鼠颅骨上的正确固定。手术过程中，必须以确保动物头部无法发生侧向移动的方式固定其头部（仅允许垂直方向的移动）。这将保证动物头皮与植入物基底完全对齐，从而实现与牙科水泥的牢固固定，并提高对目标区域调控的精确性。切口必须足够大以容纳植入物，某些tDCS植入物可能需要更大的切口。使用由皮下注射针头制成的两到四个手术钩可增加水泥粘结面积，但应避免将钩子放置在过于靠近动物眼睛的位置，以防造成损伤。轻柔刮擦头皮有助于...

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致谢

感谢 Rodrigo de Souza 先生在小鼠品系维护方面提供的帮助。L.A.V.M 是 CAPES 项目的博士后研究员。本工作由 PRONEX 基金（FAPEMIG：APQ-00476-14）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD Ultra-Fine 50U 注射器BD10033430026用于腹腔注射。
剃须刀（Philips Multigroom）飞利浦（巴西）QG3340/16用于手术部位修剪。
<强>外科器械
Model 940 小动物立体定位仪配数字显示控制台KOPF940用于动物手术中的固定与体位摆放。
Model 922 60度尖端非穿刺耳杆KOPF922用于动物手术中的固定与体位安置。
导管固定器KOPF1766-AP用于植入定位。
带支架臂的精密立体变焦双目显微镜（III）WPIPZMIII-BS用于确定前囟位置和植入物定位。
温度控制系统模型 KOPFTCAT-2LV用于动物体温控制。
冷光源 WPIWA-12633对于局部亮度
带废气清除功能的台式实验动物麻醉系统VetEquip901820用于异氟烷输送与安全防护。
VaporGuard 活性炭吸附滤芯VetEquip931401递送系统安全措施 
Model 923-B 小鼠气体麻醉头部固定器KOPF923-B用于动物固定和 O2 和异氟烷输送。
氧气调节器，E型气瓶 VetEquip901305对于 O2 调控与递送
氧气管 – 绿色 VetEquip931503对于 O2 和异氟烷输送。
红外线灭菌器 800 ºCMarconiMA1201用于仪器灭菌。
<强>手术器械
精细剪刀 - ToughCut精细科学工具14058-11用于切口。
手术钩INJEX1636自制 - 用于清除手术部位的皮肤和毛发。
标准镊子或钳子--用于抓取皮肤。
<强>外科耗材
Vetbond3MSC-361931用于切口闭合。
水泥和催化剂套装（Duralay）依赖性2OZ用于植入物固定。
无菌棉签（已高压灭菌）JnJ75U用于手术部位的消毒。 
24孔板（组织培养板）SARSTEDT831,836用于水泥制备。
应用刷ParkellS286用于水泥混合与应用。
<强>药剂学
赛拉嗪（ANASEDAN 2%）Ceva Pharmaceutical（巴西）P10160用于麻醉诱导。
氯胺酮（DOPALEN 10%）Ceva Pharmaceutical（巴西）P30101用于麻醉诱导。
异氟烷（100%）克里斯特á中国台湾100 mL用于维持麻醉。
利多卡因（XYLESTESIN 5%）Cristal Pharma-用于术后护理。
酮洛芬（PROFENID 100 mg）赛诺菲安万特20 mL用于术后护理。
乳酸林格氏液SANOBIOL 实验室7898153652145用于术后护理。
托百士地塞米松（地塞米松 1 mg/g）Alcon631用于眼部润滑与保护。 
<强>刺激
动物经颅刺激器Soterix Medical2100适用于当前世代。
针型电极夹持器（圆柱形夹持器底座）Soterix Medical2100电极支撑架（植入物）
针型电极（Ag/AgCl）Soterix Medical2100用于电流传递（电极）。 
针型电极帽Soterix Medical2100用于植入物保护。
体表电极（镀银/氯化银）Soterix Medical2100用于电流输送（电极）。 
生理盐水（0.9%）FarmaX7896902206441电流传递用导电介质
标准镊子或钳子--用于 tDCS 设置。
<强>实时聚合酶链式反应
伯乐CFX96实时系统BioRadC1000用于 qPCR
SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix（5 × 1 mL）伯乐（BioRad）1725271用于qPCR
硬壳 PCR 板 PCT COM 50 个/ CFX96伯乐（BioRad）HSP9601用于 qPCR
微密封 "B" 密封百分比 c/100BioRadMSB1001用于qPCR

参考文献

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