传统的土壤采样方法任意地确定土壤样本数量。本文提出一种简单而高效的聚类土壤采样设计，用于展示土壤空间异质性，并定量确定所需土壤样本数量及相关采样精度。
本文内容
摘要
摘要
土壤具有高度异质性。通常，土壤研究所需的样本数量往往是随意确定的，其相应的准确性未知。本文提供了一种在研究样地内进行高效且成簇土壤采样的详细方案，并基于采用该设计的预试验采样，展示土壤空间异质性特征，为后续研究提供合理的样本量及其对应准确性的依据。该方案主要包括四个步骤：采样设计、野外采集、土壤分析和地统计分析。分步操作流程根据以往文献进行了优化调整。本文将通过两个实例，展示在不同管理措施下土壤有机碳（SOC）和土壤微生物生物量碳（MBC）截然不同的空间分布格局。此外，我们提出了一种基于样地尺度变异系数（CV）来确定在特定准确度水平下的样本量需求（SSR）的策略。该野外采样方案及样本量的定量确定方法，将有助于研究人员根据研究目标和资源条件，制定切实可行的采样策略。
引言
土壤是高度异质性的生物材料1,2。土壤采样的目的是尽可能准确且经济地采集最具代表性的样品，以表征田块的养分状况。土壤的变异性来源于土壤的空间异质性以及量化过程的准确性。如果不考虑土壤的空间变异，即使土壤分析本身具有很高的准确性，典型的土壤采样也可能导致结果显著偏离土壤变量的真实均值3。对于异质性较强的研究样地，变异性往往比均值更为重要3；因此，能够准确测量变异性与均值的采样设计更受青睐。
当土壤的空间变异因土地管理措施而进一步改变时4,5,6，准确进行土壤采样将变得更加困难。然而，关键土壤变量（例如，SOC 和 MBC）存在较大变异的问题也日益突出7，这些变异会导致关键模型参数的约束效果不佳，而这些参数对于气候变化背景下长期全球土壤模型的预测至关重要8,9,10。由于用于表征田间变异性的土壤采样成本较高，因此亟需一种简单、可靠且高效的土壤采样策略。
在研究样地采集代表性土壤样本有多种不同方法，其优缺点总结于表1中。在传统的土壤取样（即简单随机取样）中，是在研究样地内随机采集几份至十余份土壤样本。具体而言，传统土壤取样设计中的样本数量始终由人为任意确定，相应的取样误差（即准确性）则未知。
| 抽样设计 | 优点 | 缺点 |
| 简单随机抽样 | 成本低、快速且经济、广泛应用、操作简便，在均质场地中效果最佳 | 准确性低且变异大，<5 个样本 |
| 系统抽样 | 准确性高且变异已知，在大范围异质场地中效果最佳 | 成本效益低，样本数量大 |
| 分层抽样 | 均值估计准确、操作相对简便，适用于成簇或分层区域 | 成本效益低，样本数量大（通常少于系统/网格抽样） |
| 混合样本法 | 成本低、均值估计准确、操作简便，在异质场地中效果最佳 | 田间变异未知，混合样本需>3 个样本 |
表1：土壤研究领域采用的主要土壤采样设计的优缺点。 该表格总结自 Tan et al.3、Jones12 和 Swenson et al.11
与简单随机抽样或混合取样相比，系统性和分层取样设计能够获得高精度的均值及其相应的变异性（表1）。然而，这类方法需要进行密集的土壤采样（例如，数百个样品）。尽管每试验小区采集的土壤样品数量越多，土壤测试水平的准确性及可信度就越高11，但大量采样的要求通常仅适用于大规模研究5,11；由于资源限制，绝大多数以田间小区为尺度的土壤研究项目难以承担如此高的采样量。因此，优选一种能够在不同方法之间权衡取舍的取样设计方案。
土壤采样设计的一个关键问题是，根据研究问题和野外条件，确定所需的土壤样本数量及其相应的准确度。例如，在受干扰较少的地点，即使减少土壤样本数量，仍可能达到相同的精确水平6，这表明在进行土壤采样之前，有必要明确量化空间异质性（即土壤变异性特征及其分布情况）3。事实上，大多数土壤采样设计并未推荐进行此类预试验采样。野外科研人员在设计实验时，常常未能认识到估算统计功效的重要性。
为提高土壤采样的实验严谨性，本研究介绍了一种简单且高效的采样方法。该新设计不仅能够准确表征土壤养分水平及其变异性，还能通过考虑土壤的空间异质性，为未来研究中土壤样本数量及相应采样精度提供定量依据。新的土壤采样设计将有助于研究人员确定符合其采样和研究需求的最佳策略。该方法的总体目标是为土壤生物地球化学和生态学研究人员提供一种定量且可操作的方法，以优化野外研究中的土壤采样策略。
方案
1. 样地中的群集抽样设计
- 在研究样地内确定取样区域。确定边长相等的方形网格数量（即, 图1; 图3根据研究样地的大小和形状，预期设置6到10个方形网格，以确保每个样地内的土壤样品总数控制在30个以下（见步骤1.3）。
- 标记每个方格的中心即，质心）并创建一个直径等于方形网格边长的圆形采样区域。
- 闭眼站立在圆形区域的中心点，随机朝某一方向和距离投掷一块小石头（或其他有重量的物体）。
- 如果石块落在圆形区域外，则需重新投掷，直至确定第一个采样位置。
- 重复步骤1.3，直至在圆形区域内获得三个随机采样位置。
- 在三个采样位置放置标志旗，并对每面旗帜进行编号即1、2 和 3。
- 重复步骤1.3至1.5，覆盖所有其他圆形采样区域，直至所有采样位置均被确定并按顺序编号（即, 4, 5, 6, 等等。).
2. 样地中的距离测量与土壤采集
- 选择一个角落点，并将其确定为样地内采样区域的原点。
- 测量每个标记位置相对于原点的水平和垂直距离，并在野外记录本中将其记录为 x 和 y 坐标。
- 使用土壤钻取器从每个标记位置采集土壤样本（0 - 15 cm），并根据标记编号对样品袋进行标记。重复此步骤，直至完成所有标记位置的土壤样本采集。
- 为尽量减少采样过程的影响（例如，在样地内踩踏植物和土壤），确保装有土壤样品的袋子在采集结束前始终与其对应的标记放置在一起，最后再统一收集所有袋子。
- 将土壤样品置于冷藏箱中运送到实验室，并在同一天内对每个土壤样本进行处理。
- 从每个土芯中去除根系，通过2 mm土壤筛进行过筛，并在分析前将每个土芯样品充分混匀。
- 通过将子样品在105 °C下烘干24 h测定每个样品的土壤含水量，并将风干后的子样品研磨成细粉，使用元素分析仪进行总碳（C）分析4。土壤有机碳（SOC）根据含水量和碳含量计算得出。
- 称取新鲜土壤子样品（每份10 g），采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法和过硫酸钾消解法测定土壤微生物生物量碳（MBC）5。
- 根据样地中的标记编号，将土壤有机碳（SOC）和微生物生物量碳（MBC）数据集与 x 和 y 坐标进行整合。
3. 样地中的描述性与地统计学分析
- 针对 SOC 和 MBC 的每个变量，计算其最小值、最大值、平均值、中位数和标准差，以及变异系数（CV）。
- 对每个变量进行一系列地理空间分析（即趋势面分析、自相关分析和克里金插值图），以描述其主要表面格局、细尺度变异性和空间分布。地统计分析方法的详细信息可参见以往出版物4,5。
4. 样地内SSR及其相关采样准确性的探究
- 根据交叉验证（CV）结果绘制 SSR 与相对误差（γ）的关系图。在每个图中，经对数转换的 SSR 与相对误差（γ）呈负线性关系（见公式 1 - 3）。根据该关系（公式 3），可确定达到指定精度所需的样本数量：
其中，CI、
、s、n、N、CV 分别表示置信区间、样地均值、样地标准差、样本数、变异系数和相对误差；t0.975 = 1.96。经对数转换的样本量需求（N）与经对数转换的相对误差（γ）呈负线性关系（即，斜率为 -2）。 - 在后续样地取样中，应用上述关系，通过在给定精度（例如，相对误差 [γ]）下计算公式 3 中的 N 来确定所需样本量。或者，对于已采集的特定数量的土壤样本，可利用该关系推导出相应的精度水平。
结果
上述方法已应用于两项案例研究，一项在美国南部的农村地区，另一项在田纳西州中部。
在中国台湾南部皮德蒙特地区的乡村，选择了三种土地利用类型，包括：1）未开垦的橡树-山核桃硬木林，2）采用常规耕作和每年施肥以种植小麦、高粱和玉米的耕地，以及3）自最后一次耕作以来已有约50年历史的旧田松林。4. 每种土地利用类型中均选取三个独立重复的30 x 30 m样地。在每个样地内采用集簇式土壤采样设计（图1）。每个圆形区域从各自的中心点起算，半径距离为5 m。从每块样地采集27个土芯，每种土地利用方式共采集81个土芯，总计采集243个土芯。土壤有机碳（SOC）含量使用CHN分析仪测定。主要发现为，耕地显著均质化了土壤有机碳及其他变量的空间异质性。4. 不同土地利用方式下的土壤呼吸速率（SSR）存在差异，总体呈上升趋势，顺序为弃耕地森林 > 再生松林 > 耕地图2）。例外情况是，一个硬木林样地的物种丰富度（SSR）与农田样地相当，而一个松林样地的物种丰富度（SSR）则与硬木林样地相当。图2以 γ = 0.1（即10%）为例，SSR 在耕地中为 4、10 和 30，在松林中为 80、85 和 300，在硬木林中为 25、200 和 350。若所有样地仅采集三个土壤样品，相对误差将约为 10%–30%（耕地）、约 50%–80%（松林）以及约 28%–100%（硬木林）。
图1：美国南卡罗来纳州卡尔霍恩实验林一块30 × 30 m研究样地内采用的聚类随机抽样设计示意图4。 实心圆点表示质心（n = 9）。大虚线圆表示围绕一个质心的抽样区域（半径 = 5 m）。叉号（X）表示从质心出发通过随机选择方向和距离确定的采样点位置。本图经Li et al.4修改。 请点击此处查看此图的高清版本。
图2：硬木林、松树林和耕作农田土壤有机碳（SOC）的样本量需求（SSR）与相对误差（γ）关系图。 两个坐标轴均采用对数刻度。虚线代表耕作土壤，灰色实线代表松树林土壤，深色实线代表硬木林土壤。每种土地利用类型对应的三条不同线条代表三个重复样地。本图经Li et al.4 修改而来 请点击此处查看此图的放大版本。
2011年，在美国田纳西州纳什维尔市的田纳西州立大学（TSU）主校区农业研究与推广中心（AREC）（36.12° N，36.98° W，海拔127.6 m），开展了一项柳枝稷田间试验，采用随机区组设计设置了三种氮（N）施肥处理5。作物为东部“阿拉莫”柳枝稷（Panicum virgatum L.）的“海兰德”（Highlander）品种。三种氮处理分别为：无氮肥输入（NN）、低氮肥输入（LN：84 kg N ha⁻¹，以尿素形式施用）和高氮肥输入（HN：168 kg N ha⁻¹，以尿素形式施用）。在每个小区内划定一个2.75 × 5.5 m的矩形区域，并进一步划分为八个1.375 × 1.375 m的正方形网格。在每个圆形区域内确定其中心点，并从中心点出发，沿随机方向和距离采集三个土芯（图3）。每个12个小区共采集24个土芯，总计获得288个土壤样品。各土芯中的微生物生物量碳（MBC）采用氯仿熏蒸-K₂SO₄浸提法和过硫酸钾氧化法进行定量。主要研究结果表明，氮肥施用总体上增强了柳枝稷农田中MBC的空间异质性。施肥处理下的空间自相关范围（SSR）普遍更大（图4）。唯一例外是，某一HN小区的SSR低于NN小区（图4）。以γ = 0.1（即10%）为例，两个重复NN小区的SSR分别为10和20，LN小区为30和50，HN小区为15和70。若所有小区仅采集三个土壤样品，则相对误差将约为20%–25%（NN）、约26%–35%（LN）以及约20%–40%（硬木林）。
图3：在美国田纳西州纳什维尔市田纳西州立大学（TSU）农业研究中心的施肥试验地内，一个 2.75 m × 5.5 m 样地中的聚类随机采样设计示意图。 实心圆点表示各子区域的质心（n = 8），每个样地包含八个质心，分布于四个正方形网格（每个网格 1.375 m × 1.375 m）中。在每个子样地内，划定一个圆形区域用于土壤采样。X 符号表示从每个圆形采样区域（虚线圆）内的质心出发，通过随机方向和距离确定的采样点位置。本图改编自 Li et al.5 请点击此处查看此图的高清版本。
图4：三种施肥处理下MBC的样本量需求（SSR）与相对误差（γ）关系图。两个坐标轴均采用对数尺度。虚线代表农田土壤，灰色实线代表松林土壤，深色实线代表硬木林土壤。NN = 无氮肥输入；LN = 低氮肥输入；HN = 高氮肥输入。每种土地利用方式对应的两条线代表两个重复样地。本图经修改自 Li et al.5。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
传统的土壤采样方法缺乏定量依据，导致准确性未知，而更先进的采样策略则需要大量采集土壤样本，使得在田间小区尺度上的大多数土壤研究难以承担其成本。一种简单、高效且可靠的采样设计应能有效平衡上述两种方法，并更重要的是，为在特定准确度下确定所需样本数量提供定量依据，以满足未来的采样需求。然而，目前仍缺乏此类采样设计。本文提出了一种通过操控聚类采样程序来量化土壤空间异质性的方法，并基于该设计，指导在特定准确度下未来采样所需的土壤样本数量。本方案包含两个关键步骤。第一步是确定采样区域并在给定的小区范围内划定采样区。由于不同研究中实验小区的具体尺寸和形状可能各异，代表采样区的方形网格数量与边长应根据小区特征进行调整，以尽可能覆盖整个小区面积。通常情况下，方形网格数量应控制在8至10个之间，以便在单个小区内采集24至30个土壤样本。这种较低强度的采样要求对于小区的初步研究而言是可接受的。第二步是确定在特定准确度下所需的样本数量。尽管可根据初步采样策略推导出在目标准确度下的土壤样本数量，但仍需综合考虑其他可用资源（例如、人力、成本和人员）。如果达到理想精度所需的土壤样本数量超出了可承受范围，则应降低理想精度，以便重新计算所需土壤样本数量。应反复进行重新计算，直至在理想精度与可用资源之间达到最佳平衡。
该方案可根据研究样地的具体形状、面积和位置进行简便调整。即使在不规则样地或面积过大或过小的样地内，也可通过调节方形网格的大小，使其覆盖大部分样地面积来完成操作。另一方面，当土壤样品采集自样地内圆形取样区域之外时，这些样品仍可纳入描述性统计和地统计分析中。该方案在这一方面的灵活性具有优势，因此可降低取样成本。
该方法的一个重要局限性在于，达到特定准确度所需的土壤样品数量取决于预试验土壤采样中由24至30个土壤样品所确定的样地水平变异系数（CV）。对于高度异质的样地，使用30个或更少的样品所得到的CV可能大于使用更多样品（> 30）所得到的CV。因此，为达到相同准确度所计算出的土壤样品数量会偏大，即在该样地中，相同准确度所需的土壤样品数量会被高估。而对于高度均质的样地，较少数量的样品即可产生与30个样品相近的样地水平CV，从而导致对资源需求的高估。因此，对于这些极端异质或均质的样地，预试验采样设计中建议的土壤样品数量（i.e.，30个或更少）可能在预试验采样阶段或后续采样中造成不必要的投入。
我们展示了成组土壤采样策略的显著优势。该方法提供了一种可靠且经济的土壤采样方案，可用于获取土壤空间异质性信息，并能够定量推导出达到特定期望精度所需的土壤样本数量。尽管密集条带采样或分层采样可能更准确地描述空间变异，但其采样成本对于大多数土壤研究而言过高。传统的采样方法具有任意性，缺乏采样精度的定量依据。本方案由于采样强度较低、田间操作简便、能够利用严格的地统计分析方法揭示空间分布模式，并可根据任意设定的精度要求定量确定样本量，因而更具优越性。了解实现特定采样精度所需的样本量，将有助于研究人员合理规划其在土壤采样工作中的投入。
采用高效的成组抽样方法可对土壤空间异质性进行严谨检验，并提升科研人员准确开展土壤采样的能力。这种土壤采样策略具有较低的强度和定量化的特性，有助于其在土壤研究领域得到广泛应用。鉴于在全球快速变化背景下，土壤空间异质性可能发生改变，为达到相同采样精度，在研究样地内所需的土壤样本数量可能随时间而变化。初步采样设计中建议的样本数量可能因不同土壤类型和生态系统而异。未来可能由此发展出的应用包括确定特定土壤或生态系统所需的样本数量。因此，有必要在多种土壤类型和生态系统中进一步开展该方法的应用与验证方面的实证研究。长期且广泛的应用可能有助于确定特定生态系统的通用样本量需求，从而为土壤研究人员提供推荐依据。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了美国农业部Evans-Allen基金（编号1005761）的资助。作者感谢田纳西州纳什维尔市田纳西州立大学主校区农业研究中心（AREC）工作人员提供的协助。Maggie Syversen 对论文初稿进行了审阅并提出意见。作者感谢匿名审稿人所提出的建设性评论与建议。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 土壤取样钻 | AMS | 350.05 | 用于土壤采集 |
| 螺丝刀 | Fisher Scientific | 19-313-447 | 用于土壤采集 |
| 绳索 | Fisher Scientific | 19-313-429 | 用于划定采样区域 |
| FatMax 35 英尺卷尺 | Home Depot | #215880 | 用于测量距离 |
| 标记旗 | Fisher Scientific | S99537 | 用于标记采样位置 |
| 塑料拉链密封储存袋 | Fisher Scientific | 09-800-16 | 用于土壤采集 |
| Sharpie 记号笔 | Fisher Scientific | 50-111-3135 | 用于土壤采集 |
| 标记铅笔 | Fisher Scientific | 50-294-45 | 用于野外数据记录 |
| 实验记录本 | Fisher Scientific | 11-903 | 用于野外数据记录 |
| ArcGis 10.3 | ESRI | 用于生成克里金插值图 | |
| 筛子 | Fisher Scientific | 04-881G | 用于筛分土壤样品 |
参考文献
- Young, I. M., Crawford, J. W. Interactions and Self-Organization in the Soil-Microbe Complex. Science. 304 (5677), 1634-1637 (2004).
- Masoom, H., et al. Soil Organic Matter in Its Native State: Unravelling the Most Complex Biomaterial on Earth. Environmental Science and Technology. 50 (4), 1670-1680 (2016).
- Tan, K. Soil Sampling, Preparation, and Analysis. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2005).
- Li, J. W., Richter, D. D., Mendoza, A., Heine, P. Effects of land-use history on soil spatial heterogeneity of macro- and trace elements in the Southern Piedmont USA. Geoderma. 156 (1-2), 60-73 (2010).
- Li, J., et al. Nitrogen Fertilization Elevated Spatial Heterogeneity of Soil Microbial Biomass Carbon and Nitrogen in Switchgrass and Gamagrass Croplands. Scientific Reports. 8 (1), 1734(2018).
- Chung, C. K., Chong, S. K., Varsa, E. C. Sampling Strategies for Fertility on a Stoy Silt Loam Soil. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 26 (5-6), 741-763 (1995).
- Luo, Y. Q., et al. Toward more realistic projections of soil carbon dynamics by Earth system models. Global Biogeochemical Cycles. 30 (1), 40-56 (2016).
- Li, J., Wang, G., Allison, S., Mayes, M., Luo, Y. Soil carbon sensitivity to temperature and carbon use efficiency compared across microbial-ecosystem models of varying complexity. Biogeochemistry. 119 (1-3), 67-84 (2014).
- Conant, R. T., Ogle, S. M., Paul, E. A., Paustian, K. Measuring and monitoring soil organic carbon stocks in agricultural lands for climate mitigation. Frontiers in Ecology and the Environment. 9 (3), 169-173 (2011).
- Wieder, W. R., Bonan, G. B., Allison, S. D. Global soil carbon projections are improved by modelling microbial processes. Nature Climate Change. 3 (10), 909-912 (2013).
- Swenson, L. J., Dahnke, W. C., Patterson, D. D. Sampling for Soil Testing. , North Dakota State University, Department of Soil Sciences. Research Report 8 (1984).
- Jones, J. Laboratory Guide for Conducting Soil Tests and Plant Analysis. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2001).
重印与许可
