使用蚂蚁Vollenhovia emeryi进行近交系杂交的诱导与评估

摘要

本方案描述了针对蚂蚁Vollenhovia emeryi进行近交杂交以及评估杂交成功率的方法。这些方案对于研究膜翅目昆虫性别决定系统的遗传基础具有重要意义。

摘要

蜜蜂（Apis mellifera）作为一种膜翅目模式生物，其性别决定级联中的遗传与分子组分已被广泛研究。然而，对于其他非模式膜翅目类群（如蚂蚁）中的性别决定机制，目前所知甚少。由于膜翅目物种演化出了复杂的生活周期，在实验室中维持这些生物并进行实验性杂交十分困难。本文介绍了在蚂蚁Vollenhovia emeryi中实施近交杂交及评估杂交成功与否的方法。V. emeryi具有独特的生物学特性，使其在实验室中诱导近交相对简便。具体而言，该物种产生雄核发育的雄性个体，且雌性繁殖个体表现出翅多型性，这有助于遗传杂交中表型的识别。此外，近交成功的评估也较为直接：通过近交杂交可持续产生雄性个体，而在自然环境中，正常雄性仅出现在明确的繁殖季节。本实验方案使得V. emeryi可作为研究蚂蚁物种性别决定系统遗传与分子基础的模型。

引言

蚂蚁和蜜蜂等真社会性膜翅目类群进化出了单双倍体性别决定系统，其中在一个或多个互补性性别决定（CSD）位点为杂合的个体发育为雌性，而在这些位点为纯合或半合子的个体则发育为雄性（图1A）¹。

在蜜蜂（Apis mellifera）这一膜翅目模式生物中，参与性别决定级联过程的遗传与分子组分已被广泛研究^2,3,4。近期的比较基因组学研究表明，蚂蚁与蜜蜂在性别决定通路中共享许多假定的同源基因，例如初始性别决定基因csd⁵。然而，目前仍缺乏证据证明这些同源基因在蚂蚁中具有功能上的保守性。

为解决这一问题，需要培育近交系，因为近交系对于遗传定位和分子研究至关重要。然而，由于这些生物在进化过程中形成了复杂的生活周期，因此在实验室中维持其种群并进行实验性杂交十分困难。

本文以Vollenhovia emeryi为模型，研究蚂蚁性别决定系统的遗传与分子基础

方案

1. 实验室中 V. Emeryi 蚁群的野外采集与饲养维护

注意：巢穴的 V. emeryi 发现于日本各地次生林的腐烂树干和倒伏的腐朽树枝中。该物种表现出两种类型的群体， 即， （1）仅产生长翅蚁后的群体，以及（2）主要产生短翅蚁后并伴有少量长翅蚁后的群体^8,14在本方案中，我们采集了日本石川县的后一种类型的菌落。

1. 在初夏期间采集 V. emeryi 蚁群。
   注意：为在繁殖季节获得足够数量的生殖个体，建议选择个体数量超过 300 只的蚁群。
2. 使用吸虫器将采集枝条上的蚂蚁标本转移至带有玻璃盖的人工石膏巢穴中（图2，左图）。
3. 将蚁群置于人工巢穴中，在 25 °C 及 16:8 h 光照/黑暗循环条件下饲养。使用洗瓶提供自来水以保持石膏湿润。
   1. 每隔一天添加约 100 mg 用铝箔包裹的干燥蟋蟀粉，以及一个装有红糖水的 20 µL 吸头（tip），直至新一代生殖个体（F₁ 有翅雌蚁和 F₁ 雄蚁）出现。

结果

利用F₀和F₁代进行微卫星分析的结果表明，近交杂交已成功建立（图4）⁶。通过近交杂交，实验性杂交蜂群建立后一个月内即获得了交配后的蜂王。近交杂交产生的所有后代（F₂）中，有四分之一为雄性（27.1 ± 8.91% 标准差），其余为雌性（工蜂和蜂王）⁶。利用近交杂交后代进行QTL定位分析显示，由近交杂交产生的雄性为二倍体，并在两个CSD位点（CSD1和CSD2，见图5）上均为纯合状态，而由近交杂交产生的雌性（工蜂）则为二倍体，并且至少在一个CSD位点上为杂合状态⁶。

对单倍体雄性进行解剖，发现了精巢和精子，符合预期（

讨论

本文展示了可用于诱导蚂蚁V. emeryi近交杂交并评估其近交发生的实验方案。在实验中，对用于杂交的个体进行基因分型是必要的，以确保近交杂交成功。然而，这些杂交测试的有效性十分明显：双倍体雄性在全年均可产生，而单倍体雄性无论在野外还是实验室条件下都仅在秋季产生⁶。同胞交配的蚁后在交配后会立即开始产生雄性后代。V. emeryi的双倍体雄性与单倍体雄性之间未观察到形态学表型差异^6,7。然而，双倍体雄性V. emeryi几乎总是无法发育出睾丸。在缺乏用于检测杂交配对个体间遗传相关性的遗传标记时，可通过雄性后代的生殖潜力来推断是否发生了近交。但需要注意的是，在其他膜翅目物种中，近交杂交产生的雄性并不总是不育的^15,16,17.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
石膏粉	N/A	N/A	可使用任意品牌
活性炭粉	Wako	033-02117,037-02115
载玻片	N/A	N/A	可使用任意品牌
干燥蟋蟀饲料	N/A	N/A	可使用任意品牌
棕榈糖	N/A	N/A	可使用任意品牌
苯乙烯方形培养盒	AS ONE	任意尺寸	尺寸根据蚂蚁数量而定
培养箱			可使用任意品牌
铝块加热干浴器 Dry thermo unit DTU-1B	TAITEC	0014035-000
1.5 mL 超微量离心管，透明，圆底	WATSON	131-715CS
乙醇 (99.5%)	Wako	054-07225
体视显微镜	N/A	N/A	可使用任意品牌
镊子	DUMONT	0108-5-PO
Chelex 100 钠型树脂	SIGMA	11139-85-8
磷酸盐缓冲液 (PBS) 片剂，pH 7.4	TaKaRa	T9181
多聚甲醛	Wako	162-16065
-Cellstain- DAPI 溶液	Dojindo Molecular Technologies	D523
ABI 3100xl 基因分析仪	Applied Biosystems		请直接联系制造商以获取更多信息。
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