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方法文章

使用蚂蚁Vollenhovia emeryi进行近交系杂交的诱导与评估

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DOI：

10.3791/58521

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2018年10月5日

 , 
1Center for Bioscience Research and Education, Utsunomiya University

本文内容

摘要

本方案描述了针对蚂蚁Vollenhovia emeryi进行近交杂交以及评估杂交成功率的方法。这些方案对于研究膜翅目昆虫性别决定系统的遗传基础具有重要意义。

摘要

蜜蜂（Apis mellifera）作为一种膜翅目模式生物，其性别决定级联中的遗传与分子组分已被广泛研究。然而，对于其他非模式膜翅目类群（如蚂蚁）中的性别决定机制，目前所知甚少。由于膜翅目物种演化出了复杂的生活周期，在实验室中维持这些生物并进行实验性杂交十分困难。本文介绍了在蚂蚁Vollenhovia emeryi中进行近交杂交及评估杂交成功与否的方法。V. emeryi具有独特的生物学特性，使其在实验室中诱导近交相对简便。具体而言，该物种产生雄核发育的雄性个体，且雌性繁殖个体表现出翅多型性，这有助于遗传杂交中表型的识别。此外，近交成功的评估也较为直接：通过近交杂交可持续产生雄性个体，而在自然环境中，正常雄性仅出现在明确的繁殖季节。本实验方案使得V. emeryi可作为研究蚂蚁物种性别决定系统遗传与分子基础的模型。

引言

蚂蚁和蜜蜂等真社会性膜翅目分类群进化出了单双倍体性别决定系统，其中在一个或多个互补性性别决定（CSD）位点为杂合的个体发育为雌性，而在这些位点为纯合或半合子的个体则发育为雄性（图1A）1。

在蜜蜂（Apis mellifera）这一膜翅目模式生物中，参与性别决定级联过程的遗传与分子组分已被广泛研究2,3,4。近期的比较基因组学研究表明，蚂蚁与蜜蜂在性别决定通路中共享许多假定的同源基因，例如初始性别决定基因csd5。然而，目前仍缺乏关于这些同源基因在蚂蚁中功能保守性的实验证据。

为解决这一问题，需要培育近交系，因为近交系对于遗传定位和分子研究至关重要。然而，由于这些生物在进化过程中形成了复杂的生活周期，在实验室中维持这些品系并进行实验性杂交十分困难。

本文以Vollenhovia emeryi为模型，研究蚂蚁性别决定系统的遗传与分子基础6,7。此前已建立该物种的近交品系，首次在蚂蚁中对与性别决定相关的性状进行数量性状位点（QTL）连锁作图6。此外，其分子水平的性别决定级联机制也已被研究7。该物种进化出一种不寻常的繁殖系统，同时利用雌核发育和雄核发育（图1B）8,9。大多数新产生的蚁后和雄蚁分别通过母本基因组和父本基因组进行克隆繁殖。此外，工蚁及部分蚁后则通过有性生殖产生8。这种繁殖系统特别适用于遗传学研究，因为利用有性生殖产生的蚁后与雄蚁进行近交杂交，其遗传背景相当于经典的回交。由于有性生殖产生的蚁后在形态上不同于由母本基因组发育而来的蚁后10（图1B），因此使用该方法可大大简化近交杂交的实施与评估。

本文描述了在V. emeryi中建立用于杂交试验的实验室种群、利用全同胞配对进行近交杂交以及通过种群成员的基因分型和雄性子代生殖器解剖来评估杂交结果的方法。

无论采用何种繁殖系统，在研究膜翅目昆虫的性别决定系统时，近交杂交通常都是必不可少的第一步。例如，在小家蚁（Cardiocondyla obscurior）中，实验室条件下经过10代全同胞交配后几乎完全不出现二倍体雄性，表明其不存在互补性性别决定位点（CSD locus）11。通过近交杂交所产生的雄性比例，可以预测CSD位点的数量6,12,13。

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方案

1. 实验室中 V. Emeryi 蚁群的野外采集与饲养维护

注意：巢穴的 V. emeryi 发现于日本各地次生林的腐烂树干和倒伏的枯枝中。该物种表现出两种类型的群体， 即， （1）仅产生长翅蚁后的群体，以及（2）主要产生短翅蚁后并伴有少量长翅蚁后的群体8,14在本实验方案中，我们采集了日本石川县的后一种类型的菌落。

  1. 在初夏期间采集V. emeryi蚁群。
    注意：为了在繁殖季节获得足够数量的有性个体，建议选择个体数量超过300只的蚁群。
  2. 使用吸虫器将采集枝条上的蚂蚁标本转移至带有玻璃盖的人工石膏巢穴中（图2，左图）。
  3. 将蚁群维持在人工巢穴中，环境条件为25 °C，光照周期为16小时光照/8小时黑暗。使用洗瓶提供自来水以保持石膏湿润。
    1. 每隔一天添加约100 mg用铝箔包裹的干燥蟋蟀粉，以及一个装有褐色糖水的吸头（20 µL吸头），直至新的繁殖个体（F1有翅雌蚁和F1雄蚁）出现。

2. 实验室杂交实验

注意：新的繁殖个体从夏末至秋季开始出现（图3）。长翅蚁后通过有性生殖产生，短翅蚁后则通过无性克隆方式产生，并具有母本基因组（图1）。近交杂交实验应使用长翅蚁后和雄蚁。

  1. 为防止个体移动，将群体置于4 °C的恒温环境中静置15分钟。
  2. 在体视显微镜下使用镊子移除30只工蚁的中足，并将其转移至新的较小石膏巢穴中（图2，右），用于近交杂交。
    注意：去除足部是为了区分当前的工蚁与后续近交杂交所产生的新工蚁。
  3. 向含有工蚁的石膏巢穴中加入3-4只幼虫或蛹。
    注意：在无F0蚁后的群体中，工蚁会表现出探索行为。幼虫或蛹能有效吸引这些工蚁以及新的繁殖蚁在杂交实验期间聚集于巢穴中心。因此，应使实验群体的条件尽可能接近正常群体状态。
  4. 将一只长翅蚁后和一只雄蚁转移至步骤2.3中准备好的石膏巢穴中，进行近交杂交。
  5. 将群体在25 °C、16小时光照/8小时黑暗循环条件下饲养，按1.3节所述提供食物和水，直至蚁后脱翅并开始产卵。
    注意：此过程通常需要一周至一个月时间。
  6. 每天在体视显微镜下检查实验群体。在F1后代之间完成近交杂交后，可在体视显微镜下观察到卵。
  7. 当F1蚁后开始产卵后，从巢穴中移除步骤2.3中加入的F1雄蚁以及幼虫或蛹，以避免F1代（用于近交杂交的雄性和雌性）与F2代（近交杂交产生的后代）混淆。
    注意：若群体中雄蚁数量较少，可在同一实验群体中使用一只雄蚁与1至3只蚁后进行近交杂交。
  8. 继续按照1.3节所述条件饲养群体，直至F2后代羽化出现。
    注意：将F1蚁后与F2后代转移至新的较大石膏巢穴中（图2，左），用于长期群体维持。

3. 近交成功率的评估

  1. DNA 提取及亲代（F0）的基因分型
    1. 使用镊子取下一只 F0 蚁后的一条腿，并将该腿转移至含有 100 µL 螯合剂的 1.5 mL 微量离心管中。
    2. 在体视显微镜下，使用镊子于盛有 300 µL 超纯水的玻璃培养皿中解剖雌性腹部，并分离出含有来自交配雄性的精子的受精囊。
    3. 使用昆虫针剥离受精囊组织，并从中分离出雌性组织中的精子。
      注意：为便于从受精囊中提取精子，可在解剖前将雌性样本保存在 100% EtOH 中超过一天。
    4. 使用微量移液器将精子转移至含有 100 µL 螯合剂的 1.5 mL 微量离心管中。
    5. 将步骤 3.1.1 和 3.1.3 中分别制备的 F0 蚁后样本和精子样本在 95 °C 下孵育 20 分钟。短暂离心微量离心管后，于 4 °C 保存。
    6. 使用其他文献所述方法对所有样本进行基因分型4。
  2. 用于近交杂交（F1）的蚂蚁个体的 DNA 提取
    1. 在确认同胞交配产生的 F1 蚁后产卵后，使用其脱落的翅膀或一条中足提取蚁后的 DNA，并采用上述第 3.1 节所述相同方法进行基因分型。
    2. 使用一条腿提取 F1 雄蚁的 DNA，并采用上述第 3.1 节所述相同方法进行基因分型。
      注意：样本可在 DNA 提取前保存于 100% EtOH 中；含螯合剂的 DNA 样本可在 4 °C 下保存两个月。
  3. 近交杂交所产生雄蚁的雄性生育力评估
    注意：由近交杂交产生的二倍体雄蚁通常不育。
    1. 使用镊子在含有 400 µL PBS 溶液的玻璃培养皿中解剖雄性内部生殖器官。
    2. 移除 PBS，并使用微量移液器加入 4% 多聚甲醛（PFA）。
    3. 在室温（15 - 25 °C）下用 PFA 固定组织 30 分钟。
    4. 使用微量移液器用 400 µL PBS 洗涤组织 5 次。
    5. 将 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液用 PBS 稀释至 1 µg/mL。
    6. 移除 PBS，并向组织中加入约 300 µL 上述稀释后的 DAPI 染色液。
    7. 在室温（15 - 25 °C）避光条件下孵育 15 分钟。
    8. 用 400 µL PBS 洗涤组织 5 次，并使用镊子将组织转移至载玻片中央。
    9. 将组织置于含有四甲基罗丹明（TRITC）标记鬼笔环肽的封片剂中封片。
    10. 使用 20X 或 63X 物镜通过共聚焦激光扫描显微镜观察样本。
    11. DAPI 检测使用 405 nm 激发激光和 410–530 nm 范围的混合探测器。
    12. TRITC 检测使用 561 nm 激发激光和 565–650 nm 范围的混合探测器。
    13. 扫描速度设为 400 Hz（400 行/秒），分辨率为 1024 × 1024 像素。
    14. 使用软件平台采集图像。

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结果

利用F0和F1代进行的微卫星分析结果显示，近交杂交已成功建立（图4）6。通过近交杂交，实验性杂交蜂群建立后一个月内即获得了交配后的蜂王。近交杂交产生的所有后代（F2）中，有四分之一为雄性（27.1 ± 8.91% SD），其余为雌性（工蜂和蜂王）6。利用近交杂交后代进行的QTL定位分析表明，近交杂交产生的雄性为二倍体，并在两个CSD位点（CSD1和CSD2，见图5）上均为纯合状态，而由近交杂交产生的雌性（工蜂）则为二倍体，且至少在一个CSD位点上为杂合状态6。

解剖单倍体雄性个体后，如预期般观察到睾丸和精子

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讨论

本文展示了可用于诱导蚂蚁V. emeryi近交杂交并评估其近交发生的实验方案。在实验中，必须对用于杂交的个体进行基因分型，以确保近交杂交成功。然而，这些杂交测试的有效性十分明显：双倍体雄性全年均可产生，而单倍体雄性无论在野外还是实验室条件下都仅能在秋季产生6。同胞交配后的蚁后在杂交后立即开始产生雄性后代。V. emeryi的双倍体雄性与单倍体雄性之间未观察到形态学表型差异6,7。然而，双倍体雄性V. emeryi几乎总是无法发育出睾丸。在缺乏用于检测杂交配对个体间遗传相关性的遗传标记时，可通过雄性后代的繁殖潜力来推断是否发生了近交。但需要注意的是，在其他膜翅目物种中，近交杂交产生的雄性并不总是不育的15,16,17。<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢日本东京 AntRoom 的代表 Taku Shimada 先生提供他拍摄的 V. emeryi 繁殖个体照片。本项目由日本促进科学振兴会（JSPS）青年科学家研究奖学金（16J00011）以及青年科学家研究资助（B）（16K18626）提供资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
石膏粉N/AN/A可使用任意品牌
活性炭粉Wako033-02117,037-02115
载玻片N/AN/A可使用任意品牌
干燥蟋蟀饲料N/AN/A可使用任意品牌
棕糖 N/AN/A可使用任意品牌
苯乙烯方形培养盒AS ONE任意尺寸尺寸根据蚂蚁数量而定
培养箱可使用任意品牌
铝块恒温浴干式温控仪 DTU-1BTAITEC0014035-000
1.5 mL 超微量离心管，透明，圆底WATSON131-715CS
乙醇 (99.5%)Wako054-07225
体视显微镜N/AN/A可使用任意品牌
镊子DUMONT0108-5-PO
Chelex 100 钠型树脂SIGMA11139-85-8
磷酸盐缓冲液 (PBS) 片剂，pH 7.4TaKaRaT9181
多聚甲醛Wako162-16065
-Cellstain- DAPI 溶液Dojindo Molecular TechnologiesD523
ABI 3100xl 基因分析仪Applied Biosystems请直接联系制造商以获取更多信息。
共聚焦激光扫描显微镜 Leica TCS SP8Leica请直接联系制造商以获取更多信息。
HC PL APO CS2 20x/0.75 IMMLeica请直接联系制造商以获取更多信息。
HC PL APO CS2 63x/1.20 WATERLeica请直接联系制造商以获取更多信息。
Leica HyDTMLeica请直接联系制造商以获取更多信息。
Leica Application Suite X (LAS X)Leica请直接联系制造商以获取更多信息。

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