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方法文章

结合组织化学染色与图像分析定量甜樱桃冬季休眠期卵巢原基中的淀粉含量

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DOI：

10.3791/58524

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2019年3月20日

 , 
1Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza), Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón

通讯作者： Erica Fadon <efadona@cita-aragon.es>

本文内容

摘要

我们提出了一种利用图像分析系统结合组织化学技术，在冬季休眠期间定量测定甜樱桃（Prunus avium L.）子房原基中淀粉含量的方法。

摘要

小结构中淀粉的变化与植物多个发育过程中的关键事件相关，包括从授粉到受精的生殖阶段以及果实发育的起始。然而，由于难以对花原基等微小结构中的淀粉含量进行定量，花分化过程中淀粉的变化尚未完全明确。本文介绍了一种利用显微镜连接的图像分析系统对甜樱桃（Prunus avium L.）子房原基中淀粉含量进行定量的方法，该方法可将淀粉含量的变化与从秋季到春季休眠的不同阶段相关联。为此，通过将冬季不同时期采集的枝条转移至受控条件下观察其芽的生长情况，以确定花芽的休眠状态。为定量子房原基中的淀粉含量，依次采集花芽，固定，石蜡包埋，切片，并用I2KI（碘-碘化钾）染色。制片在显微镜下观察，并通过图像分析仪进行分析，该仪器可清晰区分淀粉与背景。通过测量对应于染色淀粉区域的图像光密度值来获得淀粉含量，将每个像素光密度的总和作为所研究视野中淀粉含量的估算值。

引言

温带木本多年生植物通过调节其生长和发育来适应季节变化。它们在春季和夏季生长发育，而在秋季停止生长，进入冬季休眠状态1。尽管休眠有助于它们在低温的冬季存活，但充分的低温积累是春季正常萌芽的前提条件2。休眠现象对温带果树生产和林业具有重要意义，因此人们已开展了多种研究，致力于确定和预测休眠期3。在果树物种中，目前常用的方法包括将枝条转移至促萌条件下的经验性实验，以及基于开花数据的统计预测，以确定休眠结束的日期，从而帮助研究人员估算每个品种所需的低温量。然而，如何基于生物学过程来判断休眠状态，目前仍不明确3。

温带果树（如甜樱桃（Prunus avium L.））每年开花一次，持续约两周。然而，花的分化和发育早在前一个夏季就已开始，提前约10个月4。花原基在秋季停止生长，并在冬季以休眠状态存在于芽内。在此期间，每个品种需要积累特定的低温需求量，以确保正常开花4。尽管冬季芽在形态上未发生明显变化，花原基在休眠期间仍具有生理活性，近期研究发现低温积累与胚珠原基细胞内淀粉的积累或减少动态密切相关，这为休眠状态的判定提供了新方法5。然而，由于胚珠原基体积微小且位置特殊，需要采用专门的研究方法。

淀粉是木本植物物种中主要的贮藏碳水化合物6。因此，淀粉含量的变化与花组织的生理活性密切相关，因为花组织需要碳水化合物来支持其发育7,8。在生殖过程中，多个关键事件也与不同花部结构中淀粉含量的变化有关，例如花药减数分裂9、花粉管在花柱中的生长或胚珠受精10。组织化学技术可在休眠期间检测花原基各个特定组织中的淀粉存在。然而，仍存在难以对淀粉进行定量的问题，从而无法追踪其随时间的积累或减少动态，也无法比较不同组织、品种或年份之间的淀粉含量。这主要是由于可用于分析技术的组织量极少11。作为一种替代方法，显微镜结合图像分析技术12能够对极少量的植物组织样品中的淀粉进行定量13。

结合显微镜与图像分析的方法已被用于定量植物组织中不同组分的含量，例如胼胝质14、微管15或淀粉16，其原理是测量特定染料染色区域的面积大小。对于淀粉，可通过碘化钾-碘（I2KI）反应进行简便检测17。该方法具有高度特异性；I2KI可插入淀粉颗粒的层状结构中，根据淀粉中直链淀粉的含量不同，呈现深蓝色或红棕色18。经I2KI染色的切片中，淀粉与背景组织之间具有足够的对比度，便于明确识别淀粉并利用图像分析系统进行后续定量19。尽管该染料并不遵循化学计量关系，但碘的积累量与淀粉分子的长度成正比，而淀粉分子长度可能存在较大差异17。因此，以像素数量表示的染色区域面积可能无法准确反映淀粉的实际含量，因为在染色区域面积相近的不同视野中，淀粉含量可能存在显著差异。作为替代方法，可通过显微镜获取的黑白图像中染色颗粒的光密度来评估淀粉含量，该方法已在杏8,13,19、牛油果10,20和橄榄21等多种组织中被报道使用。

本文介绍了一种将休眠状态的实验测定与从秋季到春季甜樱桃卵巢原基组织中淀粉含量的定量分析相结合的方法，为基于与休眠相关的生物学机制研究来理解与预测休眠提供了新工具。

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方案

1. 休眠状态的确定与植物材料的采集

  1. 在田间采集花芽。休眠研究属于长期实验，需要成年树木，其体型需足够大，以便在整个冬季采集花芽和枝条，同时不影响来年春季树木的正常生长发育。根据不同的树形管理方式，可能需要特殊的果园管理措施；因此，修剪程度可能比以果实生产为目的的修剪更轻。
    1. 从秋季开始至花芽萌动前，每周采集并称重10个花芽。
    2. 将花芽放入带盖的10 mL玻璃管中，加入乙醇/冰醋酸（3:1）固定液，在4 °C下固定至少24小时。随后弃去固定液，加入75%乙醇，确保液体充分覆盖样品。样品可在4 °C条件下保存于该溶液中，直至后续使用。
      注意：可采用真空浸入法去除花芽内部的气泡，防止其漂浮。这有助于固定液更好地渗透组织，但可能损伤组织结构。若非必要，应尽量避免使用此方法。
  2. 在田间采集枝条。
    1. 从秋季开始至花芽萌动前，每周采集三根长度为15–30 cm、直径约5 mm的枝条，每根枝条至少包含10个花芽。将枝条插入吸水后的花艺泡沫中，置于生长室中，培养条件为22 ± 1 °C，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。
    2. 在生长室中培养10天后，从枝条上采摘并称重10个花芽。
  3. 评估花芽生长情况并确定休眠状态。采样时间应根据当地环境条件进行调整。在果园实际条件下（西班牙萨拉戈萨，北纬41°44′30″，西经0°47′00″，海拔220米），枝条采样时间为11月30日至次年2月底或3月初。
    1. 从秋季开始至春季花芽萌发期间，每周通过比较从田间采集的10个花芽的重量变化，评估花芽对生长室适宜生长条件的响应情况。
    2. 若花芽重量无明显变化，或变化幅度小于30%，则认为花芽尚未满足需冷量，处于内休眠状态22；若重量变化幅度超过30%，则认为花芽已满足需冷量，进入外休眠状态22。

2. 淀粉定量分析的植物材料准备

  1. 从每个采样日期选取约六个固定好的芽（参见步骤 1.1）。根据品种不同，每个甜樱桃花芽可包含多达五个花原基。
    1. 去除外部芽鳞，并将芽置于含有 75% 乙醇的手表匠玻璃片上，以防止其干燥。
    2. 在体视显微镜下，使用精密镊子和眼科手术刀解剖芽体，每个芽至少取出一个花原基。花原基可保存在装有 75% 乙醇的 10 mL 玻璃管中，于 4 °C 条件下保存，或立即进入下一步操作。
  2. 用叔丁醇系列对样品进行脱水处理。
    1. 将 75% 乙醇溶液替换为 10 mL 的 75% 叔丁醇（TBA），确保完全覆盖样品，并在 30 °C 的干燥箱中孵育 1.5 小时。可使用巴斯德移液管来弃去溶液。
    2. 重复步骤 2.2.1，依次加入浓度递增的 TBA 溶液（85%、95% 和 100%，v/v），并在 30 °C 带排气功能的干燥箱中进行，最后用纯 TBA 洗涤三次。由于纯 TBA 在室温（< 20 °C）下会结晶，且具有高挥发性和毒性，因此必须在干燥箱中操作。若 TBA 在样品上结晶，将导致组织损伤。
  3. 将样品包埋于石蜡中18。
    1. 前一日将石蜡珠放入 60 °C 带排气功能的干燥箱中使其熔化。也可在加热板上熔化石蜡珠，但需确保液态石蜡温度为 60 °C，不得更高，以免损伤组织。
    2. 用 TBA 与石蜡油的混合液（1:1）替换 TBA，于 60 °C 干燥箱中孵育 24 小时。随后，用纯熔化石蜡替换 TBA 与石蜡油的混合液，于 60 °C 干燥箱中孵育至少 6 小时。重复此步骤两次，最后一次更换后孵育至少 4–6 天。
    3. 将每个样品置于加热表面上的小金属模具中，包埋于石蜡中，并放置包埋盒。然后将其置于冷表面上，待石蜡完全凝固后取出蜡块。
  4. 切片并复水处理。
    1. 配制 Haupt 胶：将 1 g 普通 Knox 明胶溶于 100 mL 蒸馏水中（30 °C）；然后加入 2 g 苯酚晶体（C6H5OH）和 15 mL 甘油。用刷子将 Haupt 胶均匀涂布于载玻片上，并滴加一滴 1% 甲醛溶液。
    2. 使用旋转式切片机将每个石蜡块切成 10 µm 厚的切片，并将切片转移至涂有 Haupt 胶的载玻片上。
    3. 将带有切片的载玻片置于 35–40 °C 的加热表面上直至干燥；然后将载玻片转移至玻片架中。
    4. 准备脱蜡和复水溶液。在三个玻璃染色缸中各加入 200 mL Histoclear II，另取一个缸加入 Histoclear II:乙醇（1:1, v/v），再准备一系列乙醇溶液（100%、70%、40%, v/v），最后准备蒸馏水冲洗液。
    5. 用 Histoclear II 及 Histoclear II:乙醇（1:1, v/v）分别洗涤三次，每次 5 分钟，进行脱蜡处理。将玻片架放入玻璃染色缸中，确保溶液完全覆盖载玻片，然后依次将玻片架转移至下一溶液中。
    6. 按以下顺序进行 2 分钟的复水洗涤：乙醇系列（100%、70%、40%, v/v），最后用蒸馏水冲洗。最后在室温下将载玻片干燥。
  5. 染色处理18。
    1. 配制 I2KI 染液：将 2 g 碘化钾（KI）和 0.2 g 碘（I2）溶于 100 mL 蒸馏水中。在切片上滴加新鲜 I2KI 染液，染色 5 分钟，然后用吸水纸吸去多余染液。立即进入下一步操作。
    2. 滴加少量合成封片介质，盖上盖玻片并用力压平。待封片介质干燥后，在明场显微镜下观察，初步评估子房淀粉情况。
      注：此步骤非必需，但可获得淀粉与背景之间更好的对比度。若需在淀粉定量后重复使用切片进行其他染色，可在染液滴上盖玻片，并用吸水纸吸去多余染液（参见 2.5.1）。淀粉定量完成后，用蒸馏水洗去 I2KI 染液，并将切片置于 35–40 °C 加热表面上干燥。

3. 淀粉含量的定量

  1. 校准光学条件。
    注意：图像分析仪用于检测染色淀粉的灵敏度水平直接受显微镜的光照条件和放大倍数影响；因此，所有待评估样品的检测条件应保持一致。请根据所用显微镜及光照条件，调整此处建议的参数设置。
    1. 在20倍放大倍数下调节孔径光阑以及亮度控制或光强。
    2. 确保滤光片架上没有安装任何滤光片，并在显微镜中选择明场条件。选择合适的放大倍数（例如，甜樱桃子房原基使用40倍物镜。
  2. 控制图像采集条件。使用无组织的染色样本调整相机设置 通过 图像 | 采集 | 预览.
    1. 将亮度固定在50%，增益设为1.0x，伽马值设为1.00，对比度设为0 - 100，使直方图指示器与亮度分布直方图的范围对齐。
    2. 启用过曝/欠曝功能，并将曝光时间调整至过曝的临界限度。
    3. 对整幅图像应用白平衡功能，以消除图像中所有中性色成分的色偏，并对整幅图像进行阴影校正，从而获得一幅经过校正且均匀的图像。
  3. 校准图像分析系统，以获得由透射率（T）值得到的不同光密度（OD）对应的灰度级控制值（0，黑色；255，白色）。
    1. 获取一张无组织的染色样本图像（作为空白对照），并测量该黑白图像的灰度值 通过 测量 | 灰度测量 | 校准灰度 | 参考值 = 0 | 测量 | 校准 | 确定这对应于100%透光率；因此，根据公式OD = 2 - log T，其光密度为0。
    2. 使用4N滤光片获取同一标本的图像，该滤光片可将光强减弱4倍，然后测量黑白图像的灰度值 通过 测量 | 灰度测量 | 校准灰度 | 参考值 = 0.6 | 测量 | 校准 | 确定这相当于25%的透光率；因此，根据公式OD = 2 - log T，其光密度为0.6。
    3. 获取同一标本在无光照条件下的图像（视为黑场），并测量该黑白图像的灰度值 通过 测量 | 灰度测量 | 校准灰度 | 参考值 = 1 | 测量 | 校准 | 确定这对应于0%的透光率；因此，根据公式OD = 2 - log T，其光密度为1。
  4. 检测淀粉。
    1. 以不低于300 dpi的分辨率，获取待测区域的TIFF格式彩色图像。
    2. 创建与染色区域对应的二值图像。调整三个颜色阈值（每个值在 0 - 255 之间），直至二值图像精确反映所观察到的染色淀粉颗粒。 通过 图像 | 检测 | 选择红色、蓝色和绿色的阈值 | 确定在不同制备样本和组织中反复进行视觉比较，以优化最终检测水平。将这些优化后的检测水平保存并应用于所有制备样本。
    3. 定量淀粉。使用图像分析系统将原始彩色图像转换为黑白图像。将二值图像用作叠加在黑白图像上的掩模。 通过 图像 | 二值编辑测量掩膜下每个像素的光密度总和 通过 测量 | 灰度值 | 确定 并将该值视为所测区域的淀粉含量。
    4. 在卵巢原基的四个位置重复步骤 3.4.1 - 3.4.3，以获得花原基卵巢中淀粉含量的代表性数值。
    5. 在每次采集日期的不同花朵中重复步骤 3.4.1 - 3.4.3 和步骤 3.4.5。

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结果

休眠研究需要确定满足需冷量的关键时刻。尽管在田间条件下冬季无明显的物候变化（图1A），樱桃树只有经过一定时期的低温后，才能在适宜条件下恢复生长能力。在冬季定期将枝条转移至人工气候室（图1B），可评估花芽的休眠状态。通过测量花芽重量的增加来评价其生长情况。休眠期间，在适宜条件下培养10天后仍无明显变化（图1C）；而一旦打破休眠，花芽则在生长室中明显膨大并萌发（图1D）。该分析结果可用于判断花芽的休眠状态。由于不同年份冬季温度存在差异，休眠解除的时间也有所不同。在研究的第一年，休眠于1月被打破；而第二年冬季较温暖，因此需冷量的满足时间推迟了约三周，发生在2月。

甜樱桃的花芽着生在短果枝上，其顶端芽为叶芽，而侧芽为花芽（<...

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讨论

在气候变化背景下，木本多年生植物的休眠现象对果树生产和林业具有重要意义，但休眠背后的生物学过程仍不明确。休眠研究可从不同角度开展，近年来寻找冬季休眠生物学标记的研究尤为深入。然而，大多数试图找到能够明确指示芽体何时解除休眠的指标均未成功3。本文所述方法结合组织化学技术18与图像分析，对研究特定组织中碳水化合物储备与其生理活性之间的关系非常有效，已应用于甜樱桃芽在不同休眠阶段的研究5，并可推广至其他物种和其他组织10,13,20。

以淀粉形式存在的碳水化合物储备在花的发育和生殖过程中7,10,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者衷心感谢 Maria Herrero 和 Eliseo Rivas 提供的有益讨论与建议。本工作由西班牙经济与竞争力部—欧洲区域发展基金、欧盟[资助号 BES-2010-037992，授予 E. F.]；国家农业与食品技术研究所[资助号 RFP2015-00015-00、RTA2014-00085-00、RTA2017-00003-00]；以及阿拉贡自治区政府—欧洲社会基金、欧盟[Grupo Consolidado A12-17R]资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
精密天平SartoriusCP225D
体视显微镜Leica MicrosystemsMZ-16
干燥箱MemmertU15
石蜡包埋仪Leica MicrosystemsEG1140H
旋转式切片机Reichert-Jung1130/Biocut
切片机刀片FeatherS35不锈钢
明场显微镜Leica MicrosystemsDM2500
数码相机Leica MicrosystemsDC-300
图像分析系统Leica MicrosystemsQuantiment Q550

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