我们介绍了一种在两种不同培养基中培养多种Magnetospirillum菌株的方法。Magnetospirillum gryphiswaldense菌株MSR-1在液体培养基和O2浓度梯度半固体培养基中均进行培养，而M. magneticum菌株AMB-1和M. magnetotacticum菌株MS-1则在液体培养基中培养。
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摘要
摘要
趋磁细菌是一类革兰氏阴性、可运动的原核生物，主要存在于淡水和海洋环境中，广泛分布于各类水生生境。其特征在于能够生物矿化合成磁小体，即纳米级大小的磁铁矿（Fe₃O₄）磁性晶体3O4) 或硫铁矿（Fe3S4）被脂质双层膜包围，位于其细胞质内。对于大多数已知的趋磁细菌而言，磁小体在细胞质内组装成链状结构，从而使细胞具有永久的磁偶极矩，并被动地沿外部磁场方向排列。由于这些独特特性，趋磁细菌在商业和医学应用方面具有巨大潜力。然而，大多数趋磁细菌为微需氧菌，对氧气具有特定的需求2 浓度要求较高，使它们比许多其他细菌（如）更难以常规培养 大肠杆菌. 本文提供了三种最常被研究的趋磁细菌菌株的详细培养方案，这些菌株均属于磁螺菌属 Magnetospirillum这些方法能够精确控制 O2 提供给细菌的浓度，以确保其正常生长并合成磁小体。采用这些方法培养趋磁细菌以供进一步研究时，实验人员无需具备微生物学方面的专业知识。本文介绍的通用方法也可用于分离和培养其他趋磁细菌，但可能需要对培养基的化学成分进行适当调整。
引言
趋磁细菌（MTB）是一类广泛存在的革兰氏阴性原核生物，普遍分布于淡水和海洋水生环境中1。这些细菌具有合成磁性晶体的能力，晶体成分为磁铁矿（Fe3O4）或硫铁矿（Fe3S4），且大多数情况下在细胞内组装成链状结构。这种特殊的结构模式源于多种特异性蛋白质的作用，这些蛋白质既存在于细菌的细胞质中，也位于包裹每个晶体的脂质膜上2。每个单独的晶体及其周围的膜囊泡称为磁小体，在Magnetospirillum物种中，其大小约为30至50 nm3。由于磁小体呈链状排列，这些细菌具有永久的磁偶极矩，使其能够被动地与外加磁场方向对齐。因此，这些细菌可主动沿磁力线游动，如同自驱动的微型指南针，可能有助于更有效地寻找最适合其生长的环境条件（例如，O2浓度）。
趋磁细菌（MTB）的一个有趣特性是能够调控其磁小体晶体的化学组成和晶体结构。大多数菌株产生相对高纯度的磁铁矿或胶黄铁矿晶体，尽管有些菌株能够生物矿化两种矿物4。在所有情况下，这些细菌均能精确控制其单磁畴晶体的大小和形状。这解释了为何大量研究致力于深入理解MTB如何实现这一生物矿化过程。理解该过程可能使研究人员能够定制化设计用于多种商业和医学应用的磁性纳米晶体。
对磁小体细菌（MTB）进行广泛研究的一个重大障碍是它们在实验室中难以培养。大多数物种（包括本研究中使用的菌株）在以O2作为末端电子受体生长时，严格依赖微好氧条件。这解释了为何这些细菌通常出现在有氧与无氧环境之间的过渡区域（即有氧-无氧界面，OAI）。这明显表明，MTB对O2浓度具有精确的要求，因此在设计这些生物的培养基时显然必须考虑这一因素。此外，MTB存在广泛的多样性，意味着不同菌株需要不同类型的化学梯度和营养物质才能实现最佳生长。
在本研究中，我们描述了培养三种最常被研究的磁小体细菌（MTB）的方法： Magnetospirillum magneticum （菌株 AMB-1）， M. magnetotacticum （MS-1）和 M. gryphiswaldense （MSR-1）。这些物种在系统发育上属于 α-变形菌门 类别在 变形菌门 门，形态呈螺旋状，细胞两端各具有一根极生鞭毛。我们提供了在液体培养基和O2 基于先前发表的培养基配方的浓度梯度半固体培养基5,6我们还提供了一种详细的方案，用于在改良的磁螺旋菌生长培养基（MGSM）中培养AMB-1和MS-1菌株。7.
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方案
1. N的安装2 工作站
注意：选择导管的内径时，应确保其能与气罐连接且泄漏最小，同时使1 mL塑料注射器的筒身能紧密地插入该导管中。完整的N2充气装置示意图见图1。
- 安全安装 N2 靠近实验台的储气罐，实验台上留有足够空间用于安装 N2 站台（长度约50 cm）。
- 将一段足够长的管路连接至储气罐，以延伸至工作站的安装区域。如有必要，在储气罐出口处缠绕聚四氟乙烯胶带，以防止任何泄漏。
- 要构建一个可同时为五瓶培养基通气的装置，需截取四段长约5 cm的管子。
- 将三通T形塑料接头三个与管路部件依次连接成一条管路。将该管路一端连接至氮气输出端的管路部件上2 通过一个额外的T形接头将储液罐连接。在另一端安装一个90°弯头接头。
- 使用胶带将结构固定在水平金属杆上，金属杆位于实验台上方约30 cm处。
- 将五段管路（每段长约20 cm）连接至第1.4步中安装的接头的自由输出端。
- 从五个1.0 mL塑料注射器中取出活塞，并剪去这些注射器的较大一端即，针头的对侧），仅保留带刻度的部分。将棉絮填充入这些注射器中，但不要塞得过紧。
- 将注射器插入20 cm长的垂直管段中，并使用肥皂水确保连接处无泄漏，当N2 正在流动。
- 取下五根25 G针头（0.5 mm × 25 mm）的保护帽，将这些针头插入10 cm长的细导管中。确保针头与导管紧密贴合。
警告：此步骤存在刺伤风险。请缓慢而小心地操作。 - 将步骤1.9中准备好的针头连接至N的注射器上2 站。确保 N2 正在流经所有五条管线，并使该站处于待机状态。
2. 培养基制备
注意：可根据步骤 2.1.2、2.2.2 和 2.3.8 中的说明调整所配制培养基的量，只需按比例相应调整所用水和化学试剂的用量即可。所有培养基成分的作用详见补充表 1。
- MSR-1 液体培养基的制备
- 通过将 0.245 g 柠檬酸铁加入 100 mL 去离子蒸馏水中，配制 10 mM 柠檬酸铁溶液。加热并搅拌至溶解，直至获得黄色至橙色 澄清溶液。使用标准程序（在 121 °C 下至少暴露 15 分钟）对溶液进行高压灭菌，然后将该储备液避光保存于室温下。
注意：当溶液中出现明显沉淀时，应弃用该柠檬酸铁溶液。 - 在含有 1 L 去离子蒸馏水的烧杯中，边搅拌边依次加入以下成分：1.0 mL 微量矿物补充液、0.1 g KH2PO4、0.15 g MgSO4·7H2O、2.38 g HEPES、0.34 g NaNO3、0.1 g 酵母提取物、3.0 g 大豆蛋白胨、4.35 mL 乳酸钾（60% w/w 溶液）以及 5 mL 10 mM Fe(III) 柠檬酸盐储备液。
注意：若需配制较少量的培养基，应按比例调整各成分用量。对于可同时向五个瓶子通气的 N2 站（如本方案第 1 步中构建的装置），应配制 300 mL 培养基。
注意：微量矿物溶液和 Fe(III) 柠檬酸盐储备液需保持无菌。为避免污染，在使用时应采用标准无菌操作技术（用本生灯火焰灼烧瓶口），并使用无菌移液器吸头进行分装。将矿物溶液在 4 °C 冰箱中保存。 - 加入所有化学试剂后，用 1 M NaOH 溶液调节 pH 至 7.0。将新配制的培养基分装至 125 mL 血清瓶中，每瓶加入 60 mL 培养基。
- 使用连接至第 1 步所述 N2 站的小型软管向培养基中通入 N2 气体 30 分钟，以去除溶解的 O2。在每个瓶子顶部放置一个丁基橡胶塞，留出小孔以便多余气体排出。
注意：通 N2 时可能产生泡沫。应相应调节气体流速，避免泡沫生成。 - 用预先准备好的橡胶塞和铝盖对每个瓶子进行压封。铝盖可确保瓶子在整个实验过程中保持密封状态。
- 从 N2 站上拆下针头和细软管，并更换为洁净针头（1 英寸，≤23G）。调节 N2 气罐的阀门，使气体以温和连续的流速流出（约 50 mL/min）。
注意：大于 23G 的针头可能在橡胶塞上留下无法密封的永久性孔洞。 - 将连接至 N2 气罐的一根针头插入一瓶培养基中，穿过橡胶塞。立即在同一瓶子中插入另一根洁净针头。对其他瓶子重复此步骤，并让 N2 持续通入约 30 分钟，以用 N2 取代瓶内空气。
- 通过拔出相应针头的方式将一个瓶子从 N2 站断开。等待数秒，待瓶内压力降至大气压后，再拔出第二根针头。对所有剩余瓶子重复此步骤。
注意：为防止在第 2.1.4 步之后 O2 重新进入培养基瓶中，应迅速连续完成第 2.1.4–2.1.8 步。若无法同时将所有瓶子连接至 N2 站，则先对第一组瓶子执行第 2.1.4–2.1.8 步，再对剩余瓶子重复这些步骤。 - 对瓶子进行高压灭菌。让其在室温下过夜冷却，之后在室温下保存。
- 通过将 0.245 g 柠檬酸铁加入 100 mL 去离子蒸馏水中，配制 10 mM 柠檬酸铁溶液。加热并搅拌至溶解，直至获得黄色至橙色 澄清溶液。使用标准程序（在 121 °C 下至少暴露 15 分钟）对溶液进行高压灭菌，然后将该储备液避光保存于室温下。
- AMB-1 和 MS-1 液体培养基的制备
- 配制 10 mM 柠檬酸铁溶液。首先将 0.19 g 奎尼酸溶解于 100 mL 去离子蒸馏水中，然后加入 0.27 g FeCl3·6H2O。搅拌至完全溶解，直至获得深红色澄清溶液。使用标准程序（在 121 °C 下至少暴露 15 分钟）对该溶液进行高压灭菌。
注意：将柠檬酸铁溶液作为无菌储备液避光保存于室温下。当溶液中出现明显沉淀时，应弃用。 - 在含有 1 L 去离子蒸馏水的烧杯中，边搅拌边依次加入以下成分：10.0 mL 维生素补充液、5.0 mL 微量矿物补充液、0.68 g KH2PO4、0.848 g 丁二酸钠二碱六水合物、0.575 g 酒石酸二钠二水合物、0.083 g 醋酸钠三水合物、0.45 mL 0.1% 水溶液刃天青（resazurin）、0.17 g NaNO3、0.04 g 抗坏血酸以及 3.0 mL 10 mM Fe(III) 奎尼酸储备液。
注意：若需配制较少量的培养基，应按比例调整各成分用量。对于可同时向五个瓶子通气的 N2 站（如本方案第 1 步中构建的装置），应配制 300 mL 培养基。
注意：维生素、微量矿物和 Fe(III) 奎尼酸储备液需保持无菌。为避免污染，在分装时应采用标准无菌操作技术和无菌移液器吸头。将矿物溶液和维生素溶液在 4 °C 冰箱中保存。 - 加入所有化学试剂后，使用 1 M NaOH 溶液将 pH 调节至 6.75。
- 其余步骤请参考第 2.1.3–2.1.9 步。
- 配制 10 mM 柠檬酸铁溶液。首先将 0.19 g 奎尼酸溶解于 100 mL 去离子蒸馏水中，然后加入 0.27 g FeCl3·6H2O。搅拌至完全溶解，直至获得深红色澄清溶液。使用标准程序（在 121 °C 下至少暴露 15 分钟）对该溶液进行高压灭菌。
- MSR-1 半固体培养基的制备
- 通过将 3.362 g K2HPO4 和 4.178 g KH2PO4 溶解于 100 mL 去离子蒸馏水中，配制 0.5 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。检查 pH 是否为 7.0，必要时用 KH2PO4 或 NaOH 略作调节。将溶液储存于密封玻璃瓶中（优先于塑料瓶，以避免氧气交换）。
- 配制 100 mL 0.02 M 盐酸溶液。向该溶液中加入 0.2 g FeCl2·4H2O，搅拌溶解，得到 10 mM 氯化亚铁溶液。将溶液避光保存于密封玻璃瓶中。
- 通过将 6.72 g NaHCO3 溶解于 100 mL 去离子蒸馏水中，配制 0.8 M 碳酸氢钠溶液。将溶液储存于密封玻璃瓶中。
- 使用标准程序（在 121 °C 下至少暴露 15 分钟）对第 2.2.1–2.2.3 步配制的溶液进行高压灭菌。将其作为无菌储备液避光保存。
- 在含有 1 L 去离子蒸馏水的烧杯中，边搅拌边依次加入以下成分：5 mL 微量矿物补充液、0.2 mL 1% 水溶液刃天青、0.4 g NaCl、0.3 g NH4Cl、0.1 g MgSO4·7H2O、0.05 g CaCl2·2H2O、1 g 丁二酸钠、0.5 g 醋酸钠、0.2 g 酵母提取物和 1.6 g 琼脂。
- 用铝箔覆盖烧杯，并对第 2.3.5 步配制的溶液进行高压灭菌。
- 在高压灭菌程序即将结束前，通过将 0.8 g L-半胱氨酸·盐酸·一水合物（L-cysteine·HCl·H2O）溶解于 20 mL 去离子蒸馏水中，新鲜配制 4% 的 L-半胱氨酸·HCl·H2O 溶液。用 5 M NaOH 溶液将该溶液中和至 pH 7.0。
注意：必须新鲜配制半胱氨酸溶液，以避免其氧化。将矿物溶液在 4 °C 冰箱中保存。 - 高压灭菌后，让培养基冷却至 50–60 °C，并将烧杯置于本生灯火焰下。移除铝箔，边轻轻搅拌边迅速依次加入以下成分：0.5 mL 维生素溶液、2.8 mL 无菌磷酸盐缓冲液储备液、3 mL 无菌氯化亚铁储备液、1.8 mL 无菌碳酸氢钠储备液以及 10 mL 经滤膜除菌的半胱氨酸溶液。
注意：若需配制较少量的培养基，应按比例调整各成分用量。通常配制 120 mL 一批较为方便。
注意：所有溶液必须保持无菌以便后续使用。分装时应采用标准无菌操作技术和无菌移液器吸头执行第 2.3.8 步。 - 加入所有化学试剂后，将温热的培养基转移至 16 mL 无菌螺口亨盖特（Hungate）管中。每管转移 12 mL 培养基，并密封试管。
注意：为避免污染，第 2.3.9 步应在本生灯火焰下进行。操作应在琼脂凝固前完成，即培养基温度仍在 40 °C 或以上时进行。 - 静置试管数小时，直至琼脂完全凝固且氧梯度界面（OAI）显现 ，表现为培养基表面下方约 1 至 3 cm 处出现由粉红色至无色的界面。
注意：试管内的培养基应逐渐变为无色。完成这一转变所需的时间因初始溶解于培养基中的 O2 量而异。
3. 结核分枝杆菌接种
注意：菌株 AMB-1、MS-1 和 MSR-1 的培养物可从商业途径获得（材料表）。
注意：所有以下步骤均须在无菌条件下，于本生灯火焰旁进行。
- 液相培养基中 MSR-1、AMB-1 和 MS-1 菌株的接种
- 用丁基橡胶塞和铝制压盖密封一个空的125 mL血清瓶。通过橡胶塞向瓶内插入两根针头，将按步骤1.7准备好的注射器连接至其中一根针头，另一根针头连接氧气钢瓶。2 通过与N所用相同的管路2 站点
- 让 O2 通过瓶子通气约30分钟，以确保瓶内所有空气均被O₂取代2移除两根针头，使瓶内保持轻微正压，然后进行高压灭菌。使用前让瓶子冷却至室温。
注意：为节省时间，可在培养基制备过程中同时进行步骤 3.1.1 和 3.1.2，并将瓶子与培养基或储备液一同高压灭菌。 - 对新鲜培养基瓶和O的密封塞顶部进行灭菌2 通过在瓶口滴加数滴70%乙醇溶液，并将其通过本生灯火焰，对瓶口进行消毒。
- 使用无菌注射器和针头，吸取1 mL的O2 来自 O2 将液体转移至新鲜培养基瓶中。此步骤中需确保针头与注射器紧密连接，以避免注射器中混入空气。
- 若使用在玻璃瓶中培养的菌种作为接种物，需用滴管在新鲜培养基瓶和旧菌种瓶的瓶塞顶部滴加数滴70%乙醇溶液，并将瓶口通过本生灯火焰进行灭菌。若使用冻存菌种试管作为接种物，只需在本生灯火焰下保持试管密封，使其自然升温至室温即可。
- 若使用在玻璃瓶中培养的其他菌种作为接种物，取1 mL该较老的培养物接种至新鲜培养基中。若使用冻存菌种作为接种物，则仅接种0.1 mL，以稀释冷冻过程中所用的甘油或二甲基亚砜（DMSO）。两种情况下均应使用无菌针头和无菌注射器。
- 在32 °C条件下培养，4至7天后接种到新鲜培养基中。
- MSR-1 在 O 中的接种2 梯度半固体培养基
- 验证新鲜培养基试管中是否存在清晰的OAI，即由粉红色至无色的界面所指示的现象。
- 如果接种物来自另一个 O2 浓度梯度半固体培养，用无菌吸头吸取50 µL培养物，取自细菌形成的条带处，收集细菌。将这些细菌缓慢接种至新鲜培养基的OAI位置（粉红色/无色界面），注意避免扰动界面。若接种物来自冻存培养物，则同样操作，但使用100 µL接种物。
- 密封试管，使细菌在25 °C至30 °C下生长。在细菌带到达培养基表面之前，采用相同步骤转接到新鲜培养基中。
4. 细菌的观察
- 用70%乙醇溶液擦拭培养瓶的瓶塞，并通过本生灯火焰进行灭菌。对于半固体培养基，在本生灯火焰下方打开试管。使用无菌接种针和无菌注射器吸取细菌。
- 采用悬滴法8确认细菌具有磁性且可运动。
注意：相差显微镜观察效果良好，但非必需。适用的放大倍数范围为10X至60X。 - 利用透射电子显微镜（TEM）详细观察细胞结构及磁小体8。
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结果
成功制备培养基可通过以下方式评估：在制备过程结束时，应得到澄清的溶液（即.，无任何沉淀物）应被获得（此要求适用于液体培养基和O2 梯度半固体培养基）。接种前MSR-1液体培养基预期外观的图片如图所示。 图 2a成功的O2 浓度梯度半固体培养基中，数小时后出现交联诱导剂（OAI）信号，表现为试管顶部有1–3 cm的粉红色培养基图3，试管A）。其余培养基应为无色。接种前若培养基完全呈粉红色，表明刃天青已完全氧化，说明厌氧培养基制备失败。2 浓度梯度
接种后约48小时（若接种物来自冻存菌种，则可能需要数天）可通过肉眼观察培养物是否变浑浊，或使用光源或分光光度计检测，以判断液体培养基中细菌是否成功生长。若培养基变浑浊，则表明细菌已成功增殖（
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讨论
MTB 对特定的 O2 浓度具有严格要求，这使其在实验室中培养具有挑战性。液体培养基操作方案的关键步骤是在接种前通过加入定量体积的 O2 来精确控制最终浓度，因此需首先完全去除培养基中的 O2。已有研究表明，MSR-1 可在近乎完全有氧的条件下生长，但其细胞磁性会显著降低。同一研究的结果还显示，菌株 AMB-1 和 MS-1 在完全有氧条件下无法生长6。对于 MSR-1 的半固体培养，首先通过半胱氨酸溶液将所有 O2 还原，随后形成 O2 浓度梯度，从而诱导氧扩散区（OAI）的形成。若培养物生长不良或缺乏磁性，应首先检查 O2 浓度。
半固体培养基是分离未知结核分枝杆菌或培养对氧气和二氧化碳均高度敏感菌种的一种理想选择2 以及氧化还原梯度，因为它能确保稳定梯度的存在，使细菌能够定位在最适宜其生长的位置。当需要较大体积时，液体培养基更便于操作（例如，用于DNA提取），...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Richard B. Frankel 在磁小体细菌（MTB）培养方面提供的帮助，感谢 Adam P. Hitchcock 和 Xiaohui Zhu 在麦克马斯特大学建立 MTB 培养体系期间给予的支持，感谢 Marcia Reid 提供电子显微镜设施的培训与使用权限（加拿大麦克马斯特大学健康科学学院）。本研究工作得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）和美国国家科学基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AMB-1 | 美国模式培养物集存库 (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | 德国微生物与细胞培养物保藏中心 (DSMZ) | DSM 6361 | |
| 柠檬酸铁 | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| 微量元素补充剂 | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| 酵母提取物 | Fischer scientific | DF210929 | |
| 蛋白胨 | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| L-乳酸钾溶液 (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-奎宁酸 | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| 维生素补充剂 | ATCC | MD-VS | |
| 六水合琥珀酸钠 | Fischer scientific | S413-500 | |
| 二水合二碱性酒石酸钠 | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| 三水合乙酸钠 | EMD | SX0255-1 | |
| 刃天青 | Difco | 0704-13 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| 碳酸氢钠 | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| 琼脂 A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-半胱氨酸·盐酸·H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL 注射器 | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 针头 | BD | 305125 | |
| 125 mL 血清瓶 | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm 铝制密封盖 | Wheaton | 224223-01 | |
| 20 mm E-Z 压盖器 | Wheaton | W225303 | |
| 丁基橡胶塞 | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate 管 | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| 隔垫塞，13 mm，Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| 玻璃培养管 | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| 盐酸 36.5-38%，生物试剂 | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
参考文献
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