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利用核磁共振波谱法（NMR）和微尺度热泳法（MST）检测球状蛋白与丝状蛋白的相互作用

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DOI：

10.3791/58537

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2018年11月2日

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1Department of Biochemistry, University of Alberta

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于制备和纯化稳定同位素标记蛋白质的实验方案，以及随后利用核磁共振（NMR）波谱法和微尺度热泳（MST）实验表征蛋白质-蛋白质相互作用的方法。

摘要

波形蛋白等丝状蛋白通过提供具有结合含斑蛋白重复序列蛋白位点的结构支架，在细胞内发挥组织作用。本文介绍了一种检测和测量此类相互作用的实验方案，该方案使用envoplakin的球状斑蛋白重复结构域和波形蛋白的螺旋卷曲结构域。该方法可用于判断某种蛋白是否与波形蛋白（或类似的丝状蛋白）结合，并测定其相互作用的亲和力。将感兴趣的球状蛋白用15N标记后，在溶液中逐步加入波形蛋白进行滴定。通过采集二维核磁共振（NMR）谱图，观察信号峰形或化学位移的变化来检测相互作用，并阐明溶液条件（如盐浓度）对波形蛋白四级结构的影响。若目标蛋白与丝状配体发生结合，则进一步使用微量热泳动法（MST）对纯化的蛋白进行结合亲和力的定量分析。该方法为判断目标蛋白是否与丝状蛋白结合，以及评估突变或溶液条件等改变对相互作用的影响，提供了一种简便有效的途径。

引言

蛋白质之间的相互作用能够形成分子机器，从而在细胞内建立有序结构。这些单独的相互作用通常较弱，但通常会共同参与形成多价复合物，这些复合物具有协同性并可进行动态调控。为了推断其作用机制并设计干预手段（如类药物分子），需要灵敏的检测方法，以提供关于此类复杂相互作用的原子级分辨率和定量信息。核磁共振波谱（NMR）是一种高效获取蛋白质相互作用信息的方法，也可用于快速筛选配体，包括弱结合配体1。所采用的NMR方法可分为基于蛋白质观测和基于配体观测两类。本文采用前一种方法，即对相对较小（通常小于20 kDa）的稳定同位素标记蛋白质进行谱图采集，并逐步滴加未标记的配体。在理想情况下，该方法可定位参与相互作用的标记氨基酸残基。一旦形成复合物，相互作用残基的化学环境将发生变化，表现为NMR信号的化学位移和峰形发生改变。这些变化的程度与各基团在相互作用中的参与程度相关。通过比较蛋白质在不同浓度配体存在与否条件下获得的一系列NMR谱图，可测量化学位移扰动（CSPs）。对于较大的配体或复杂的相互作用，可通过测量峰形或信号强度的变化来推断相互作用情况。

用于检测配体相互作用最常见的二维实验是15N-异核单量子相干（HSQC）实验2。该实验要求其中一个蛋白质被均匀地标记15N，通常通过在富含15N的培养基中培养的大肠杆菌（E. coli）表达带有亲和标签的蛋白来实现。在滴定过程中采集的HSQC谱图叠加后，若部分参与复合物形成的残基出现峰位变化，则表明发生了结合。这种相互作用可能处于快速交换状态，此时游离态和配体饱和态的信号合并为一个代表平均化群体的峰；或者在状态间交换较慢的情况下，两种信号均可见，其积分面积反映各自相对含量。虽然在某些情况下可通过核磁共振（NMR）谱线形状分析来估算结合亲和力，但诸如微量热泳动（MST）等方法也被证明十分便捷，并可用于真实相互作用的交叉验证。

示例中的两种蛋白存在于桥粒中。它们介导细胞表面与细胞骨架之间的连接，并介导细胞黏附装置与中间丝之间的多价相互作用，以维持皮肤和心脏组织的完整性并抵抗剪切力。当桥粒蛋白（如桥粒斑蛋白或波形蛋白）因突变或自身抗体而功能受损时，可导致细胞间连接的不稳定，从而引发疾病，因此这些蛋白的相互作用具有关键重要性3。桥粒蛋白与配体结合的结构基础可通过核磁共振（NMR）波谱法进行表征，而其相互作用则可通过微量热泳动（MST）技术进行定量分析。本文所述方法用于表征肌动蛋白重复结构域（PRDs）与波形蛋白之间的相互作用，其中PRDs通常以串联形式存在，形成基本沟槽结构，而波形蛋白是一种中间丝蛋白，通过其螺旋束结构提供的酸性表面与PRDs结合4。这些复合物在细胞膜上形成，将细胞骨架的中间丝锚定于桥粒上，而桥粒则与相邻细胞相连，从而形成贯穿整个组织的黏附连接网络。

方案

1. 重组蛋白表达

  1. Envoplakin PRD (E-PRD) 和波形蛋白 99-249 (VimRod) 的表达
    1. 将含有目标基因的质粒转化至大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) 细胞中。将细胞涂布于含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的琼脂平板上，在 37 °C 下过夜培养。
    2. 挑取单菌落，接种于 20 mL 含 100 µg/mL 氨苄青霉素的优质肉汤（TB）中，以筛选含有质粒的菌株。在 37 °C 下振荡培养（180 rpm）过夜。
    3. 将全部 20 mL 菌液转移至 1 L 含 50 µg/mL 氨苄青霉素的 TB 培养基中，在 37 °C 下以 180 rpm 振荡培养，直至 OD600 达到 0.6–0.8。
    4. 将温度降至 18 °C，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度 1 mM 以诱导蛋白表达。继续在 18 °C、160 rpm 振荡条件下过夜培养，以促进蛋白表达。
    5. 在 8,000 × g 条件下离心 15 分钟收集细胞，弃去上清液。
    6. 用约 40 mL 磷酸盐缓冲液（PBS：20 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.4，120 mM NaCl）重悬细胞沉淀以洗涤细胞，将重悬液转移至 50 mL 离心管中，在 8,000 × g 条件下再次离心 15 分钟。
    7. 弃去上清液。可立即开始纯化步骤，或将细胞沉淀于 -20 °C 冻存以备后续使用。
  2. 同位素标记蛋白的表达
    1. 将质粒转化至大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) 细胞，并按照步骤 1.1.1–1.1.2 制备 20 mL 起始培养物。
    2. 将全部 20 mL 菌液转移至 1 L 富集型 TB 培养基中，额外添加 4.0 g 胰蛋白胨、5.0 g NaCl 和 100 µg/mL 氨苄青霉素，在 37 °C、160 rpm 振荡条件下培养至 OD600 达到 1.6–1.9。
    3. 在 8,000 × g 条件下离心 15 分钟收集 1 L 培养物，弃去上清液。
    4. 用约 40 mL PBS 轻柔重悬细胞沉淀，并将重悬液转移至 50 mL 离心管中。
    5. 再次在 8,000 × g 条件下离心 15 分钟，弃去上清液。
    6. 用 20 mL M9 最小培养基重悬细胞沉淀，并转移至含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的其余 950 mL M9 最小培养基中。
    7. 加入 50 mL 过滤除菌的营养混合物（表 1 和 表 2）。
    8. 在加入 IPTG 至终浓度 1 mM 前，将菌液在 18 °C 预适应 30 分钟。
    9. 在 18 °C、160 rpm 振荡条件下过夜培养。
    10. 按照步骤 1.1.4–1.1.6 收集细胞。

2. VimRod 和 E-PRD 的固定化金属亲和色谱（IMAC）纯化

  1. His6标签VimRod蛋白的纯化
    1. 将细胞沉淀用含蛋白酶抑制剂混合物（不含EDTA）的PBS缓冲液按5 mL/g重悬。使用Dounce组织匀浆器进行12次匀浆，以提高后续步骤中的细胞裂解效率。
    2. 在冰上对细胞悬液进行超声处理，参数为脉冲1秒开/1秒关，振幅80%，总时长1.5分钟。额外重复超声两次，每次之间在冰上轻轻涡旋混匀，防止过热。
    3. 将样品在75,000 × g离心45分钟。倾出上清液，并使用注射器滤器（0.45 µm）过滤。
    4. 使用快速蛋白液相色谱系统（FPLC），以1 mL/min流速，用5个柱体积（CV）的结合缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.5，500 mM NaCl，10 mM 咪唑）对5 mL IMAC柱进行平衡。
    5. 以0.5 mL/min流速将过滤后的上清液上样至柱中。
    6. 以1 mL/min流速用5 CV洗涤缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.5，500 mM NaCl，50 mM 咪唑）洗涤柱子。
    7. 以0.5 mL/min流速用3 CV洗脱缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.5，500 mM NaCl，350 mM 咪唑）洗脱蛋白。收集1.5 mL的组分。如有条件，选择上行流洗脱模式以提高洗脱蛋白的浓度。
    8. 通过SDS-PAGE分析FPLC色谱图，确定含有目标蛋白的组分，并采用标准方法测定蛋白浓度5。
    9. 使用离心超滤装置（截留分子量3 kDa，5 mL）将含有最高蛋白量的洗脱组分合并并浓缩至2 mL。在21,000 × g离心以去除任何沉淀物，并通过0.22 μm滤器过滤。
    10. 使用FPLC系统，以1 mL/min流速，用2个柱体积的S缓冲液（20 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.5，0.5 mM TCEP）对120 mL凝胶过滤层析（S）柱进行平衡。
    11. 将步骤2.1.9中浓缩的蛋白注入柱中，以0.5 mL/min流速用1 CV的S缓冲液洗脱，收集1 mL组分。
    12. 同前法鉴定含有目标蛋白的组分。
    13. 合并含有最高蛋白量的组分。
    14. 短期使用可储存于4 °C，或加入甘油至终浓度20%，分装后于-80 °C保存。
  2. 去除His6标签后的E-PRD蛋白纯化
    1. 按照步骤2.1.1–2.1.8纯化带有His6标签的E-PRD蛋白。合并主峰组分并测定蛋白浓度。
    2. 按每毫克合并蛋白加入2 µL烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶（1 mg/mL）。将混合物转移至透析袋（6 kDa）中，在S缓冲液中于4 °C透析过夜。此步骤可实现His6标签的切割，并去除会干扰下一步Ni-NTA树脂结合的咪唑。
    3. 在重力柱中用3 CV的S缓冲液对5 mL Ni-NTA树脂进行平衡。排尽树脂中多余的缓冲液。
    4. 将切割后的E-PRD蛋白倒入树脂中，在摇床上孵育1小时，使未切割的His6标签E-PRD蛋白及已切割的His6标签与树脂结合。TEV蛋白酶也带有His6标签，会结合至树脂。收集流穿液，其中含有去标签的E-PRD蛋白。用2 CV的S缓冲液洗涤树脂，确保完全回收所有E-PRD蛋白。
    5. 使用离心超滤装置（截留分子量3 kDa，5 mL）将流穿液中的E-PRD蛋白浓缩至2 mL。在21,000 × g离心以去除任何沉淀物，并通过0.22 μm滤器过滤。
    6. 使用FPLC系统，以1 mL/min流速，用2个柱体积的S缓冲液（用于MST实验：20 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.5，0.5 mM TCEP；用于NMR实验：20 mM Tris-HCl，1 mM DTT，pH 7）对120 mL S柱进行平衡。
    7. 将步骤2.2.5中浓缩的E-PRD蛋白注入柱中，以0.5 mL/min流速用1 CV的S缓冲液洗脱，收集1 mL组分。
    8. 同前法鉴定含有目标蛋白的组分。
    9. 合并含有最高蛋白量的组分。
    10. 短期使用可储存于4 °C，或加入甘油至终浓度20%，分装后于-80 °C保存。

3. 核磁共振方法

  1. 核磁共振样品制备
    1. 纯化 15N标记的野生型或R1914E E-PRD蛋白，按先前所述方法制备，第二步2.2.6中使用20 mM Tris-HCl、1 mM DTT、pH 7的溶液作为S缓冲液。蛋白储备液浓度通常为0.3至1 mM，体积约为1 mL。
      注意：蛋白质可浓缩至 >使用截留分子量为3 kDa、体积为5 mL的离心超滤装置，将样品浓缩至100 µM，使其浓度达到样品制备的适宜范围。
    2. 使用 20 mM Tris-HCl、1 mM DTT、pH 7 的缓冲液作为步骤 2.1.10 的 S 缓冲液，纯化一份未标记的 VimRod 蛋白样品。
    3. 在最终体积为 500 µL 的溶液中，加入野生型或突变型 E-PRD 蛋白至终浓度为 100 µM，以及氘代水（D₂O）2O) 至终浓度为10%（v/v），以及DSS（4,4-二甲基-4-硅代戊烷-1-磺酸）至终浓度为20 µM。用20 mM Tris-HCl、1 mM DTT（pH 7.0）将样品体积调至500 µL。一个典型的样品制备方法如下所述。 表4.
      注意：使用DSS的0 ppm共振峰来校准 1H化学位移，以及用于间接参照的 15蛋白质的N化学位移6. D2O 用于氘锁信号，以保持波谱仪在恒定的净磁场下运行。
    4. 制备第二份 E-PRD 样品，D2O 和 DSS 同上一步，并在加水至终体积 500 µL 前加入 VimRod 至终浓度为 50 µM。
    5. 将500 µL样品转移至5 mm宽的NMR管中用于实验。
  2. 核磁共振实验设置
    1. 使用弹出命令“ej”打开气流，将样品从磁体中升起。随后，将样品放置于磁体顶部的转子中，并通过插入命令“ij”将其装入。在继续操作前，请等待样品在磁体内完全稳定。
    2. 使用“edc”命令创建新数据集并加载标准 1H NMR 参数，选择实验“ZGPR”（图1）。填写“NAME”（姓名）、“EXPNO”（实验编号）和“PROCNO”（处理数据文件夹编号）字段。在“Set solvent”（设置溶剂）字段中选择溶剂，然后点击“Execute ‘getprosol’”（执行“getprosol”）以读取标准探头和溶剂依赖性（prosol）参数。
    3. 将样品锁定至氘代溶剂 即， D2O，使用“lock”命令并等待其完成扫描并实现锁定。
    4. 使用自动调谐命令“atma”调节样品以校正磁体的共振频率。监测进动曲线，直至自动调谐完成。
    5. 使用 TOPSHIM 命令（“topshim”）对磁场进行匀场。匀场是指调整磁场以实现样品周围磁场均匀性的过程。若使用相同或相似样品，建议在执行 topshim 前使用“wsh”命令保存匀场值，并用“rsh”命令读取先前的匀场值。
    6. 使用“rga”命令调节接收增益，以获得最大信噪比。
    7. 将谱图中心置于水共振偏移（o1）处，并使用“calibo1p1”以高功率设置90度质子脉冲（p1）。
    8. 使用“zg”命令采集质子谱，并用“efp”进行处理，该处理包括指数乘法（“em”）、对自由感应衰减（FID）施加线宽展宽、“ft”对FID进行傅里叶变换，以及“pk”进行相位校正。
    9. 使用不带积分选项的多项式方法，应用自动相位校正“apk”和自动基线校正“absn”。
    10. 在实验中选择“SFHMQC3GPPH”以创建SOFAST HMBC实验的新数据集（如3.2.2所述）。
    11. 从质子谱中复制优化后的 P1 和 O1，并使用命令“getprosol 1H p1 plw1”设置 P1 相关脉冲，其中 p1 为优化后的 P1 值，plw1 为 P1 的功率水平。
    12. 优化 CNST54 常数以设置酰胺化学位移的偏移量，优化 CNST55 以定义带宽，从而覆盖感兴趣的谱图区域，以便优化接收增益（图2）。为了选定这些参数，从二维谱中提取第一个FID（自由感应衰减）信号，并根据观测到的信号来确定参数。此外，调整弛豫延迟（D1）、扫描次数（NS）和虚扫描次数（DS），结合使用“gs”命令进行实时监测，以获得可接受的信号灵敏度。
    13. 使用 Zero Go “zg” 记录谱图。
  3. 核磁共振数据处理
    1. 将处理参数设置为直接F2的尺寸1H）和间接 F1（15N）使用“SI F2=2048, F1=512”设置谱图的维数，间接维可选线性预测图3).
    2. 选择“QSINE”作为窗口函数，并输入2的正弦钟形偏移（SSB）以处理二维谱图。
    3. 输入命令“xfb”以使用窗函数和傅里叶变换对数据进行双向处理。
    4. 使用“apk2d”命令对两个方向进行自动相位校正。如果自动校正过程未能达到满意的相位校正效果，则使用“rser”命令提取FID，通过一维处理计算相位值，并将其应用于二维数据。
    5. 使用“abs2”自动基线校正功能对二维数据进行基线校正。该方法将在处理参数中定义的 ppm 值之间应用多项式函数，从而生成可用于进一步分析的二维谱图。
    6. 若计划进行连续处理，以比较与其他分子的相互作用数据，请使用“wpar”命令保存处理参数，并使用“rpar”命令调用参数。这样可确保所有数据集均采用相同的参数进行处理，避免因处理条件差异引入变异。
  4. 核磁共振数据解析
    1. 输入命令“pp”以开始峰提取过程。
    2. 根据预期峰定义 ppm 范围以及峰的最小强度/最大数量（图4）。单击“确定”，并通过目视检查验证结果。如有必要，重复运行该过程，直至根据光谱质量获得满意结果。
    3. 使用“pp”命令生成峰列表。
      注意：此峰列表默认包含数据高度/峰强度信息，可导出至后续谱图，并能被其他程序读取。
    4. 观察蛋白HSQC谱图中峰强度的变化或化学位移的移动，这些现象表明蛋白与另一分子发生相互作用。如果相互作用的分子较大，则预期会出现峰强度降低，并伴随部分峰的消失。
    5. 通过点击“peaks”选项卡，在峰窗口中右键选择“import”，将峰列表导入下一个数据集。
    6. 在谱图上查看峰的位置，如有需要可将其移动至新位置。点击“完整表格”的“重置强度”，以生成包含强度信息的谱图峰列表图5）。该峰列表将继承自存储的峰列表中的位置信息。
    7. 从不同数据集中导出峰列表，选择“导出”功能，将数据保存至电子表格或其他数学分析程序中进行分析。
    8. 使用“复合物谱图中的峰强度 / 蛋白质谱图中的峰强度”这一函数，计算每个峰的峰强度变化。将所得数值乘以100，可转换为百分比变化。需注意，尽管峰强度更便于测量相邻较近的峰（这在具有较高密度且相对较宽峰的蛋白质中通常如此），但峰体积同样具有参考价值。

4. 微尺度热泳（MST）

  1. 配体蛋白 E-PRD 的制备
    1. 通过透析将配体置换至适用于微量热泳动（MST）的缓冲液中：将最多 800 μL 蛋白质样品加入悬浮于 1 L 20 mM HEPES（pH 7.5）、10 mM NaCl 缓冲液中的 3.5 kDa 微型透析装置中，于 4 °C 缓慢搅拌过夜。
    2. 使用离心超滤装置（3 kDa 截留分子量）浓缩配体，在 14,000 × g 条件下离心 10 分钟。将浓缩后的蛋白转移至洁净离心管中。
    3. 在 21,000 × g 条件下离心配体 10 分钟，小心转移上清液至新管，以去除任何沉淀的蛋白质。通过测定 280 nm 处的吸光度及配体的消光系数确定其浓度。加入 Tween-20 至终浓度为 0.015%。Tween-20 被添加至检测缓冲液中以防止蛋白质在毛细管上的吸附。MST 实验所用的最终检测缓冲液组成为：20 mM HEPES（pH 7.5）、10 mM NaCl、0.015% Tween-20。
  2. 荧光标记靶蛋白 VimRod 的制备
    1. 通过加入随 RED-tris-NTA 染料提供的 1x PBS-T 缓冲液 50 μL，将 RED-tris-NTA 染料重悬至浓度为 5 μM。分装成每份 2 μL 的等分试样至 200 μL 离心管中，并于 -20 °C 保存。
    2. 用检测缓冲液将靶蛋白稀释至 0.34 μM。向一份 2 μL 的 RED-tris-NTA 染料中加入 58 μL 靶蛋白，室温孵育 30 分钟。染料标记后的靶蛋白终浓度为 0.33 μM。在 21,000 × g 条件下离心标记产物 10 分钟，小心转移上清液至新管，以去除任何沉淀物。RED-tris-NTA 染料通过 His6 标签结合蛋白，其解离常数（KD）处于亚纳摩尔范围，因此可认为其与靶蛋白的结合接近 100%，无需进一步纯化。
    3. 开启 MST 仪器并打开控制软件。为 RED-tris-NTA 染料选择红色通道设置。将温度控制设为 25 °C。
    4. 选择预测试功能，以验证靶蛋白的标记效果，并检查是否存在聚集或吸附至比色皿的现象。软件将自动评估这些参数。
    5. 混合 17 μL 检测缓冲液与 3 μL 靶蛋白，通过移液混匀。将两根标准毛细管浸入稀释后的靶蛋白溶液中，吸取液体至毛细管中央。将毛细管放入样品托盘并插入仪器，开始测量。
    6. 查看结果，确认荧光信号足够强，且无吸附（毛细管荧光线条形状畸变）或聚集（MST 曲线畸变）迹象，这些异常会在软件分析中被标记。若结果合格，则进入下一步配体操作；否则需尝试更换缓冲液，或提高 Tween-20 浓度至 0.05% 或更高。
  3. E-PRD 配体两倍梯度稀释系列的制备
    1. 准备一个梯度稀释系列：标记 16 个 200 μL 离心管，编号为 1–16。
    2. 向 1 号管中加入体积为 17 μL 的配体溶液，其浓度比所需最高配体浓度高 1.17 倍。该体积为实际所需量（8.5 μL）的两倍，以便后续将等分试样逐级转移至下一管。检测终体积为 10 μL，因此加入 8.5 μL 浓度为 1.17 倍的配体后，再加入 1.5 μL 靶蛋白 VimRod，即可稀释至 1 倍终浓度。所选最高浓度应至少为预估 KD 值的 20 倍。
    3. 使用新的移液枪头，向 2–16 号管中各加入 8.5 μL 检测缓冲液（每加一次更换枪头，以确保准确性；有关精确移液操作建议，请参阅制造商说明）。缓慢将 8.5 μL 配体从 1 号管转移至 2 号管，将溶液释放至检测缓冲液中，避免产生气泡。通过上下吹打至少 6 次混匀配体与缓冲液，同样避免产生气泡。最浓管中 E-PRD 的浓度为 1.5 mM，标记的 VimRod 终浓度为 50 nM。
    4. 将 8.5 μL 配体从 2 号管转移至 3 号管，并与缓冲液混匀。重复此连续稀释步骤，直至所有管中均加入配体。最后从 16 号管中弃去 8.5 μL 溶液，使所有管中均保留 8.5 μL 配体，形成一系列两倍稀释梯度。
  4. 结合反应的制备与 MST 实验
    1. 向每管中加入 1.5 μL 标记的靶蛋白，通过轻柔上下吹打混匀，注意避免产生气泡。孵育 15 分钟。
    2. 选择“专家模式”进行结合检测，并输入连续稀释系列的参数。确保温度控制设为 25 °C，激发光功率设为 40%，MST 功率设为中等。这些参数需根据所研究的其他结合伙伴进行优化。
    3. 将结合反应液填充至毛细管中，并放入毛细管托盘。将托盘装入仪器，等待温度恢复至 25 °C 后开始测量。
  5. 数据分析
    1. 在亲和力分析软件中打开结合检测文件。检查毛细管扫描图：荧光水平与平均值的偏差不应超过 10%，且不应检测到聚集或吸附现象（如第 3.6 节所述）。
    2. 在右侧面板选择 MST 分析，将检测数据拖入分析集。若在相同条件下对同一靶蛋白-配体结合检测进行了多次重复运行，可将其合并至同一分析集中；也可将每次运行独立导入分析。
    3. 切换至“剂量-反应拟合”标签页以绘图。若预期为单一位点结合，选择 KD 模型；若存在多个协同结合位点，可选择 Hill 模型。此阶段可剔除未通过质量控制的异常数据点。合并多个检测的数据集将取平均值，误差以标准差表示。
    4. 打开最后一个标签页，在单张图中比较所有曲线的结果。从生成的表格中提取每条曲线的拟合结果。如需，可将数据或拟合曲线导出至其他展示或分析软件。

结果

人envoplakin基因的E-PRD结构域（第1822-2014位氨基酸，克隆至pProEX-HTC）和人波形蛋白的VimRod结构域（第99-249位氨基酸，克隆至pET21a）4 带有 His6 标签表达并纯化。 图6 和 图7 展示通过该蛋白质纯化方法获得的 VimRod（18.8 kDa）和 E-PRD（21.8 kDa）的纯度水平。在 MST 实验中，必须去除 E-PRD 构建体中的 His6 标签，因为 VimRod 蛋白是使用识别 His6 标签的染料进行标记的，任何保留其 His6 标签的 E-PRD 都可能与 VimRod 竞争染料结合。在使用 TEV 蛋白酶切割标签后，第二次 IMAC 柱层析用于去除 TEV 蛋白酶、切割下来的标签以及任何未被切割的 His6-E-PRD。纯化的最后精制步骤为尺寸排阻层析。尽管两种蛋白质分子量相近，VimRod 在 51 mL 处洗脱，而 E-PRD 的洗脱峰位于 72 mL，符合该分子量大小的蛋白单体预期洗脱体积。VimRod 表观分子尺寸的增大可能是由于其作为丝状长杆形蛋白的特性所致，分析型超速离心实验已证实 VimRod 为单体形式。4在M9培养基中培养的菌体所获得的蛋白质产量低于在丰富培养基中培养的菌体，这是由于在最小培养基中产生的细胞数量较少。在TB培养基中预先培养较大规模的起始种子液用于M9培养基的制备，可在维持营养限制程度的同时提高细胞产量。 15核磁共振实验所需的N标记。

15N-1H HSQC 谱图分别在有或无 VimRod 存在的条件下，对野生型和 R1914E 突变型 E-PRD 进行了采集（图 8A–8D）。图 8A 中 E-PRD 的谱图显示出预期数量的清晰分辨峰，表明蛋白正确折叠。在 VimRod 存在时（图 8B），谱图出现广泛的谱线展宽和峰信号消失，对应于 E-PRD 与 VimRod 之间的结合。通过比较 图 8C 与 8D 可知，R1914E 突变消除了这种结合。向 R1914E 突变型 E-PRD 中加入 VimRod 后谱图变化很小，表明该突变型 E-PRD 与 VimRod 之间缺乏结合。E-PRD 在有或无 VimRod 存在时的峰强度被比较并绘制为 图 8E 中的相对峰强度，以显示 E-PRD 复合物中峰展宽的程度。R1914E 突变型 E-PRD（未展示）在加入 VimRod 后仍保留约 97% 的峰信号强度在 20% 或以上，而野生型则仅保留约 20%（图 8E）。这表明 R1914E 是一个功能丧失型点突变，此外还研究了具有中间效应的其他突变体4。

为验证并定量分析VimRod与E-PRD的结合，采用荧光RED-tris-NTA染料标记的His6-VimRod作为靶标，与浓度从1.28 mM递减至39.1 nM的配体E-PRD进行微量热泳动（MST）结合分析。共进行了三次结合滴定实验，结果取平均值，如图9所示。数据采用标准的单一位点配体结合模型进行拟合，得到解离常数KD为25.7 ± 2.1 μM。通过表面等离子共振（SPR）技术对VimRod与E-PRD之间的结合进行评估，所得KD值相似，为19.1 ± 1.3 μM4。

采集质子谱的核磁共振实验设置参数；H2O+D2O溶剂，实验配置
图1：核磁共振实验设置界面截图。 所示窗口用于设置标准实验以采集HSQC数据集。实验参数在“Experiment”（实验）附近显示。图中所示的ZGPR实验被选为初始实验，用于加载标准的、溶剂依赖的质子参数。标题窗口用于输入实验细节，以便记录存档。为采集HSQC谱，需将ZGPR实验替换为SFHMQC3GPPH。 请点击此处查看该图的放大版本。

NMR波谱参数设置；H(N)化学位移、带宽、弛豫延迟、伪扫描。
图2：核磁共振实验参数的调节。 所示窗口用于输入核磁共振脉冲序列的基本参数，以优化信号。请点击此处查看此图的放大版本。

用于谱图分析的核磁共振波谱设置，包括窗函数、相位和基线校正。
图 3：核磁共振数据处理。 显示了用于处理核磁共振谱两个维度的参数，箭头指示了通常需要调整的参数。请点击此处查看该图的放大版本。

核磁共振软件界面中的峰挑选设置；用于谱图峰分析和数据导出的参数。
图 4：核磁共振峰挑选参数。 图中显示了在处理后的核磁共振谱图中用于峰挑选的参数及其典型取值。调整 ppm 范围、强度和峰的数量，以优化谱图。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示峰、频率、强度的核磁共振谱数据表；包含谱图扩展菜单。
图5：具有强度信息的代表性峰列表。 核磁共振谱中每一个被选中的峰均被编号，并显示其1H和15N化学位移及信号强度。该峰列表可用于比较在有/无相互作用伙伴存在条件下获得的谱图。请点击此处查看此图的放大版本。

蛋白质纯化：凝胶过滤色谱图、洗脱体积、各组分的SDS-PAGE分析。
图6：通过IMAC和S柱对His6标签VimRod蛋白的纯化 A. IMAC柱洗脱色谱图显示VimRod的一个主要峰。B. S柱洗脱色谱图显示一个主要峰。C. 纯化过程中收集各组分的SDS-PAGE分析：左侧标注分子量（kDa）的标准蛋白Marker（M）、细胞裂解液（1）、IMAC流穿液（2）、洗涤组分（3）、合并的IMAC洗脱组分（E1）、合并的S柱洗脱组分（E2）。E1和E2泳道中较高分子量处可见的条带经Western blot证实为纯化VimRod的寡聚体（数据未显示）。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质纯化；SDS-PAGE、层析图谱、凝胶电泳结果；分子量。
图7：通过IMAC和S柱纯化E-PRD。 IMAC纯化的SDS-PAGE结果，显示左侧凝胶标注了以kDa为单位的分子量标准（M），以及第一根IMAC柱的洗脱液（E1）、TEV酶切产物（+TEV）和第二根IMAC柱的穿流组分（FT）。B. S柱的层析图显示一个主要峰。C. 分子量标准（M）及S柱主峰各组分的SDS-PAGE结果。请点击此处查看此图的放大版本。

核磁共振波谱；二维 ^1H-^15N HSQC 质子化学位移相关；四幅图，一个柱状图。
图8：野生型和R1914E突变体E-PRD在有或无VimRod存在下的HSQC谱图。 HSQC谱图显示了在20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM DTT、pH 7缓冲液中，不含（A）或含有50 µM VimRod（B）时的野生型E-PRD（100 µM）。图C和D分别为R1914E突变体（100 µM）在不含或含有50 µM VimRod时的HSQC谱图。图E展示了E-PRD在结合或未结合VimRod时的相对1H-15N峰强度随峰编号的变化关系，峰编号为任意分配，不基于序列位置。这些数值可用于确定加入配体后峰强度降低的显著性阈值。若有化学位移归属信息，通常可发现显著变化的数值集中于结合区域。请点击此处查看该图的放大版本。

剂量-反应曲线图，ΔFnorm 对 [PRD]，展示生化相互作用测定。
图 9：E-PRD 与 VimRod 的结合。 将 E-PRD 从 1.28 mM 到 39.1 nM 进行连续两倍稀释，并在进行 MST 分析前与标记的 VimRod 孵育。数据来自三次独立实验的合并结果。数据拟合至 KD 模型，得到 KD 值为 25.7 μM，KD 置信区间为 ± 2.1 μM。请点击此处查看该图的放大版本。

试剂用量
Sodium phosphate, dibasic (anhydrous)6.0 g
Potassium phosphate, monobasic (anhydrous)3.0 g
Sodium Chloride0.5 g
H2O加至 950 mL

表1. 用于同位素标记的M9培养基。

试剂用量
15NH4Cl1.0 g
葡萄糖（或 13C-葡萄糖）2.0 g
1 M MgSO42 mL
50 mM CaCl24 mL
20 mg/mL 硫胺素1.0 mL
3 mM FeCl3400 µL
金属混合液（表 3）500 µL
H2O加至 50 mL

表2. M9培养基补充用营养混合物。

试剂用量
4 mM ZnSO4323 mg
1 mM MnSO475.5 mg
4.7 mM H3BO3145 mg
0.7 mM CuSO455.9 mg
H2O加至 500 mL

表3. 用于强化MT营养混合物的金属混合添加剂。

样品缓冲液 A1 中 1 mM E-PRD (µL)缓冲液 A 中 1 mM VimRod (µL)缓冲液 A (µL)D2O 中 200 µM DSS (µL)缓冲液 B2 (µL)总体积 (µL)
E-PRD 单独5005050350500
E-PRD + VimRod5050050350500
1缓冲液 A：20 mM Tris-HCl，1 mM DTT，pH 7
2缓冲液 B：23 mM Tris-HCl，1.14 mM DTT，pH 7

表4. 核磁共振样品制备。

讨论

二维15N分辨的核磁共振实验是展示两个分子如何相互作用的最常用方法之一。该方法信息量最丰富，能够在溶液状态下通过滴定实验连续监测两个相互作用分子的信号。尽管在大分子复合物的情况下通常为定性分析，但在有利条件下，该方法也可用于测量结合亲和力，前提是核磁共振信号能在高分辨率谱图中被追踪。当能够方便地完成信号归属时（例如分子量小于20 kDa的许多蛋白质），还可以定位结合位点。互补的实验方法（如微量热泳动，MST）可提供溶液中相互作用的定量信息，且所需未标记蛋白量较少。比较突变体的结合数据有助于提供对照，以确保核磁共振谱线展宽所揭示的相互作用是真实的，而非由聚集或黏度变化等因素引起的假象。

蛋白质表达

简化表达过程可减少耗时耗力的蛋白质生产。该优化过程的一部分包括为重组蛋白表达选择合适的E. coli菌株。菌株的选择取决于多种因素，包括所用载体的性质，更具体地说，取决于目标重组蛋白的最终稳定性7。通过使用蛋白酶缺陷型E. coli菌株（如BL21菌株），可降低内源性E. coli蛋白酶对异源蛋白降解的风险。对于含有稀有密码子的基因，可优先选用BL21-CodonPlus (DE3)RIPL等菌株。该菌株兼具BL21菌株的蛋白酶缺陷特性，并额外携带编码稀有密码子tRNA的内源拷贝，这些tRNA对应精氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和亮氨酸。 Alternatively，也可通过从商业来源订购密码子优化的构建体来避免可能影响过表达的稀有密码子。目前已有多种E. coli菌株可用于重组基因表达，每种菌株均针对表达过程中特定问题进行了优化7。在本研究中，标准的蛋白酶缺陷型菌株BL21(DE3)能够产生足量的可溶性蛋白，适用于后续的纯化与分析。

蛋白质纯化

特定蛋白质的纯化方案通常具有独特性，因为每种蛋白质在不同条件（如温度、盐浓度或pH值）下保持稳定性和溶解性的能力各不相同。通过亲和层析进行纯化的整体效果也受到洗脱物（如咪唑）浓度的影响，这种影响贯穿纯化过程的各个步骤。在本研究中，IMAC纯化过程中的关键缓冲液条件包括：E-PRD的pH值和VimRod的咪唑浓度。E-PRD在从IMAC柱初次洗脱后需维持pH 7.5，以避免发生沉淀。对于VimRod的IMAC纯化，在柱洗涤步骤中将咪唑浓度从30 mM提高到50 mM，可显著提升最终洗脱组分的纯度。在洗脱步骤中，将咪唑浓度从250 mM增加至350 mM也被发现可提高最终洗脱产物的得率。最初尝试使用250 mM咪唑进行蛋白洗脱时，导致VimRod未能完全洗脱，这一点通过后续用1 M咪唑对柱子进行剥离而得到证实（数据未显示）。将洗脱时的咪唑浓度提高至350 mM足以回收结合在柱子上的全部蛋白。超滤（S）可发挥双重作用，既可作为蛋白纯化的精纯步骤，同时又能实现缓冲液置换。缓冲液置换是后续结合分析的关键步骤，因为它可去除用于洗脱His6标签蛋白的咪唑。此外，该步骤还提供了调整盐浓度或pH等条件的机会，这些条件可能影响某些下游技术或检测的效率。蛋白热迁移实验（PTS）可用于筛选适用于下游检测的最佳缓冲液，尤其适用于那些需要蛋白在室温下长时间保持稳定的实验8,9。

结合分析

准确的结合实验依赖于新鲜制备的蛋白质，尽管只要进行结果比较，冷冻保存的蛋白质也可使用。丝状蛋白（如波形蛋白）会以依赖盐浓度和pH的方式发生多聚化，因此需要优化溶液条件，并通过尺寸排阻色谱10,11、动态光散射12或分析型超速离心13,14,15等方法评估其寡聚状态。核磁共振（NMR）波谱法适用于在原子分辨率下检测小分子蛋白质与配体的相互作用。然而，当蛋白质与较大分子相互作用时，分子翻滚速率变慢，导致信号丢失，这可以证实结合的发生，但不一定能定位结合位点，而要实现结合位点的定位，通常还需要完成至少主链共振信号的归属。在此情况下，NMR实验无法确定相互作用位点。因此，需采用定点突变技术来鉴定对结合至关重要的残基。这类突变体因而不会出现信号减弱。在本方案中，第1914位氨基酸发生取代的突变体在VimRod存在时仍保持峰强度，从而证实了E-PRD与VimRod之间相互作用的中断。若能完成主链及侧链共振信号的归属，将有助于提升该方法的价值，特别是目前游离态E-PRD的结构已通过X射线晶体学解析4。未来NMR的应用将包括对更大分子间复杂相互作用的表征，并将受益于超高场强磁体以及13C标记基团和三氟甲基等其他可观测基团作为报告基团的使用。

MST 在研究结合相互作用方面具有多项优势16。其结合组分在溶液中自由存在，无需固定化。软件内置样品质量分析功能，可对聚集、吸附到毛细管壁或靶分子荧光标记不足等问题进行质量控制报告。通常仅需使用少量靶分子，标记靶分子的浓度一般为 20–50 nM，反应体积为 10–20 μL。本方案采用极小的反应体积（10 μL），以在滴定过程中实现更高的配体浓度，从而有助于表征弱结合相互作用。这要求移液操作精确，并需小心避免引入气泡，同时确保充分混匀。在整个系列稀释过程中，充分混匀对于获得准确且一致的荧光测量结果至关重要。MST 实验中 Tween-20 的含量从标准的 0.05% 降低至 0.015%，以减少产生气泡的倾向并改善混合效果。

RED-Tris-NTA 染料为任何带有 His 标签的蛋白质提供了快速、简便且便捷的荧光标记方法。标记过程在仅30分钟内即可基本完成，且结合非常牢固，因此无需进行染料去除步骤。该方法不会对蛋白质中的氨基酸残基进行修饰，从而避免影响配体结合特性。需要注意的是，只有待标记的蛋白质应带有 His6 标签。为此，必须将标签从配体蛋白 E-PRD 上切除，并通过第二次 IMAC 柱步骤去除游离标签及未切割的 E-PRD。如果可能，应避免使用 His 标签来制备配体蛋白。 alternatively，蛋白质也可通过赖氨酸残基的胺偶联或半胱氨酸残基的巯基偶联，共价标记荧光染料。然而，使用此类系统时需格外谨慎，因为荧光染料的共价连接可能影响依赖赖氨酸或半胱氨酸残基的静电或极性结合相互作用。通过 MST 定量 VimRod 与 E-PRD 之间的结合亲和力时，结果异常地对盐浓度敏感。该问题通过将靶标和配体蛋白首先透析至同一批测定缓冲液中而得到缓解。尽管如此，由于 VimRod 的复杂行为，在含有 150 mM NaCl 的条件下进行 MST 测定时无法获得结合曲线的饱和。当 NaCl 浓度降低至 10 mM 时，获得了可靠且完整的数据，从而能够准确计算 KD 值。因此，建议仔细优化溶液条件，并结合互补的检测方法进行验证，以获得稳健的结果。此外，MST 还可用于量化特定相互作用的盐依赖性、测定蛋白质相互作用的化学计量特性、监测蛋白质折叠过程，以及研究酶动力学17。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本项目得到了授予 M.O. 的加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC RGPIN-2018-04994）、阿尔伯塔省校园创新计划（Campus Alberta Innovation Program，RCP-12-002C）以及阿尔伯塔疯牛病研究所/阿尔伯塔创新生物解决方案（Alberta Prion Research Institute / Alberta Innovates Bio Solutions，201600018）的资助，同时获得了授予代谢组学创新中心（The Metabolomics Innovation Centre, TMIC）和 NANUC 的加拿大基因组计划（Genome Canada）及加拿大创新基金会（Canada Foundation for Innovation）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Monolith NT.115，包含控制与分析软件NanoTemper TechnologiesMO-G008微量热泳动仪
His-Tag 标记试剂盒 RED-Tris-NTANanoTemper TechnologiesMO-L008用于微量热泳动的 RED-tris-NTA 荧光染料
标准毛细管NanoTemper TechnologiesMO-K022微量热泳动用毛细管
HisTrap HP，5 mLGE Healthcare17524801IMAC 层析柱
HisPur Ni-NTA 树脂，100 mLThermo Fisher Scientific88222IMAC 层析树脂
HiLoad 16/600 Superdex 75 pgGE Healthcare28989333SEC 层析柱
TEV 蛋白酶Sigma AldrichT4455用于切割 E-PRD 上的 His 标签
BL21(DE3) 感受态 E. coliNew England BiolabsC2527H用于蛋白表达的细胞
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合片剂（无 EDTA）Sigma Aldrich11873580001IMAC 蛋白纯化用蛋白酶抑制剂
TCEP，三(2-羧乙基)膦盐酸盐Sigma AldrichC4706蛋白纯化用还原剂
试剂（HEPES、NaCl 等）Sigma Aldrich各种培养基与缓冲液的配制
氯化铵（15N，99%）Cambridge Isotope LaboratoriesNLM-467NMR 用同位素标记
D2O，重水（D，99.8%）Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-2259NMR 样品制备
DSS，2,2-二甲基-2-硅代戊烷-5-磺酸钠-D6（D，98%）Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-8206NMR 参比物质
精密 5 mm NMR 管，7” 长SJM/DeuterotubesBOROECO-5-7NMR 管
NMR 波谱仪（14.1 特斯拉）BrukerNMR 数据采集
TCI 5 mm z-PFG 低温探头BrukerNMR 数据采集
名称公司目录编号备注
软件
Bruker TopSpin 4.0.1BrukerNMR 数据处理
MO.ControlNanoTemper Technologies随 Monolith NT.115 提供
MO.Affinity AnalysisNanoTemper Technologies随 Monolith NT.115 提供

参考文献

  1. Vinogradova, O., Qin, J. NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions. Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).
  2. McKercher, M. A., Wuttke, D. S. NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions. Methods in Molecular Biology. 1555, Clifton, N.J. 269-290 (2017).
  3. Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases. Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).
  4. Fogl, C., et al. Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin. Nature Communications. 7, (2016).
  5. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , 2nd ed, Humana Press. (2002).
  6. Wishart, D. S., et al. 1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR. J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).
  7. Casali, N. Escherichia coli Host Strains. E. coli Plasmid Vectors. , Humana Press. 27-48 (2003).
  8. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  9. Kozak, S., et al. Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays. Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).
  10. Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. , In Press (2018).
  11. Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  12. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  13. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  14. Pearson, J. Z., et al. Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 1-26 (2015).
  15. Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B. Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 27-47 (2015).
  16. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100(2010).
  17. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).

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