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利用小角X射线散射研究溶液中大分子的结构

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DOI：

10.3791/58538

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2018年11月5日

 ,  ,  , 
1Alberta RNA Research and Training Institute, Department of Chemistry and Biochemistry, University of Lethbridge, 2Department of Biochemistry, University of Alberta, 3Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 4DiscoveryLab, Faculty of Medicine & Dentistry, University of Alberta

本文内容

摘要

本文介绍了如何利用小角X射线散射（SAXS）获取代表大分子结构的低分辨率分子包络信息。当SAXS与X射线晶体学和核磁共振等高分辨率结构技术结合使用时，可提供溶液中多结构域蛋白及大分子复合物的详细结构信息。

摘要

涉及多个球状结构域蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用在确定此类复合物如何形成以及各结构域如何定向/定位方面存在技术挑战。本文描述了一种有望通过从头建模（ab initio modeling）揭示多组分系统中具体由哪些结构域介导相互作用的实验方案。该方法通过整合小角X射线散射（SAXS）、色谱学以及原子分辨率结构数据，采用混合策略计算生物大分子及其组装体在溶液中的结构。一个具体实例是全长nidogen-1蛋白的复合物，该蛋白可组装细胞外基质蛋白并形成一种延伸且弯曲的纳米结构。其一个球状结构域可结合层粘连蛋白γ-1（laminin γ-1），后者参与基底膜的结构构建。该方法为确定柔性多结构域蛋白复合物的精确结构提供了基础，且得益于同步辐射光源与自动化机器人系统及尺寸排阻色谱系统的联用。这种组合实现了快速分析，在SAXS数据采集前即可分离多种寡聚状态。分析结果可提供回转半径、粒子尺寸、分子形状以及结构域间配对等信息。本文还给出了通过拟合组分蛋白的高分辨率结构来生成复合物三维模型的实验方案。

引言

细胞内含有复杂的蛋白质网络，这些蛋白质作为分子机器，执行信号级联和维持结构完整性等细胞功能。这些不同组分在三维空间中的运动和相互作用方式决定了大分子的特定功能。蛋白质结构、动力学和相互作用在决定其功能方面的重要性，促使人们不断开发出日益复杂的技术来测量这些特性。其中，核磁共振（NMR）、X射线晶体学（XRC）以及近年来兴起的冷冻电子显微镜（CEM）可提供高分辨率的结构信息。然而，XRC和CEM仅能获得多种生物分子状态中的某一种结构，且缺乏关于蛋白质结构动态变化的信息；而通过NMR进行三维结构测定通常仅限于较小的球状蛋白质。克服这些局限性的一种方法是利用小角X射线散射（SAXS）来生成大分子、多结构域或复合体系的分子包络，并将高分辨率的刚性大分子结构与其结合，从而阐明其整体构架和动态特征。

小角X射线散射（SAXS）可生成大分子复合物的低分辨率电子密度包络图，分辨率为约10–20 Å 1，不仅能够揭示其结构特征，还能提供该复合物所呈现的动态特性信息。尽管SAXS利用X射线来解析分子结构，但与X射线晶体学（XRC）不同，溶液中粒子呈随机各向同性取向，不会产生衍射，而是发生散射，因此无法获得原子级分辨率。相反，SAXS生成的是大分子的电子“包络”，代表了该大分子所呈现构象的平均状态。这些信息可用于直接拟合已知的原子分辨率结构，以推断单个蛋白质中的柔性区域或亚基排列，或分析更大规模多蛋白复合物的动态行为。SAXS数据通常在同步辐射装置上使用高能单色X射线采集，也可在实验室自备光源上获取，但后者X射线强度较弱，所需样品曝光时间以小时计，远长于同步辐射的秒级时间（图1）。SAXS实验通常在同一批次中使用相同的实验设置和缓冲液采集多个样品的数据，因此收集一套完整且有用的数据需要较长时间。因此，样品必须保持稳定且不发生聚集，至少维持数小时，其稳定性需通过动态光散射（DLS）和/或分析型超速离心（AUC）等可验证的质量控制方法加以确认，以获得高质量的SAXS数据2,3。本文将对SAXS技术提供一个实用性的介绍，涵盖其应用原理、优势与局限性、样品制备方法，并重点阐述数据采集与分析过程，同时以细胞外基质蛋白nidogen-1和laminin γ-1为实验示例，简要介绍从头建模（ab initio modeling）的应用。

SAXS 的原理、优势与局限性：

SAXS 背后的基本原理相对简单：将感兴趣的单一分散的大分子溶液置于毛细管中，并暴露于高能单色X射线束下。光子使原子壳层中的电子开始振荡，从而发射出具有相同能量和波长的球面波。由于每个电子都会发生振荡，因此会产生一个恒定的背景信号，而大分子的电子密度则与该背景形成对比。所得到的散射强度作为散射角 2Θ 的函数被收集（图1）。

尽管其他技术（如XRC、NMR和CEM）可提供原子级别的结构信息，但SAXS具有多种其他技术无法提供的优势。SAXS几乎可在任何缓冲液中进行，且无需特殊的样品制备。这对于研究大分子在不同条件下的行为与结构尤为重要，例如在存在或不存在单价或二价阳离子、或pH值变化的情况下4,5。SAXS能够提供有关大分子柔性区域的信息6，而其他所列技术在这一点上往往存在困难。因此，SAXS可作为一种强有力的互补技术，与XRC、NMR或CEM联合使用：利用XRC、NMR或CEM研究大分子的稳定部分，同时利用SAXS对完整的大分子或复合物进行低分辨率分析，并通过FoXSDock7或CRYSOL8等分析工具整合结果。由于SAXS是一种溶液相技术，常被用于验证XRC等方法获得的静态结构在溶液中是否保持一致6。此外，SAXS还具有所需样品量较少（通常为50–100 µL）和实验时间较短（30分钟至1小时）的优点。

SAXS 最大的局限性在于样品容易发生聚集和/或降解，这可能导致结构预测错误。即使仅有 5% 的聚集，也会产生强烈的散射信号，从而高估粒子的最大尺寸（Dmax）和回转半径（Rg）。相反，样品降解则可能导致对分子特性的低估。这种敏感性源于 SAXS 是一种基于平均效应的技术，这意味着样品的均一性对于获得可靠且可重复的结果至关重要。因此，任何拟用于 SAXS 分析的样品都应经过多种纯化和均一性检测方法的验证，例如变性与非变性凝胶电泳、尺寸排阻色谱、动态光散射以及分析型超速离心。通常，SAXS 光束线会在 SAXS 测量前（即 S-SAXS）通过高效液相色谱对样品进行最终的质量控制3,9。SAXS 数据应在多个浓度下采集，并比较每组数据的 Rg 值，确保其高度相似，以避免粒子间相互作用和聚集，这些因素会导致粒子尺寸被高估，进而造成数据分析与建模的不准确。由于散射强度同时依赖于浓度和尺寸，较小的大分子可能需要更精确地优化浓度范围。这是由于“互易性定理”（Reciprocity Theorem）的作用：大尺寸粒子主要在小角度区域散射，而小尺寸粒子则在大角度区域散射。这一现象体现在数据采集过程中，即 IO 与 R6 成正比，其中 R 为粒子半径。SAXS 的另一个最终局限是样品在照射过程中可能发生辐射损伤，从而导致数据失真。良好的实验实践应包括在 SAXS 测量前后对比样品质量，以确认未发生此类损伤。

方案

1. SAXS 样品制备与数据采集

  1. 样品制备：
    1. SAXS 实验需要均一、稳定且不发生聚集的蛋白质样品；在采集数据之前，应通过尺寸排阻色谱（S）、动态光散射（DLS）和/或分析超速离心（AUC）来观察样品的稳定性和寡聚状态。
    2. 对样品（本实验中为 nidogen-1 和 laminin γ-1）进行 DLS 分析和三羟甲基甘氨酸 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（tricine SDS-PAGE），以评估样品纯度10。
      注意：样品浓度范围可能因分子大小、溶液行为（如自缔合和聚集）以及稳定性而异（1–4 mg/mL）；此处制备了五种浓度的 nidogen-1（139 kDa）、三种浓度的 laminin γ-1（109 kDa）以及四种经 S 柱纯化的等摩尔复合物样品，制备方法如前所述10。
  2. 数据采集：
    1. 根据仪器制造商或设施的操作指南，使用实验室 SAXS 系统或同步辐射光源采集 SAXS 数据。
      注意：本研究中使用的数据是通过一台实验室系统（见材料表）采集的，该系统配备三针孔相机、+002 微焦点密封管（Cu Kα 辐射，波长 1.54 Å）和在 40 W 下运行的共焦最大通量（CMF）光学组件。系统还配备了一个 200 nm 多丝二维探测器用于数据采集。然而，随着法国、德国、英国、美国及其他国家现代同步辐射设施的普及，这些设施提供小角 X 射线散射（S-SAXS）装置，可有效区分单分散样品与可能存在的聚集或降解组分，因此我们目前常规在同步辐射设施上采集数据。最近发表的一篇关于 DNA G-四链体的研究11即采用了 S-SAXS 数据采集策略。本实验中，SAXS 数据采集范围为 0.08 ≤ q ≤ 0.26 Å，采集时间 3 小时，nidogen-1 样品浓度分别为 2.0、2.5、3.0、3.5 和 4.0 mg/mL；laminin γ-1 样品浓度分别为 1.5、2.0 和 2.5 mg/mL；其复合物样品浓度分别为 0.8、1.0、1.25 和 1.5 mg/mL。
    2. 使用特定系统的数据处理软件对缓冲液和样品数据进行归约，并使用 PRIMUS/qt12 等程序从蛋白质数据中扣除缓冲液背景贡献（图 2A）。

2. 数据分析

注意：目前有几种软件包可用于SAXS数据分析：ScÅtter43（可在www.bioisis.net下载）、bioXtas RAW44以及ATSAS软件套件13。本节概述了使用ATSAS程序套件分析原始SAXS数据的一般步骤，具体操作基于ATSAS 2.8.1版本的下载内容。其他程序也可使用，后文将简要讨论。

  1. 缓冲液减法
    注意：这些步骤仅适用于静态小角X射线散射（SAXS）样品。
    1. 在 PRIMUS/qt 中选择“OPEN”菜单选项，并选择感兴趣的数据文件。注意数据文件必须为 ASCII 格式，其中第一列为 s-矢量轴，第二列为强度值。对于缓冲液本身所采集的数据，通过在同一菜单中插入该数据重复此步骤。
    2. 在数据处理窗口中选择“SUBTRACT”，这将生成仅表示目标大分子散射的减除散射曲线。对每个浓度重复此步骤。
  2. 冈纳分析
    1. 进行吉尼尔分析时，按照步骤2.1.1中所述方法，将扣除缓冲液的散射曲线载入PRIMUS/qt软件中。
    2. 点击“回转半径”，将启动 Primus Guinier 向导；生成一张 ln(I) 与 q2 将显示。
    3. 初步获取 Rg 使用“AUTORG”功能，该功能是内置于 PRIMUS/qt 中的一个外部模块。找到 "自动光栅" 按钮并单击它。
    4. 通过同时选中多个文件，并将它们插入右侧菜单中，一次性输入多个文件，操作方式与 2.1.1 节非常相似。
    5. 利用先前创建的Guinier图评估数据质量；Guinier图下方的绿色线表示残差图，反映拟合的线性程度。需注意，若Guinier分析中出现非线性，可能提示样品存在聚集现象，此时不应进行后续分析。
      注意：线性Guinier拟合可提供一个 Rg 存在微小误差（<5%），表明样品质量较高。
  3. 克雷特基分析
    1. 以与上述类似的方式加载待可视化数据。
    2. 单击数据文件名旁边的“SELECT BOX”。这将在一个单独的窗口中绘制该数据。
    3. 单击“PLOT”按钮，然后在下拉菜单中选择“Kartky Plot”。
    4. 这将把数据绘制成“q2 x L(q) 与 q注意，球状蛋白质会呈现高斯峰，而未折叠的蛋白质则不会出现峰，而是呈现平台状，类似于双曲线图。17.
  4. 数据合并
    1. 按照步骤2.1.1中的方法，再次在PRIMUS/qt中载入每个浓度的缓冲液扣除后的数据。
    2. 要合并数据，只需单击处理窗口中的“MERGE”按钮。
    3. 检查每条曲线及其对应的 I 值刻度数，该数值与原始样本的稀释倍数相关。
      注意：浓度较高的样品在曲线尾部区域表现出的噪声更小。
  5. P(r) 分布
    1. 为生成P(r)图，按照之前所述方法将合并后的数据曲线载入PRIMUS/qt中。
    2. 单击“距离分布”按钮，打开一个新窗口，显示散射光强度的合并数据 与 q 右侧为对距离分布函数图。
      注意：右侧信息展示了对距离分布函数计算的整体质量评估。
    3. 调整合并数据的数据范围，以避免原始数据尾部存在明显噪声。
    4. 省略低q区域中靠近光束挡板的数据点。
    5. 为了确定 D最大值, 从约5倍的范围开始 Rg 通过Guinier分析获得。逐渐减小该值，直至P(r)曲线在Y轴上不再突然降至零，并且在接近零之前不出现长拖尾。
    6. 检查实验 Rg/我0 （源自Guinier近似）和 P(r) Rg/我0 数字相似。
      注意：在某些情况下，还需进一步调整数据范围、数据点以及 ALPHA（一个正则化参数，用于指示程序在拟合实验数据与关注分布平滑性之间的权衡比例）。21 获得高质量 P(r) 图

3. A从头算 珠粒建模与平均化

  1. 在合并多个浓度下收集的数据，或最小化使用S-SAXS收集的数据，并验证Kratky图、P(r)图和Guinier分析结果后，计算大分子及其复合物的低分辨率结构。该流程可用于研究核酸、蛋白质以及核酸-蛋白质或蛋白质-蛋白质复合物在溶液中的结构与相互作用10,11,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34。其中最受欢迎的程序之一是Svergun开发的DAMMIN35，它是ATSAS软件包13的一部分，采用基于Rg和Dmax的初始输入信息的模拟退火算法。ab initio建模方法及其原理在其他文献中有详细描述18,36。

结果

采用上述数据分析方法，利用 P(r) 函数计算了 nidogen-1、laminin γ-1 及其复合物的 Rg 和 Dmax。测得 nidogen-1、laminin γ-1 及其复合物的 Rg 值分别为 7.20 (±0.10) nm、8.10 (±0.20) nm 和 10.9 (±0.4) nm（图 2A-B）。此外，测得 nidogen-1、laminin γ-1 及其复合物的 Dmax 值分别为 24 nm、26 nm 和 35 nm（图 2）10。使用 DAMMIF 程序获得了 nidogen-1 和 laminin γ-1 的低分辨率结构，结果表明这两种蛋白在溶液中均呈现伸展构象。nidogen-1（约 1 和 0.8）和 laminin γ-1（约 0.9 和 0.8）的 X 值和 NSD 值也均处于可接受范围内。通过将高分辨率结构（包括 nidogen-1 的两个结构域和 laminin γ-1 的两个结构域）与 SAXS 获得的低分辨率结构进行比对，可识别出它们的 N 端和 C 端区域10。

层粘连蛋白γ-1的相互作用蛋白被鉴定为nidogen-139,40，并通过X射线晶体学将相互作用位点定位于C末端结构域41。然而，高分辨率结构仅包含相互作用的结构域，而不包括全长的nidogen-1或完整的层粘连蛋白γ-1臂。因此，我们纯化了包含nidogen-1（全长）和层粘连蛋白γ-1臂的复合物，以确定相互作用区域，并研究两种蛋白N末端结构域之间的相对空间取向。该复合物的SAXS数据得到的Rg为10.9（±0.4）nm，Dmax为35 nm。我们利用MONSA获得了整个复合物的低分辨率结构，结果表明，确实只有两种蛋白的C末端区域参与介导相互作用，而其余结构域彼此相距较远（图3，视频1）。

使用 ATSAS 进行大分子建模的 X 射线散射图；吸收、建模、分析
图1。 SAXS 实验装置示意图。首先制备单一分散的生物大分子或其复合物样品，随后用高能X射线照射。根据光源的不同（例如，内部 与 同步辐射），X射线的能量以及样品到光源的距离可以变化。记录X射线的散射图样（该图样取决于生物大分子的大小和形状），并进行径向平均，得到一条一维图谱（1D），其中包含散射光强随散射角变化的信息。由于缓冲液中的分子也会产生散射，需减去这些分子的贡献，以获得目标生物大分子的散射图样。在同步辐射光源处，进行小角X射线散射（SAXS）数据采集之前，通常还需进行一步在线尺寸排阻/高效液相色谱纯化（俯视图）。该步骤对于去除可能存在的聚集体或降解产物，以及从复合物中去除未结合的生物大分子至关重要。将一维散射图谱转换为电子对距离分布图（P(r) 图，用于提供生物大分子的回转半径和最大粒子尺寸。该图将作为输入文件用于 从头算 建模软件包（即， DAMMIN/DAMMIF）以获得生物大分子的低分辨率结构，或其他软件包（即， SASREF/CORAL）如果已知复合物中部分生物分子或单个生物分子的高分辨率结构。  请点击此处以查看此图的放大版本。

小角X射线散射结果；复合物、nidogen-1、层粘连蛋白γ1的数据分析与拟合图
图2. (A) 散射光强度的图谱 与 散射角（q=4πsinθ/λ，nm-1）表明生物分子的质量（低区域）和形状（高区域）。(B) 电子对距离分布 P(r) 由散射数据确定的参数表明，所研究的生物大分子（层粘连蛋白 γ-1、nidogen-1 及其复合物）具有伸长的形状。(C) Kratky 图显示 nidogen-1 和层粘连蛋白 γ-1 蛋白未发生解折叠。(D) nidogen-1、层粘连蛋白 γ-1 及其复合物的 Guinier 图，显示低散射角区域的线性范围，用于确定回转半径。 请点击此处以查看此图的放大版本。

蛋白质折叠示意图，分子结构的180度旋转，教育与科研用途。
图3. 通过使用程序MONSA分析合并数据集获得的nidogen-1与层粘连蛋白γ-1复合物的低分辨率结构。颜色方案与图2相同。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质-配体相互作用的分子建模；三维结构分析，生物化学研究。
视频 1. nidogen-1 与层粘连蛋白 γ-1 复合物的低分辨率结构。该视频使用 PYMOL 制作，用于展示该复合物的各种结构特征。图中以丝带图形式展示层粘连蛋白-nidogen 复合物的晶体结构（PDB ID: 1NPE），并突出显示该复合物的相互作用位点。颜色方案与图 2相同。请点击此处观看视频。（右键可下载。）

讨论

本文方案部分概述的SAXS数据分析关键步骤包括缓冲液扣除、Guinier分析、Kratky分析、数据合并以及P(r)分布分析。ab initio珠模型构建过程过于复杂，此处无法详尽涵盖，仅作简要介绍。

在同步辐射装置（例如德国的DESY、英国的DIAMOND和法国的ESRF）上，可以在样品从在线连接的色谱柱洗脱的同时，对每个组分的极小体积（约几 µL）进行SAXS数据采集（参见图1）。弹性散射的SAXS数据在扣除缓冲液背景之前，需使用仪器制造商或同步辐射中心提供的软件包进行径向平均。所得的一维数据在Y轴上表示散射光强（即I(q)），在横轴上表示散射角（q=4πsinθ/λ，其中λ为入射X射线的波长），如图1所示。PRIMUS/qt12程序用于直接扣除缓冲液引起的背景信号，具体方法见第1.1节。其他程序如ScÅtter43（可在www.bioisis.net下载，教程见https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA）和bioXtas RAW44（可在https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html获取）也可作为ATSAS软件包的替代方案使用。

Guinier 分析可根据小角X射线散射（SAXS）数据的低 s 区域提供有关样品聚集性和均一性的信息，并给出目标大分子的回转半径（Rg）14。使用 PRIMUS/qt 对每个浓度下获得的 SAXS 数据绘制曲线图，随后在 q × Rg 最大范围达 1.30 的条件下进行曲线拟合。单分散样品的制备在此区域内应呈现线性 Guinier 图（图 2D），而发生聚集的样品则会导致非线性 Guinier 图15,16。若 Guinier 分析呈线性，可通过 Kratky 图观察目标大分子的“未折叠程度”，这有助于判断是否进行刚体建模或构建低分辨率模型的集合体。球状蛋白在 Kratky 图中表现为钟形曲线，而伸展的分子或未折叠的多肽则在较大的 q 范围内呈现平台状甚至上升趋势，且缺乏钟形特征（图 2C）。

通过Guinier分析获得Rg仅考虑一维散射图低q区域的数据点（图2D），然而，也可以利用几乎整个数据集进行间接傅里叶变换，将ln(I(q)) vs. (q)的倒易空间信息转换为实空间距离分布函数（P(r)），从而提供关于Dmax和Rg的信息（图2B）。P(r)曲线的形状反映了目标大分子在溶液中的整体构象18,19。将倒易空间数据转换为实空间数据是关键步骤，但其详细描述不在本文范围之内。因此，可参考Svergun20的文章以了解各个参数的具体含义。

当各个浓度下的缓冲液扣除数据通过一致的Rg值进行Guinier分析处理，并随后利用Kratky分析考察其折叠模式后，这些数据即可合并。nidogen-1、laminin γ-1及其复合物的合并数据均按上述方法处理，所得P(r)图谱如图2B所示。理想情况下，还应针对每个浓度计算其对距离分布函数P(r)，以判断在不同浓度下采集的SAXS数据是否给出相似的Rg和Dmax值。若Rg和Dmax在较宽浓度范围内保持一致，则可继续后续操作。需要注意的是，根据信号强弱，可在数据合并前对数据进行截断处理，当被研究的大分子浓度较低和/或分子量较小时，通常需要如此操作。

使用 DAMMIN 进行低分辨率形状分析时可采用多种模式（例如 快速、慢速、专家模式， 等等。）。快速模式是评估P(r)曲线是否能提供高质量模型的理想第一步。通常，每条P(r)曲线应至少获得10个模型，以检查在低分辨率结构方面是否得到可重复的结果，并具有较低的拟合优度参数，称为 χ （根据我们的大量研究，0.5–1.0 的值被视为良好），该值用于描述实验采集的 SAXS 数据与模型衍生数据之间的一致性。出于发表目的，我们通常采用 Slow 或 Expert 模式，并至少计算 15 个模型。除了 DAMMIN 外，还使用其更快的版本 DAMMIF37，以及 GASBOR38 也是可行的选择。此外，为了研究蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸复合物，可以使用 MONSA 程序35，这有助于同时拟合两种大分子及其复合物的单个SAXS数据。有关高分辨率模型计算以及RNA-蛋白质相互作用研究的更多细节，可参考Patel近期发表的一篇文章 等3.

SAXS 在理论上很简单，但无疑是其他结构生物学工具的高度互补方法，可提供低分辨率的结构数据，这些数据可单独使用，也可与高分辨率技术结合使用，以阐明大分子结构与动力学的相关信息。只要能够获得单一分散的大分子及其复合物样品，SAXS 即可用于研究任何类型生物大分子在溶液中的结构与相互作用。以本研究中讨论的复合物为例，令人关注的是，在该复合物中，nidogen-1 和层粘连蛋白 γ-1 的总体可及表面积中仅有不到 10% 被埋藏，而两种蛋白的其余结构域仍可自由地与细胞外基质中的其他蛋白相互作用，从而维持其结构刚性（图 3）。对于分子量约为 240 kDa 的复合物，若采用 X 射线晶体学、核磁共振（NMR）或冷冻电镜（Cryo-EM）等其他结构生物学技术获取此类信息，将极具挑战性。

通过X射线晶体学或核磁共振（NMR）解析蛋白质结构本质上是一个耗时的过程。在结构测定的瓶颈方面，小角X射线散射（SAXS）作为一种结构分析技术展现出其独特优势；单次SAXS实验的数据采集可在一小时之内完成，再辅以流程化的分析软件，即可实现快速而高效的分析。SAXS作为一种独立的技术，有望显著提高结构研究的通量，因为它能够在高分辨率数据获得之前提供大分子结构的低分辨率模型。其他结构技术面临的一个障碍是数据采集需要高度纯净且浓度较高的样品，这要求蛋白质在较长时间内具有高水平的表达和稳定性。尽管SAXS样品同样需要高纯度和高浓度，但其所需样品体积约为100 µL，因此与其他结构技术相比，SAXS是一种相对低成本的分析方法。此外，SAXS与尺寸排阻色谱联用正变得日益普遍，从而增加了额外的质量控制步骤。近年来，利用系综优化方法（Ensemble Optimization Method, EOM）45，46整合NMR与SAXS数据以解析柔性系统取得了显著进展。在Mertens和Svergun近期发表的一篇论文中47，作者描述了多个EOM-SAXS与NMR联合应用的最新实例，以及大量SAXS数据与NMR结合使用的其他案例。SAXS领域持续取得进展，新的技术正在不断开发，使SAXS不仅作为补充手段，更能够与其他结构技术协同使用。因此，我们认为SAXS的需求将随时间推移而持续增长，尤其是在与NMR联用以表征由柔性决定功能的动态系统方面。

披露

作者无任何披露事项。

致谢

本项目得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC RGPIN-2018-04994）、阿尔伯塔省校园创新计划（Campus Alberta Innovation Program，RCP-12-002C）以及阿尔伯塔疯牛病研究所/阿尔伯塔创新生物解决方案（Alberta Prion Research Institute / Alberta Innovates Bio Solutions，201600018）向 M.O. 提供的资助。TRP 是加拿大RNA研究首席科学家 & 蛋白质生物物理学 (201704)，并感谢NSERC发现基金（RGPIN-2017-04003）的支持。TM由TRP获得的NSERC发现基金资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HEK 293 EBNA 细胞系实验室内部可获取-用于过表达蛋白的细胞系
Ni Sepharose High Performance 组氨酸标签蛋白纯化树脂GE Healthcare17524801亲和蛋白纯化树脂
Superdex 200 Increase 10/300GE Healthcare28990944SEC 柱
ÄKTA Pure FPLCGE Healthcare-FPLC 系统
NanodropNanodrop-分光光度计
基础试剂（NaCl、Tris-HCl 等）
S-MAX3000Rigaku-SAXS 针孔相机系统
Zetasizer Nano-SMalvern Instruments Ltd-动态光散射仪
0.1µm 滤膜MilliporeJVWP04700用于 DLS 前样品浓缩
凝血酶切割试剂盒abcamab207000凝血酶切割以去除 His 标签
Strep-Tactin Sepharose 柱IBA2-1201-010Strep-Tag 亲和纯化
D-脱硫生物素Sigma-Aldrich533-48-2Strep 标签蛋白的洗脱
软件
SAXGUIRigaku-SAXS 数据采集与数据约简
ATSAS 套件Franke 等, 2017-SAXS 数据分析软件套件
PRIMUSKonarev 等, 2003-缓冲液扣除
GNOMSvergun, 1992-Rg、Dmax 和 p(r) 计算
DAMMIFFranke 和 Svergun, 2009-从头计算模型
DAMAVERVolkov 和 Svergun, 2003-平均溶液构象计算
MONSASvergun, 1999-复合物的同步模型拟合
GASBORSvergun 等, 2001-替代的从头模型计算
DTS 软件 V6.20Malvern Instruments Ltd-DLS 配套仪器软件
PyMOLSchrodinger, LLC.-PyMOL 分子图形系统 V2.0
蛋白质数据库Berman 等, 2000-PDB 编号：1NPE

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