用于玻璃化和变暖步骤中囊胚行为客观评估的形态学协议

Summary

在这里, 我们提出了一个延时形态测量方案, 以跟踪在预防干预和升温后恢复过程中囊胚收缩和再膨胀的强度。该方案可在配备延时显微镜的体外受精实验室中应用, 并建议在开发最佳囊胚玻璃化方法时使用。

Abstract

本文介绍了基于延时显微摄影的非侵入性囊胚形态测量方法, 以准确监测玻璃化前后各个阶段囊胚体积的变化。该方法可用于通过观察玻璃化前后不同阶段的囊胚收缩和再膨胀, 寻找最佳的囊胚接触不同浓度的低温保护剂的最佳时机。利用该方法, 可以优化囊胚玻璃化方案。为了更好地证明这种形态测量方法的有效性, 比较了两种不同的玻璃化囊胚制备方案;一个使用人工囊胚崩溃和一个没有这种干预前玻璃化。两个囊胚的体积变化之后是延时微摄影, 并通过照片编辑软件工具进行测量。测量每20秒在预防阶段进行一次, 在变暖后每5分钟进行一次。每个时间单位的囊胚尺寸的变化在线形图中以图形方式呈现。结果表明, 在一个漫长的平衡脱效阶段, 完整的囊胚先收缩, 然后慢慢地补充囊胚, 进入玻璃化与充满液体的囊胚。人工塌陷的囊胚在整个平衡阶段保持在其萎缩阶段。在玻璃化阶段, 它也不会改变其体积。由于囊胚形态测量显示在预防步骤中人为塌陷的囊胚的恒定体积, 看来这个阶段可能会更短。该协议根据体积变化的速度和强度、部分囊胚收缩次数或全囊胚, 提供了冷冻保存期间和之后囊胚行为的许多附加比较参数塌陷, 和时间到一个总的囊胚重新膨胀或时间孵化。

Introduction

从体外受精计划 (ivf) 中对人类植入前胚胎进行冷冻保存是当今大多数试管授精实验室的常规做法。缓慢胚胎冷冻方法于1985年开始临床使用, 引入了特定的低温保护剂和计算机控制的冰柜, 使胚胎的冷却控制低至-7°c, 当冰核 (播种) 诱导在周围的低温保护介质¹。通过连续冷却, 冰晶会生长, 导致剩余液体部分的高渗透性, 从而导致胚胎细胞的脱水和收缩。在-30°c 或-80°c 时, 胚胎会进入液氮进行更长的储存。只有经过特殊调整的冷冻显微镜才能观察到冷却过程中胚胎或卵母细胞发生的情况, 这有助于改进冷冻保存方案²。冷冻囊胚, 一个较高的体积和更多的含液的胚胎阶段, 在这几天的临床结果^不太乐观3。

囊胚冷冻保存的突破是引入了玻璃化方法, 即利用高浓度的低温保护剂^在冷却前对细胞进行脱水。在玻璃化之前, 也可以通过在两个营养体细胞5之间进行机械开口来去除囊胚细胞^中的液体。玻璃化和变暖后的直接囊胚存活率在90% 以上, 而玻璃化/加热囊胚进入子宫腔后的临床结果几乎与新鲜移植后的结果相当胚胎, 这种冷冻保存方法还没有标准化^6,7。玻璃化协议因 (a) 低温保护剂的类型和浓度、(b) 预防步骤的数量、(c) 个别步骤的持续时间、(d) 在玻璃化或不玻璃化之前使用人工囊胚而有所不同, (e)塌陷方法, (f) 囊胚扩张阶段, (g) 平衡玻璃化温度, 胚胎应在该温度下进行玻璃化 8.由于低温保护剂对细胞可能有毒, 因此必须很好地确定囊胚接触这些溶液的时间。但是, 一些冷冻保存介质制造商允许非常灵活的协议。

科学家们的兴趣通常集中在研究囊胚再膨胀能力上, 目的是寻找新的生物标志物, 更好地预测植入 6^、9、10.当冷冻保护剂必须从细胞中去除时, 人类囊胚如何在玻璃化前加入低温保护剂的不同步骤脱水, 以及玻璃化和升温后囊胚会发生什么, 以及囊胚如何补充水分和变暖后重新扩张, 没有很好的描述, 也没有很好的理解。因此, 制定一种方法, 对不同冷冻保存步骤中的囊胚行为进行客观和量化的监测, 是合理的。

随着不同制造商的延时显微镜, 现在可以监测玻璃化前后的囊胚的行为。通过包括额外的计算机工具, 也可以对其大小进行测量 (形态测量)。通过测量胚胎大小在给定时间的减少或增加, 可以将脱水和补液过程中胚胎形态动力学的评价客观化。

Protocol

这里描述的所有方法都已于2016年4月19日获得国家医学伦理委员会的批准 (第0120–204/204-2 号)。

1. 显微镜记录系统的设置

1. 关掉显微镜的加热板。
2. 在进行任何治疗之前, 在配备摄像头的倒置显微镜下拍摄囊胚的快照。记得要注意记录囊胚的放大倍率。

2. 玻璃化囊胚的选择和准备

1. 选择完全膨胀的一天-5 或日-6 囊胚进行冷冻保存, 至少有几个内细胞质量 (icm) 细胞和内聚细胞。
2. 对于具有塌陷囊胚的激光处理囊胚, 将囊胚置于短激光脉冲 (0.4-0.7 ms) 下, 孔直径从4.3 到9.4 微米不等, 向切瓦区定向, 并位于两个相邻的营养细胞的交界处。让囊胚完全或部分塌陷5分钟。
3. 对于未处理的囊胚与完整的囊胚, 在玻璃化之前不进行特殊的处理。
   注意: 这些囊胚被认为是完整的。

3. 平衡相低温保护剂和培养皿的制备

1. 使用移液器进行卵母细胞剥蚀 (直径 135μm) 无菌填充平衡介质 (m-199 hepes 缓冲介质, 具有 7.5% dmso, 7.5% 乙二醇, 20% dss) 进入专门为9井 petri 菜的微滴区域的孔延时显微镜和记录。
   注: 卵母细胞剥蚀是去除卵母细胞周围积液细胞的过程。使用移液器进行卵母细胞剥蚀将有助于避免气泡的产生。
2. 用30μl 的平衡介质覆盖微滴区域。

4. 平衡溶液中囊胚的转移

1. 将经过激光处理或完整的囊胚浸入微滴盘微滴区域底部的平衡介质中 10分钟 (平衡阶段)。
2. 一旦囊胚转移到平衡介质, 就开始10分钟的倒计时。

5. 在平衡阶段记录囊胚

1. 将带有囊胚的微滴盘转移到配备摄像头的显微镜上。使用与以前相同的放大倍率来拍摄同一囊胚的快照。放置微滴盘, 使囊胚大致位于录音的中心。
2. 使用显微镜记录软件开始录制。请注意开始录制的倒计时时间。
   注: 请参阅在10分钟暴露于平衡溶液期间记录完整 (图 1,视频 1) 和塌陷囊胚 (图 2,视频 2) 的代表性结果。

6. 囊胚的玻璃化

1. 在倒计时结束前 2分钟, 在 petri 培养皿中, 无源地分配50μl 滴的玻璃化溶液 (m-199 hepes 缓冲介质, 含 15% dmso、15% 乙二醇、20% dss、0.5m 蔗糖)。
2. 10分钟倒计时结束后停止记录, 并在室温下将囊胚快速转移到玻璃化溶液中30秒。
3. 在玻璃化溶液中, 将囊胚轻轻移液至少1x。
4. 使用玻璃化秸秆加载囊胚。在80秒内将玻璃化秸秆装入液氮 (ln), 在最初接触玻璃化溶液后不超过110秒。

7. 平衡阶段记录的囊胚的视频编辑

1. 将录制的视频文件导入到视频编辑软件中。
2. 将时间线滑块移动到 20秒. 此时请注意帧号。
   注意: 此数字将用于抽取不必要的视频帧。每20秒才会使用一个帧。
3. 单击 "视频" 选项卡, 然后单击 "帧速率...".在"帧速率转换" 下, 按字段检查 "小数", 然后输入前面提到的帧号。单击 "确定" 进行确认。单击"文件" → "导出" → "图像序列"。
4. 选择 jpeg 作为输出格式, 将目录设置为保存保存的图像序列, 然后单击 "确定"。
   注: 这将创建一个目录, 在玻璃化的平衡阶段, 按顺序记录的囊胚的图像最多30张。

8. 从平衡阶段产生的图像中测量囊胚的横截面面积

1. 打开视频分析软件。单击 "窗口" 选项卡, 然后选择"时间轴"。
2. 在 "时间轴" 窗格中, 单击胶片条形标志, 然后选择"添加介质..." , 在玻璃化的平衡阶段之前 (如果有的话) 和激光干预之前添加囊胚的图像。
   注: 这张图片将显示囊胚在其最膨胀的状态和它的横截面面积将作为参考。
3. 添加以前用视频编辑软件 (玻璃化的平衡阶段) 生成的相应囊胚的图像序列。
4. 转到"图像→分析" →选择 "数据点 " → "自定义" 以打开"选择数据点" 窗口.
5. 取消选择所有数据点, 然后只选择"区域",然后单击 "确定"进行确认。
6. 将 "时间轴" 窗口中的时间线滑块移动到第一张图像。
7. 单击 "窗口" 选项卡, 然后选择"工具"。
   注意: 这将激活左侧的 "工具" 面板。
8. 选择快速选择工具。
9. 将工具标记放置在囊胚内, 以触摸囊胚的边缘。通过将工具标记放置在囊胚的外缘, 单击并按住鼠标左键, 并沿囊胚的外缘拖动工具标记, 直到选择整个囊胚的横截面区域, 勾勒出囊胚的轮廓。
   注意: 可维萨索纳不是测量的一部分, 因此必须将其排除在外 (图 5)。
10. 在 "时间轴" 窗口中, 单击 "测量日志", 然后按"记录测量"按钮。
    注意: 这将记录所选区域。
11. 返回到时间轴, 右键单击图像, 然后选择 "取消选择"。
12. 将时间线滑块移动到下一张图像, 然后单击其下方的相应磁贴。
13. 使用快速选择工具在新图像中勾勒出囊胚。重复测量。
14. 重复此过程 (步骤 8.9-8.13) 图像按图像, 直到测量和记录所有图像的横截面区域。
15. 最后, 转到 "测量日志", 选择"区域" 变量下的所有测量值, 然后将其导出到. txt 文件中。
    注意: 横截面面积的单位为方形像素。

9. 使用记录的爆破器的横截面区域编辑数据文件, 从平衡阶段创建的图像中进行

1. 将记录的囊胚横截面区域的数据从. txt 文件传输到电子表格编辑器。
2. 使用第一个横截面面积值作为参考值 1, 并将所有其他值表示 (转换) 为该参考值的一小部分。
3. 创建一个新的变量区域 _ r, 并将转码区域值 (参考值除外) 粘贴到它下面。
4. 在 "面积 _ r" 变量旁边, 创建一个 time 变量并添加第一个时间值。
   注: 第一次值表示从囊胚暴露在平衡溶液中到在配备摄像头的显微镜下开始记录的那一刻起经过的时间。
5. 通过将20秒添加到上一个时间值来计算下一个连续时间值。
   注意: 这是在抽取录制过程中创建的不必要的视频帧时使用的时间间隔。

10. 囊胚的升温

1. 准备加热介质。
   1. 在加热囊胚的前一天, 在4口的盘子中无菌地分配了三滴150μl 的恢复介质。此外, 在专门为延时显微镜和记录而设计的9井微滴盘中无菌分配回收介质。用石蜡油覆盖回收介质, 在37°c 下, 用 6% co 2 和 5% o2 预孵育.
      注: 回收培养基是添加人血清白蛋白 (hsa) 的囊胚级胚胎的培养基。回收介质中的 hsa 应为 12mg/ml。要填补9井盘中的孔, 请使用移液器进行卵母细胞剥蚀, 以避免产生气泡, 然后用30μl 的回收介质覆盖微滴区域。
   2. 在囊胚升温的当天, 在4井盘的单井中无菌地分配500μl 解冻溶液 (ts), 并允许它在没有 co 2 的孵化器中加热到 37°c.
   3. 在室温下, 在无菌培养皿中无菌地分配一个50μl 滴稀释溶液 (ds) 和两滴50μl 洗涤溶液 (ws)。用石蜡油覆盖 ds 和 ws1 和 ws2 滴。
      注意: 也可以使用4井的培养皿, 而不是培养皿。
2. 温暖囊胚。
   1. 识别 hsv 秸秆与玻璃化囊胚从 ln 存储中取出, 并快速将秸秆转移到充满 ln 的便携式水库, 为升温过程做准备。
   2. 用钳子提起秸秆, 刚好足够露出有色的处理杆。使用自调整线剥离器在彩色处理杆的高度切割秸秆。
   3. 抓住处理杆, 用快速但可控的动作从秸秆中提取, 并立即将处理杆的弯曲铲子浸入 37°c ts 中。
   4. 轻轻旋涡处理杆分离囊胚, 并在 ts 中总共留下1分钟。
   5. 在室温下, 在每种介质中连续将囊胚转移到 ds、ws1 和 ws2, 每次4分钟。
   6. 在加热过程后, 将囊胚转移到4井盘与恢复介质, 并将其洗入所有三个滴轻轻移液。
      注意: 清洗时间约为1分钟。
   7. 用恢复培养基将囊胚转移到延时9井盘。将9口井盘放在延时相机下的孵化器中 (在 37°c, 6% co₂和 5%_o2)。
      注意: 加热过程, 继续将9孔盘放在一个延时相机在孵化器, 持续约17分钟。

11. 暖化后恢复过程中囊胚再膨胀的延时记录

1. 运行延时录制软件。
2. 选择一个录音相机。
3. 按"实时模式"按钮。
4. 将鼠标光标放在图像上, 然后使用滚动按钮将其放大。单击并按住鼠标左键, 然后移动光标将与囊胚一起的井放在屏幕中央。
5. 在"聚焦" 下, 使用上下绿色箭头聚焦囊胚囊胚的记录平面。在光强下, 设置光强。
6. 单击 "显微镜参数"按钮以设置曝光时间和伽玛。
7. 按"关闭实时模式"。
8. 按"开始项目" 按钮并输入项目数据, 选择培养盘类型 (3 x 3 或 4 x 4), 并取消选中除要记录的位置以外的所有位置。
9. 设置捕获时间, 每5分钟拍摄一次照片。
10. 按 "批准" 按钮开始录制。记录至少150分钟。
11. 按 "停止项目" 按钮停止录制。
    注: 请参见在变暖后恢复期记录完整 (图 3) 和塌陷囊胚 (图 4) 的代表性结果。

12. 再膨胀后记录的囊胚的视频编辑

1. 转到项目文件夹并找到大小约为 80 kb 的录制图像。
2. 创建另一个文件夹并将这些图像传输到其中。根据创建的时间以数字重命名图像。将它们作为图像序列导入到视频编辑软件中。
3. 转到"视频" 选项卡→ "筛选器" → "添加", 然后选择"空转换筛选器".
4. 单击右侧的"裁剪" 按钮并裁剪图像, 只显示带有记录的囊胚的字段。用"确定"确认, 然后再用"确定" 进行确认。
5. 单击"文件" → "导出" → "图像序列"。选择 jpeg 作为输出格式, 将目录设置为保存保存的图像序列, 然后单击 "确定"。
   注意: 这将创建调整大小 (裁剪) 的图像, 以便在视频分析软件中进行进一步测量。

13. 在视频分析软件中为使用延时记录软件创建的图像设置测量比例

1. 运行延时记录软件的分析仪。
2. 使用记录的囊胚打开项目。
3. 单击带有记录的囊胚的字段上的"分析"按钮。
   注意: 将打开一个新的 "分析" 窗口。单击 "测量" 按钮以显示测量工具。
4. 使用测量工具测量整个图像的宽度。
5. 右键单击图像并将其保存。在属性中, 检查图像的宽度 (以像素为单位)。
6. 将图像的实际宽度与其宽度 (以像素为单位) 分开。
   注意: 这将计算此图像中单个像素的实际长度。
7. 运行视频分析软件。
8. 单击 "窗口" 选项卡, 然后选择"时间轴"。
9. 在 "时间轴" 窗格中, 单击胶片条符号, 然后选择 "添加媒体..." 以添加暖后再膨胀囊胚的图像序列。
10. 单击 "图像" → "分析" → "设置测量比例" → "自定义" 以打开 "测量比例" 窗口. 对于像素长度, 输入 1;对于逻辑长度, 输入以前计算的像素实际长度 (步骤 13.6);对于逻辑单元, 输入μm. 保存预设。

14. 从重新膨胀后产生的图像中测量囊胚的横截面面积

1. 一旦设置了测量刻度并导入了图像序列, 就可以按照步骤8中描述的相同方式测量囊胚的横截面面积, 唯一的区别是这些测量中测量的横截面面积以μm 2 为单位.

15. 使用在重新膨胀后创建的图像中编辑数据文件, 其中包括记录的爆破器的横截面区域

1. 将记录的囊胚横截面区域的数据从. txt 文件传输到电子表格编辑器。
2. 在 "区域" 变量旁边创建一个 time 变量, 并添加第一个时间值。
   注意: 在这种情况下, 第一次值设置为 0分钟, 即延时记录的开始。通过在上一个时间值的基础上添加5分钟来计算下一次连续的时间值。五分钟是连续两次延时录制之间使用的时间间隔。

16. 创建折线图

1. 在统计分析软件中导入电子表格数据文件, 以创建在玻璃化或再膨胀后的平衡阶段, 囊胚横截面面积在时间上变化的时间图。

Results

在一次演示中, 我们只在一个预防和一个变暖后阶段显示了囊胚形态动力学。平衡阶段结束时和培养基恢复开始时囊胚体积的差异显示出胚胎收缩的强度, 即胚胎保存强度对冰结晶的影响。

从图 1和视频 1可以看出, 完整的囊胚在平衡溶液中没有完全塌陷。囊胚只部分收缩, 但在10分钟内, 它慢慢达到了70% 的再膨胀大小。相反, 人工塌陷的囊胚在激光处理后立即完全清空囊胚, 但在平衡溶液中, 其体积不再变化 (图 2,视频 2)。在回收介质中 (图 3和 图 4) 中, 用显微照片和线图呈现了不同的囊胚生长模式。

Discussion

冷冻保存期间和保存后的囊胚形态观察方案也可以使用其他制造商的类似仪器和软件工具进行。根据胚胎学调整的延时系统允许对胚胎发育进行持续监测。本工作的目的是介绍在准备玻璃化过程中和在玻璃化后囊胚行为的定量。这是通过客观地测量时间刻度上的形态变化来实现的。获得的测量结果可以进行数学分析, 并与其他结果进行比较。在所述协议可以遵循的参数中, 有囊胚大小、内部细胞质量、囊胚或透明带在一定时间内的变化。尺寸可以显示为最大囊胚截面的表面积、囊胚周长或直径, 并在计算后显示为其体积。

在以前使用延时系统的研究中, 只对新鲜胚胎11进行了囊胚扩张速度测量.在玻璃体/加热囊胚中, 只有囊胚的大小是在胚胎移植后和胚胎移植之前立即测量的, 或者分析了受热囊胚扩大到透明带的时间..更详细的囊胚再膨胀动力学只在我们以前的研究⁸中进行了分析。在本研究中, 形态测量协议已经被用来跟踪气候变暖后囊胚再扩张的...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
倒置显微镜 Eclipse TE2000-U	日本尼康	/
丹麦 Origio 土星 5 号激光系统	研究仪器	/
Origio 数码	相机 DC1	/
Origio	相机 DC2	/
丹麦 Origio Cronus	3.7	/	显微镜记录软件
使用 6% CO2、5% O2 粘合剂的培养箱	，德国	/
Primo Vision 显微镜	Vitrolife，瑞典	16600
Primo Vision Capture 软件	Vitrolife，瑞典	16608	延时录制软件
Adobe Photoshop CS6 扩展软件	Adobe Systems Incorporated，美国	/	视频分析软件
VirtualDub	艾弗里·李	/	视频编辑软件
Microsoft Office Excell	Microsoft，美国	/	电子表格编辑器
PrimoVision 培养皿	Vitrolife，瑞典	16604
G2-plus 培养基	Vitrolife，瑞典	10132	囊胚期胚胎培养培养基
人血清白蛋白	Vitrolife，瑞典	10064
石蜡油	Vitrolife，瑞典	10029
平衡溶液培养基	Irvine Scientific， Ireland	90131
玻璃化溶液培养基	Irvine Scientific， 爱尔兰	90132
解冻溶液培养基	Irvine Scientific， 爱尔兰	90134
稀释溶液培养基	Irvine Scientific， Ireland	90135
洗涤液培养基	Irvine Scientific， 爱尔兰	90136
HSV 玻璃化吸管	CryoBio System，法国	025246,025249,025250,025248
液氮	/
低温容器 Biosafe 120 MD 和 beta;	Cryotherm，德国	229286
	Cryotherm Cryotherm，德国
镊子	/	/
剪刀	/	/
Pippete，用于囊胚作	Gynetics，比利时	ID275/10	直径 275 µm
卵母细胞剥落移液管	Vitromed，德国	V-DEN-135	直径 135 µm
移液器 EZ-Grip	Research Instruments	7-72-2802
数字间隔计时器 辅助	Glaswarenfabrik Karl Hecht	41977010
IBM SPSS Statistics 21	IBM， USA/		统计分析软件
自调节剥线器	Knipex， Germany	1262180