囊胚玻璃化冷冻与复温过程中行为客观评估的形态计量学方案

摘要

本文介绍了一种时间延时形态测量方案，用于追踪囊胚在玻璃化冷冻前干预过程中的收缩强度以及复温后重新扩张的过程。该方案可应用于 体外 配备延时显微镜的受精实验室，并建议将其用于优化囊胚玻璃化冷冻方法的开发。

摘要

本文介绍了一种基于延时显微摄影技术的囊胚形态测量非侵入性方法，用于精确监测囊胚在玻璃化冷冻前后各个阶段体积的动态变化。该方法可通过观察囊胚在不同冷冻前和冷冻后阶段的收缩与再扩张过程，有助于寻找囊胚暴露于不同浓度冷冻保护剂的最优时机，从而优化囊胚玻璃化冷冻方案。为更好地展示该形态测量法的应用价值，本文比较了两种不同的囊胚冷冻前处理方案：一种在冷冻前进行人工囊腔塌陷处理，另一种则不进行此干预。两种情况下囊胚的体积变化均通过延时显微摄影进行追踪，并利用图像编辑软件工具进行测量。测量在冷冻前阶段每20秒进行一次，在复温后阶段每5分钟进行一次。囊胚尺寸随时间的变化以折线图形式直观呈现。结果显示，在较长的平衡预冷冻阶段，完整囊胚首先发生收缩，随后缓慢重新充盈囊腔，最终以含有液体的囊腔状态进入玻璃化冷冻程序；而经人工塌陷的囊胚在整个平衡阶段始终保持收缩状态，在玻璃化冷冻阶段其体积亦无明显变化。由于形态测量结果表明，人工塌陷囊胚在预冷冻阶段体积保持稳定，提示该阶段可能可以缩短。本研究所述方案可提供多种额外的比较参数，用于评估囊胚在冷冻保存过程中及之后的行为特征，包括体积变化的速度与强度、部分囊腔收缩次数或完全囊胚塌陷次数、完全囊腔再扩张所需时间以及孵化所需时间等。

引言

如今，在大多数体外受精（IVF）实验室中，对来自体外受精项目的人类着床前胚胎进行冷冻保存已成为常规操作。in vitro 胚胎慢速冷冻方法自1985年开始进入临床应用，当时引入了特定的冷冻保护剂和计算机控制的冷冻仪，可将胚胎在受控条件下逐步降温至-7 °C，并在此时诱导周围冷冻保护液中发生冰晶成核（即“播种”）¹。随着持续降温，冰晶逐渐生长，导致剩余液相部分出现高渗状态，从而引起胚胎细胞脱水和收缩。当温度降至-30 °C或-80 °C时，胚胎被投入液氮中进行长期保存。在降温过程中胚胎或卵母细胞所发生的变化，只能通过特制的冷冻显微镜进行观察，这些设备有助于优化冷冻保存方案²。在当时，囊胚阶段的胚胎由于体积较大且含有较多液体，其冷冻效果临床结果并不理想³。

囊胚冷冻保存领域的突破在于玻璃化冷冻方法的引入，该方法在降温前通过使用高浓度的冷冻保护剂实现细胞脱水⁴。在玻璃化冷冻前，也可通过在两个滋养层细胞之间制造机械性开口来排出囊胚腔内的液体⁵。尽管玻璃化冷冻与复温后囊胚的即刻存活率超过90%，且将玻璃化冷冻/复温后的囊胚移植入子宫腔后的临床结局几乎与新鲜胚胎移植的结果相当，但该冷冻保存方法尚未实现标准化

方案

本研究中所述所有方法均已于2016年4月19日获得国家医学伦理委员会批准（编号：0120–204/2016–2）。

1. 显微镜记录系统的设置

1. 关闭显微镜的加热板。
2. 在进行任何处理之前，使用配备相机的倒置显微镜拍摄一个囊胚的图像。请务必记录下拍摄囊胚时所使用的放大倍数。

2. 囊胚的筛选与玻璃化冷冻前准备

1. 选择第5天或第6天完全扩张的囊胚进行冷冻保存，囊胚应至少含有少量内细胞团（ICM）细胞，并具有连贯的滋养层。
2. 对于经激光处理、囊胚腔已塌陷的囊胚，对囊胚施加短暂的激光脉冲（0.4 - 0.7 ms），在透明带处形成直径为4.3至9.4 µm的孔，激光方向应与透明带相切，并对准两个相邻滋养层细胞的交界处。让囊胚完全或部分塌陷，持续5分钟。
3. 对于囊胚腔完整的未经处理囊胚，在玻璃化冷冻前不进行特殊处理。
   注：此类囊胚被视为完整囊胚。

3. 平衡阶段冷冻保护剂和培养皿的准备

1. 使用用于卵母细胞去核的移液管（直径135 µm），将平衡液（含7.5% DMSO、7.5%乙二醇和20% DSS的M-199 HEPES缓冲液）无菌加入专为延时显微镜观察和记录设计的9孔培养皿的微滴区域孔中。
   注意：....

结果

在演示中，我们仅展示了一个玻璃化冷冻前和一个复温后的囊胚形态动力学过程。囊胚在平衡阶段结束时与在培养基中开始恢复时的体积差异，反映了胚胎收缩的程度，这实际上体现了胚胎抵抗冰晶形成的保存效果。

如从图中可观察到的那样 图1 和 视频 1，完整的囊胚在平衡液中并未完全塌陷。囊胚腔仅部分收缩，但在10分钟内缓慢重新扩张至原始体积的70%。与此相反，经人工激光塌陷的囊胚在激光处理后立即完全排空了囊胚腔，但在平衡液中其体积不再发生任何变化图2, 视频 2）。囊胚腔在复苏培养基中的重新扩张情况（图3 和 图4) 结合显微照片与线.......

讨论

用于观察囊胚在冷冻保存期间及之后形态动力学的实验方案，也可使用其他厂商的类似仪器和软件工具来实施。适用于胚胎学研究的延时成像系统可实现对胚胎发育过程的连续监测。本研究的目的是引入一种量化方法，用于评估囊胚在玻璃化冷冻前准备阶段以及复温后的行为变化。该方法通过在时间尺度上对形态学变化进行客观测量来实现。这些测量所得结果可进行数学分析，并与其他结果进行比较。本方案可追踪的参数包括：在特定时间段内囊胚本身的大小、内细胞团、囊胚腔或透明带的变化。囊胚大小可表示为囊胚最大横截面的表面积、囊胚周长或直径，经过计算后亦可表示为其体积。

在以往使用延时成像系统的研究中，囊胚腔扩张速度的测量仅针对新鲜胚胎进行¹¹。对于玻璃化冷冻/复温后的囊胚，仅在复温后立即及胚胎移植前测量其大小，或分析复温后囊胚重新扩张至透明带所需的时间^9,10。更为详细的囊胚再扩张动态分析仅见于我们之前的研究⁸。在该研.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
倒置显微镜 Eclipse TE2000-U	Nikon, 日本	/
Saturn 5 激光系统	Research Instruments, Origio, 丹麦	/
数码相机 DC1	Research Instruments, Origio, 丹麦	/
数码相机 DC2	Research Instruments, Origio, 丹麦	/
Cronus 3.7	Research Instruments, Origio, 丹麦	/	显微镜记录软件
含 6% CO2、5% O2 的培养箱	Binder, 德国	/
Primo Vision 显微镜	Vitrolife, 瑞典	16600
Primo Vision Capture 软件	Vitrolife, 瑞典	16608	延时成像记录软件
Adobe Photoshop CS6 扩展版软件	Adobe Systems Incorporated, 美国	/	视频分析软件
VirtualDub	Avery Lee	/	视频编辑软件
Microsoft Office Excel	Microsoft, 美国	/	电子表格编辑器
PrimoVision 培养皿	Vitrolife, 瑞典	16604
G2-plus 培养基	Vitrolife, 瑞典	10132	囊胚阶段胚胎的培养基
人血清白蛋白	Vitrolife, 瑞典	10064
石蜡油	Vitrolife, 瑞典	10029
平衡液培养基	Irvine Scientific, 爱尔兰	90131
玻璃化冷冻液培养基	Irvine Scientific, 爱尔兰	90132
解冻液培养基	Irvine Scientific, 爱尔兰	90134
稀释液培养基	Irvine Scientific, 爱尔兰	90135
洗涤液培养基	Irvine Scientific, 爱尔兰	90136
HSV 玻璃化冷冻吸管	CryoBio System, 法国	025246, 025249, 025250, 025248
液氮	/
Cryo vessel Biosafe 120 MD β	Cryotherm, 德国	229286
冷冻罐	Cryotherm, 德国
镊子	/	/
剪刀	/	/
囊胚操作移液管	Gynetics, 比利时	ID275/10	直径 275 µm
卵母细胞去颗粒细胞移液管	Vitromed, 德国	V-DEN-135	直径 135 µm
移液器 EZ-Grip	Research Instruments	7-72-2802
数字间隔计时器 Assistent	Glaswarenfabrik Karl Hecht	41977010
IBM SPSS Statistics 21	IBM, 美国	/	统计分析软件
自调节导线剥皮钳	Knipex, 德国	1262180