利用农杆菌介导的花序浸润法转化，可成功创制耐受极端环境的模式植物Schrenkiella parvula的稳定转基因株系。本文提供了一种基于Arabidopsis thaliana转化方案的改良方法，该方法考虑了该极端环境适应植物在生长习性和生理特性上的差异。
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摘要
摘要
Schrenkiella parvula 是一种适应多种非生物胁迫（包括多种离子毒害胁迫）的极端环境植物。尽管已有高质量的基因组资源可用于研究植物如何适应环境胁迫，但由于缺乏可行的遗传转化体系，其作为功能基因组学研究模型和工具的价值一直受到限制。在本实验方案中，我们报道了利用农杆菌介导的花序浸染法（floral-dip）获得稳定转基因 S. parvula 植株的方法。我们对拟南芥（A. thaliana）常用的转化流程进行了改良，以适应 S. parvula 特有的生物学特征，例如无限花序生长习性和叶片表面丰富的表皮蜡质。简要而言，S. parvula 种子在播种前需在 4 °C 下进行为期五天的春化处理。植株在 14 小时光照 / 10 小时黑暗的光周期、光照强度为 130 µmol m-2s-1、温度为 22 °C 至 24 °C 的条件下培养。选择生长 8 至 9 周、具有多个花序的植株进行转化。将这些花序浸入含有携带 pMP90RK 质粒的 Agrobacterium tumefaciens GV3101 菌株的侵染液中。为提高转化效率，我们进行了两轮花序浸染，间隔时间为三至四周。收集 T1 代种子后，将其置于含干燥剂的容器中干燥四周，再进行萌发，以筛选潜在的转化植株。利用对除草剂 BASTA 的抗性对 T1 代植株进行筛选。从两周龄的植株开始，每隔三天喷洒一次 BASTA 溶液，共喷三次，以减少假阳性结果。对存活的单株进行 BASTA 滴液检测，以鉴定真正的阳性转化植株。该方法的转化效率为 0.033%，每 10,000 粒 T1 代种子可获得 3–4 株转基因植株。
引言
在本实验方案中，我们描述了极端环境植物模式物种Schrenkiella parvula的生长及其稳定转基因品系的建立。高效的遗传转化体系是任何多功能遗传模型的重要标志。能够在极端环境中生长的植物，即所谓的极端环境植物（extremophytes），为研究植物对环境胁迫的适应机制提供了重要的资源。Schrenkiella parvula（曾用名Thellungiella parvula和Eutrema parvulum）便是这样一种极端环境植物模式物种，其基因组资源正在不断扩展1,2,3,4,5。然而，迄今为止尚未有已发表的研究报道S. parvula的遗传转化方案。
S. parvula 的基因组是芥菜科（十字花科）中首个发表的嗜极生物基因组，其整体基因组共线性与非嗜极模式生物Arabidopsis thaliana1具有高度相似性。因此，通过比较A. thaliana
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方案
1. 植物生长
- 种子灭菌（可选）
- 在50 mL离心管中，用双蒸水（ddH2O）配制50%次氯酸钠溶液，并加入1至2滴非离子型去污剂（参见材料表），反复倒置混匀。
注意：建议在超净工作台内操作种子灭菌步骤，并将工作台表面用紫外灯灭菌15分钟。 - 将次氯酸钠溶液加入含有约100–200粒S. parvula种子的1.5 mL离心管中，充分混匀后静置5分钟。
- 去除次氯酸钠溶液，加入70%乙醇。用移液器反复吹打清洗种子，随后立即去除乙醇溶液。
- 用无菌水清洗种子以去除残留的次氯酸钠和乙醇，然后弃去水相。重复此步骤5至6次。
- 在50 mL离心管中，用双蒸水（ddH2O）配制50%次氯酸钠溶液，并加入1至2滴非离子型去污剂（参见材料表），反复倒置混匀。
- 种子层积处理
- 将种子浸入无菌水中，在4 °C条件下保存5至7天。或者，将未灭菌的干燥种子直接播种于湿润土壤表面，并将育苗盘置于4 °C环境中5至7天。
- 转化前植株的培养
- 将土壤混合物（参见材料表）装入7 × 6 cm2的花盆中，将花盆浸入水中润湿，并从顶部喷水，确保培养基均匀湿润。在每个花盆的....
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结果
我们开发了一种转化方案，可实现对T的收获0 150 天内使用改良的蘸花法 A. thaliana. 图1 展示了时间线的概要 S. parvula 代表通过花浸法进行转化最佳时期的植株。我们选择了 S. parvula 萌发后60–80天、具有70–80朵花且花序多歧的植株作为转化的目标时期。在此阶段，浸润前需去除少量已开放或已受精的花朵及角果。 A. tumefaciens 通过花序浸渍法进行感染。 A. tumefaciens 导致部分花朵流产（图2，括号（a）所示）。经蘸花法处理后完全发育的角果很可能含有转化种子（图2，括号（b）。即使在转化后 S. parvula 只要植株保持健康，便会持续发育出新的花序和花朵（图2<.......
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讨论
植物的生理状态显著影响转化效率25。S. parvula 转化成功的关键要求之一是使用健康且生长旺盛的植株。与适合转化的健康植株相比，水分或光照胁迫下的植株开花数量更少（图1，中间图）。S. parvula 可在低于 130 µmol m-2 s-1 的光照强度下生长，但植株通常较为脆弱；此类植株在花序浸染后更容易出现花器官败育。S. parvula 花序经农杆菌浸染后花败育的频率高于 A. thaliana。因此，在将花序浸入A. tumefaciens 侵染溶液时，采取任何减少花败育的措施均有助于提高转化效率。我们建议每日光照时间不超过 14 小时。通常，A. thaliana 的转化实验使用生长在长日照条件（例如 18 小时光照、6 小时黑暗）甚至连续光照下的植株进行。然而，我们发现此类培养方式会导致 S. parvula 植株抗逆性降低，从而造成.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国家科学基金会资助项目 MCB 1616827 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 90000-762 | Bacto 琼脂凝固剂，BD 诊断 |
| B5维生素 | Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州 | G1019 | 甘博格’维生素溶液 |
| 干燥剂 | W A Hammond Drierite，Xenia，OH | 22005 | 指示型DRIERITE 6目 |
| 用于植物转化的载体 | TAIR | 载体：6531113857 | pKGWFS7 |
| 电穿孔比色皿 | USA Scientific | 9104-5050 | 电穿孔比色皿，圆形帽，0.2 cm 间隙 |
| 电穿孔仪 | BIO-RAD Laboratories，Hercules，CA | 1652100 | MicroPulser 电穿孔仪 |
| 肥料珠 | Osmocote 园艺，俄亥俄州玛丽斯维尔 | N/A | Osmocote 智能释放植物营养肥 花 &和蔬菜 |
| 凝胶回收试剂盒 | iNtRON 生物技术公司，波士顿，马萨诸塞州 | 17289 | MEGAquick-spin 总片段 DNA 纯化试剂盒 |
| 庆大霉素 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | G1914-5G | 硫酸庆大霉素 |
| 草铵膦铵盐（11.3%）除草剂（BASTA） | 拜耳环境科学，新泽西州蒙特瓦尔 | N/A | FINALE 除草剂 |
| 卡那霉素 | VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 200004-444 | 卡那霉素单硫酸盐 |
| MES | Bioworld，俄亥俄州都柏林 | 41320024-2 | MES，游离酸 |
| MS盐 | MP Biomedicals，美国加利福尼亚州圣安娜 | 092621822 | 霍格兰改良基础盐混合物 |
| N6-苄基腺嘌呤（BA） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | B3274 | 6-苄氨基嘌呤溶液 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 氯化钠 |
| 非离子型去垢剂 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
| 质粒提取试剂盒 | Zymo Research，加利福尼亚州尔湾市 | D4036 | Zyppy 质粒提取试剂盒 |
| 重组酶酶混合试剂盒 | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II 酶混合物 |
| 利福平 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | R3501-1G | 利福平，粉末， ≥ 97%（HPLC） |
| 摇床培养箱 | ThermoFisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州 | SHKE4450 | MaxQ 4450 台式轨道摇床 |
| 土壤混合物 | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 种植者培养基 |
| 壮观霉素 | VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | IC15206705 | |
| 无菌50 mL锥形管 | USA Scientific，奥卡拉，佛罗里达州 | 1500-1811 | 50 mL 圆锥形螺口管，共聚物材质，带支架，无菌 |
| 蔗糖 | VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 57-50-1 | 蔗糖，ACS级 |
| 表面活性剂溶液 | Lehle 种子，Round Rock，德克萨斯州 | VIS-02 | Silwet L-77 |
| 基于拓扑异构酶的克隆试剂盒 | Life Technologies，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 | K240020 | pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒，含 One Shot TOP10 化学感受态细胞 E. coli |
| 胰蛋白胨 | VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 90000-282 | BD Bacto 胰蛋白胨，BD Biosciences |
| 酵母提取物 | VWR International，拉德诺，宾夕法尼亚州 | 90000-722 | BD Bacto 酵母提取物，BD Biosciences |
参考文献
- Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).
- Oh, D. -H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13 (3), 241(2012).
- Whited, J. The ....
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