一种纯化与 体外 一种(p)ppGpp合成酶的活性检测 艰难梭菌

摘要

本文介绍了一种纯化组氨酸标签焦磷酸激酶酶的方法，并利用放射性标记底物及产物的薄层色谱分析来检测其酶活性。 体外该酶活性检测方法广泛适用于任何激酶、核苷酸环化酶或磷酸转移反应，只要其反应机制包含核苷三磷酸的水解过程。

摘要

激酶和焦磷酸激酶能够将核苷三磷酸前体上的γ-磷酸基团或β-γ-焦磷酸基团转移至底物，从而生成磷酸化产物。使用γ-³²P标记的NTP前体可通过放射自显影技术同时监测底物的消耗和产物的生成。在纤维素板上进行的薄层色谱（TLC）可实现底物与产物的快速分离及高灵敏度定量。本文介绍一种利用薄层色谱法检测纯化的(p)ppGpp合成酶焦磷酸激酶活性的方法。该方法此前已被用于表征环核苷酸和二核苷酸合成酶的活性，也广泛适用于任何水解核苷三磷酸键或将末端磷酸基团从磷酸供体转移至其他分子的酶活性研究。

引言

激酶和焦磷酸激酶（或称二磷酸激酶）能够将核苷三磷酸（NTP）前体中的磷酸基团转移至底物分子。这些底物可包括其他核苷酸、氨基酸或蛋白质、碳水化合物以及脂类¹。生物信息学分析有时可根据与已表征酶的相似性来预测某种酶的特异性底物，但仍需通过实验加以验证。同样，酶对其底物的亲和力、催化磷酸基团转移反应的速率，以及辅因子、抑制剂或其他酶效应物的影响，都必须通过实验测定。为了避免细菌胞质中其他消耗ATP的酶耗尽ATP前体，定量活性测定需要使用纯化的蛋白质。

通过金属亲和层析进行蛋白质纯化在文献中已有充分论述^2,3。在重组蛋白的N端或C端添加由六个连续组氨酸残基组成的组氨酸标签，可实现通过金属亲和层析的快速纯化^4,5,6。与所修饰的蛋白质相比，这些序列较小，通常对蛋白质功能影响极小，但有时可能改变蛋白质稳定性和/或酶动力学^7,8。同一蛋白质N端和C端的组氨酸标签可能产生不同的效应，若不了解目标蛋白质的结构则难以预测。通常在克隆....

方案

1. 组氨酸标签蛋白的诱导型过表达

1. 从 C. difficile R20291 基因组 DNA 中扩增 rsh 基因。
   1. 使用高保真聚合酶，并按照制造商说明书操作。
   2. 使用引物
      rsh_F(CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) 和
      rsh_R(CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC) 扩增 C. difficile rsh，该引物可引入C端六组氨酸标签。
      注意：引物序列中的 KpnI 和 PstI 酶切位点已加粗。
   3. 用 PstI 和 KpnI 限制性酶切位点对 pMMBneo 载体和 rsh-his6 PCR 产物在 37 °C 下消化 45 分钟。
   4. 通过琼脂糖凝胶电泳分离线性化载体和 PCR 片段，随后使用 DNA 凝胶回收试剂盒进行纯化。
   5. 测定载体和扩增后 PCR 产物在 280 nm 处的吸光度（A₂₈₀）。使用公式

结果

我们介绍一种从 (p)ppGpp 合成酶中进行亲和纯化的方法 艰难梭菌 及其酶活性的评估。 图1 展示了通过金属亲和层析实现的蛋白质纯化。该纯化过程的第二次洗脱（E2）组分经透析后用于酶活性测定。 图2 详细说明了通过薄层色谱法进行焦磷酸转移酶活性测定所需进行的准备及操作步骤。 图3 说明如何对这些实验的数据进行定量分析，重点介绍适当的空白校正以及将信号强度转换为百分比的方法。在 图4A我们展示了一张典型的薄层色谱放射自显影图，该图来自使用纯化RSH进行的(p)ppGpp合成酶活性检测 C. difficile (p)ppGpp合成酶。在放射自显影图像上，初始点样位置、ppGpp和ATP斑点清晰可见，溶剂前沿也可见，因其含有微量放射性标记的无机磷酸盐。含有更多磷酸基团的分子从初始点样位置迁移的距离较短.......

讨论

此处我们报道了从 His 标签 RSH 的纯化方法 C. difficile 并介绍一种使用放射性标记薄层色谱进行活性定量的方法。该方法此前已被用于评估二鸟苷酸环化酶的活性 C. difficile以及来自其他生物的(p)ppGpp合成酶、核苷酸环化酶、激酶和磷酸二酯酶^11,12,13,21虽然该方法并非新颖，但可广泛适用于多种类型的检测，我们希望研究人员会发现其视频形式的展示具有帮助性。

本方案中最关键的步骤是蛋白质纯化（步骤 2.1.3–2.1.10）、薄层色谱反应体系的准备（步骤 2.2–2.3）以及数据分析（步骤 3.4）。我们发现以下改进尤为有益：在镍柱纯化所用缓冲液中添加 MgCl₂（步骤 2.1.3–2.1.10）对纯化后蛋白的酶活性至关重要；将酶活性数据表.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组氨酸标签蛋白的可诱导过表达
Phusion 聚合酶	New England Biolabs (NEB)	M0530L
QIAEX II DNA 凝胶回收试剂盒	Qiagen	20021
KpnI 限制性内切酶	NEB	R0142S
PstI 限制性内切酶	NEB	R0140S
T4 DNA 连接酶	NEB	M0202
NEB® 5-alpha 感受态 E. coli （高效率）	NEB	C2987I
BL21 (DE3) 感受态 E. coli	NEB	C2527I
IPTG	Sigma-Aldrich	10724815001
JXN-26 离心机，配备 JLA 10.500 转子	Beckman Coulter Avanti	-
配备 D3024/D3024R 转子的微量离心机	Scilogex	-
MaxQ SHKE6000 恒温摇床	Thermo Scientific	-
超声波处理器	Sonics	VC-750
镍亲和层析纯化蛋白
Ni-NTA 树脂	G Biosciences	786-940/941
Pierce 一次性重力柱，10 mL	Thermo Scientific	29924
1 mL Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 透析装置（截留分子量：20 kD）	Spectrum	G235033
Mini-Protean 电泳槽	BioRad	1658004
薄层层析法检测蛋白活性
薄层层析（TLC）展开槽	General Glass Blowing Company	80-3
聚乙烯亚胺（PEI）-纤维素板（20 cm × 20 cm，厚度 100 μm），带聚酯支撑	Sigma-Aldrich	Z122882-25EA
ATP，[γ-32P]，3000 Ci/mmol，10 mCi/mL 铅，100 μCi	Perkin Elmer	NEG002A
腺苷-5’-三磷酸（ATP），100 mM	Bio Basic Canada	AB0311
鸟苷-5’-二磷酸二钠盐（GDP）	Alfa Aesar	AAJ61646MC/E
储存磷屏	GE Healthcare Life Sciences	BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen
Storm 860 磷光成像仪	GE Healthcare Life Sciences	-