ZW10 相互作用蛋白（ZWINT）参与有丝分裂纺锤体检查点及癌症的发病机制。本文介绍一种对人肺癌组织中 ZWINT 进行免疫染色的方法，随后进行全切片数字扫描和图像分析。该方法可提供高质量的数字图像和可靠的结果。
本文内容
摘要
摘要
本研究的目的是介绍一种对人肺组织进行免疫染色的方法，随后进行全切片数字扫描与图像分析。数字扫描是一种快速扫描大量玻片并生成高质量数字图像的方法，其结果可与病理学家通过传统光学显微镜（CLM）观察的结果具有一致性。此外，数字图像的可获取性使得同一张切片能够被多人同时观察。同时，玻片的数字图像可存储于数据库中，从而避免了玻璃切片长期保存过程中的退化问题。该技术的局限性如下：第一，需要高质量制备的组织样本，以及无任何损伤或过量封片剂残留的原始免疫组织化学（IHC）切片；第二，在使用软件进行分析前，应由经验丰富的病理学家明确标定肿瘤或非肿瘤区域，以避免在评分过程中对肿瘤与非肿瘤区域产生混淆；第三，操作人员需在整个切片成像的数字化过程中控制色彩还原的一致性。
引言
ZW10 相互作用蛋白（ZWINT）是动粒复合体的必要组分，参与有丝分裂纺锤体检查点1,2,3。已有研究报道，ZWINT 的缺失会导致染色体异常的过早分离1,2,3。近期研究表明，ZWINT 通过促进肿瘤细胞增殖参与多种肿瘤的发生发展4,5。我们先前报道了 ZWINT 在肺癌中的过表达5。目前普遍认为，病理学家使用传统光学显微镜（CLM）分析切片费时且缺乏定量性6,7,8。 此外，储存的玻璃切片可能因老化而损坏，导致先前制作的切片无法重新获取。基于计算机的数字全切片成像（WSI）技术作为一种新兴方法，有望克服这些局限性6,<....
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方案
本文所描述的所有方法均经武汉大学中南医院和武汉大学人民医院伦理委员会批准。
1. 免疫组化切片的制备
- 将人肺组织碎片（约3 x 3 cm）浸入含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在室温下固定24小时。
- 将组织在80%、95%和100%乙醇中分别于室温下脱水15分钟、20分钟和20分钟。最后，将组织在100%二甲苯中浸泡3次，每次20分钟，室温下进行。
- 包埋时，将组织浸入石蜡（63 °C）中30分钟。更换石蜡，再次将组织浸入45分钟。最后，再次更换石蜡，将组织继续浸入1小时。
- 使用旋转式切片机将组织切成5 µm厚的切片，并置于经20 µg/mL多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上。
- 脱蜡时，将切片置于65 °C烘箱中2 h，然后将切片浸入二甲苯中15 min，再在100%二甲苯中浸泡15 min。
- 将带有组织切片的载玻片先后浸入100%乙醇中水化2次，每次5分钟；随后依次在95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和50%乙醇中梯度水化，每次处理5分钟。
- 进行抗原修复。
- 将柠檬酸修复液（20倍浓缩）用双蒸水稀释至1倍浓度2O (ddH₂O)2O
- 将载有组织切片的玻片与1x柠檬酸修复液（300 mL）放入抗原修复盒中，先在微波炉中高火加热2分钟，随后调至低火....
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结果
我们通过免疫组化法检测了28对非小细胞肺癌（NSCLC）标本（肿瘤组织及相邻的非肿瘤组织）中ZWINT的表达水平，其中包括14例鳞状细胞癌（SCC）和14例腺癌（ADC）。切片的全片数字化扫描提供了高质量的数字图像（图1A）。结果显示，肺癌组织的H评分显著高于相邻的非癌组织（P ＜ 0.0001，双尾t检验）（图 1A 和 1B）。此外，我们发现ZWINT在鳞状细胞癌中的表达水平显著高于腺癌（图1C）。
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讨论
全片扫描因其能够稳健地扫描并生成高质量图像，正成为临床和研究领域的热点话题11,12,13。载玻片扫描显微镜可在数分钟内生成图像11,12,13。通过应用该方法，我们获得了ZWINT免疫组化（IHC）切片的高质量图像，并比较了肿瘤组织与非肿瘤组织之间的H评分。在本方案中，最关键的步骤包括高质量IHC切片的制备、图像采集，以及在病理评分前对肿瘤区域和非肿瘤区域进行准确界定13,14,15,16。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目得到国家自然科学基金（编号：81500151、81400121、81270607、81541027 和 81501352）以及湖北省自然科学基金（中国）（编号：2017CFB631）的支持。作者感谢武汉谷歌生物科技有限公司郭琴、常敏、李辉及其同事提供的技术支持。同时感谢 Muhammad Jamal 在语言润色方面的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 全景 MIDI | 3D HISTECH | Cat: PMIDI-040709 | 一款具有卓越功能集的全自动数字切片扫描仪：支持12张切片容量、荧光扫描，以及更多功能。 |
| QuantCenter | 3D HISTECH | 从公司官方网站下载 | 3DHISTECH 图像分析应用的框架平台。 |
| LEICA RM2235 | Leica Microsystems | Cat: 14050038604 | 新型附件具有更高精度，可方便组织块与刀具的接近操作以及样本定位。 |
| 兔抗人 Anti-ZWINT 抗体 | Abcam | Cat: ab197794 | 用于人肺组织中 ZWINT 的免疫组化分析。 |
| 抗兔二抗 | 武汉谷歌生物科技 | Cat:GB23303-1 | 用于免疫组化染色的二抗。 |
| 磷酸盐缓冲液 | 武汉谷歌生物科技 | Cat:G0002 | 含有磷酸盐缓冲体系的溶液。 |
| OLYMPUS CX23 | OLYMPUS | Cat:6M87620 | 用于检测 H&E 或免疫组化切片的显微镜。 |
| 二甲苯 | 上海凌峰化学试剂 | Cat:1330-20-7 | 一种无色、易燃液体，用作组织切片制备过程中的溶剂和透明剂。 |
| 苏木精染色液 | 武汉赛维尔生物科技 | Cat:G1039 | 常用于组织学研究，通常使细胞核染成蓝色。 |
| Tween 20 | Baitg | Cat:2005-64-5 | 一种山梨醇聚氧乙烯酯类非离子型表面活性剂，由山梨醇经乙氧基化后再与月桂酸结合而成，常用于药理学应用中的去污剂和乳化剂。 |
| 柠檬酸修复液 | 武汉赛维尔生物科技 | Cat:G1202 | 用于免疫组化过程中固定后抗原的修复。 |
| LEICA ASP200s | Leica | Cat: 14048043626 | 专为常规及研究性组织病理学设计，最多可处理200个组织盒。 |
| LEICA Arcadia H | Leica | Cat: 14039354103 | 一种加热式石蜡包埋台，操作简便，控制精确，有助于提高包埋质量、优化工作流程并增强可靠性。 |
| LEICA Arcadia C | Leica | Cat: 14039354102 | 冷台设备，其大工作面可容纳超过60/65个组织盒，配备环境自适应控制模块，确保操作温度始终稳定在-6°C。 |
| CaseViewer 软件 | 3DHISTECH |
参考文献
- Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation. The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).
- Wang, H., et al.
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