需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

人类肺组织中ZW10相互作用蛋白免疫染色的数字化分析

4.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58551

⸱

2019年5月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Department of Thoracic Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 3Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 4Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, 5Department of Gastroenterology, Central Hospital of Wuhan, 6Department of Transfusion, Zhongnan Hospital of Wuhan University

本文内容

摘要

ZW10 相互作用蛋白（ZWINT）参与有丝分裂纺锤体检查点及癌症的发病机制。本文介绍一种对人肺癌组织中 ZWINT 进行免疫染色的方法，随后进行全切片数字扫描和图像分析。该方法可提供高质量的数字图像和可靠的结果。

摘要

本研究的目的是介绍一种对人肺组织进行免疫染色的方法，随后进行全切片数字扫描与图像分析。数字扫描是一种快速扫描大量玻片并生成高质量数字图像的方法，其结果可与病理学家通过传统光学显微镜（CLM）观察的结果具有一致性。此外，数字图像的可获取性使得同一张切片能够被多人同时观察。同时，玻片的数字图像可存储于数据库中，从而避免了玻璃切片长期保存过程中的退化问题。该技术的局限性如下：第一，需要高质量制备的组织样本，以及无任何损伤或过量封片剂残留的原始免疫组织化学（IHC）切片；第二，在使用软件进行分析前，应由经验丰富的病理学家明确标定肿瘤或非肿瘤区域，以避免在评分过程中对肿瘤与非肿瘤区域产生混淆；第三，操作人员需在整个切片成像的数字化过程中控制色彩还原的一致性。

引言

ZW10 相互作用蛋白（ZWINT）是动粒复合体的必要组分，参与有丝分裂纺锤体检查点1,2,3。已有研究报道，ZWINT 的缺失会导致染色体异常的过早分离1,2,3。近期研究表明，ZWINT 通过促进肿瘤细胞增殖参与多种肿瘤的发生发展4,5。我们先前报道了 ZWINT 在肺癌中的过表达5。目前普遍认为，病理学家使用传统光学显微镜（CLM）分析切片费时且缺乏定量性6,7,8。 此外，储存的玻璃切片可能因老化而损坏，导致先前制作的切片无法重新获取。基于计算机的数字全切片成像（WSI）技术作为一种新兴方法，有望克服这些局限性6,7,8。

为此，我们描述了一种对人肺癌组织中 ZWINT 进行免疫组织化学染色的方法，并结合全切片数字扫描和基于软件的图像分析。该方法的主要优势在于其结果与 CLM 具有良好的一致性。该技术可广泛应用于苏木精-伊红染色（H&E）以及免疫组化、荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）、组织微阵列（TMA）以及药物发现与开发。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本文所描述的所有方法均经武汉大学中南医院和武汉大学人民医院伦理委员会批准。

1. 免疫组化切片的制备

  1. 将人肺组织碎片（约3 x 3 cm）浸入含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在室温下固定24小时。
  2. 将组织在80%、95%和100%乙醇中分别于室温下脱水15分钟、20分钟和20分钟。最后，将组织在100%二甲苯中浸泡3次，每次20分钟，室温下进行。
  3. 包埋时，将组织浸入石蜡（63 °C）中30分钟。更换石蜡，再次将组织浸入45分钟。最后，再次更换石蜡，将组织继续浸入1小时。
  4. 使用旋转式切片机将组织切成5 µm厚的切片，并置于经20 µg/mL多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上。
  5. 脱蜡时，将切片置于65 °C烘箱中2 h，然后将切片浸入二甲苯中15 min，再在100%二甲苯中浸泡15 min。
  6. 将带有组织切片的载玻片先后浸入100%乙醇中水化2次，每次5分钟；随后依次在95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和50%乙醇中梯度水化，每次处理5分钟。
  7. 进行抗原修复。
    1. 将柠檬酸修复液（20倍浓缩）用双蒸水稀释至1倍浓度2O (ddH₂O)2O
    2. 将载有组织切片的玻片与1x柠檬酸修复液（300 mL）放入抗原修复盒中，先在微波炉中高火加热2分钟，随后调至低火持续沸腾6分钟。
    3. 让切片自然冷却至室温。
    4. 将柠檬酸修复液替换为0.01 M PBS，于室温在旋转摇床上洗涤切片3次，每次5分钟。
  8. 消除内源性过氧化物酶。
    1. 稀释30%的H2O2 至3% ddH₂O2将样品加入载玻片中（确保覆盖所有组织），并在湿盒中室温孵育30分钟。
      注意：湿盒是一个10 cm × 15 cm的塑料盒，可盛装水。
    2. 在室温下，用0.01 M PBS在旋转摇床上孵育切片，每次5分钟，共洗涤3次。
  9. 封闭非特异性抗原。
    1. 用含0.1% Tween 20的PBS（PBST）将浓缩的正常山羊血清稀释至10%山羊血清。
    2. 加入10%的山羊血清至载玻片上，于湿盒中37 °C孵育30分钟。
      注意：羊血清应覆盖载玻片上的所有组织。
  10. 对组织进行染色。
    1. 将切片与兔抗人抗-ZWINT 抗体（1:50）在 4 °C 下孵育过夜。
    2. 在室温下，用0.01 M PBST（1,000 mL PBS中含1 mL 0.1% Tween 20）在旋转摇床上洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤3次。
    3. 将切片与二抗（抗兔检测系统，1:200）在37 °C下孵育30分钟。
    4. 在旋转摇床上用 0.01 M PBST 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  11. 为观察免疫染色结果，将切片加入300 µL新鲜的3,3-二氨基联苯胺中，然后在室温下用自来水洗涤切片。
    注意：染色程度需在显微镜下观察（放大倍数 10X - 40X）。
  12. 对组织进行复染。将切片在室温下用苏木精染色液染色2分钟，然后用自来水冲洗15分钟。
    注意：在显微镜下（放大倍数10X - 40X），细胞核呈蓝色。若蓝色染色过深，可使用盐酸酒精分化3 - 5秒，随后用自来水冲洗组织约15分钟，直至组织恢复蓝色，以促进组织染色的清晰呈现。
  13. 将切片在室温下依次置于50%乙醇中脱水5分钟，70%乙醇中5分钟，80%乙醇中两次、每次5分钟，95%乙醇中5分钟，最后在100%乙醇中两次、每次5分钟。
  14. 为保证透明效果，将组织切片浸入盛有100%二甲苯的容器中，室温下孵育15分钟，然后转移至另一盛有100%二甲苯的容器中，继续室温孵育15分钟。
  15. 封片时，取50–100 μL中性树胶，加入5%二甲苯混合（避免产生气泡）。取15 μL上述混合液滴加至肺组织切片上，盖上盖玻片封片，并轻轻压出气泡。

2. 免疫组化切片的全自动全片扫描

  1. 将密封的玻片在室温下干燥 12 小时，以使其充分脱水。
  2. 选择手动明场选项，并进入手动扫描界面。
  3. 修改玻片名称，并为图像选择存储路径。
  4. 设置扫描区域，并选择使用用户设定阈值扫描样本选项。阈值约为 50，扫描区域扩展值为 200 μm。
  5. 设置扫描对焦值，选择自动对焦（范围为 1050 至 2650），最后选择单层模式。
  6. 将免疫组化（IHC）玻片加载到工作站上，并启动自动扫描。
    注意：确保玻片无破损。保持玻片清洁、透明，避免灰尘、纸屑和过量封片剂残留物附着在玻片上。载玻片和盖玻片应无划痕。请勿使用二甲苯清洁玻片。玻片尺寸见表 1。
  7. 以 20X、40X 或 100X 放大倍数自动扫描玻片上的整个组织切片。
  8. 在全玻片扫描结束后，收集并存储图像。

3. 使用成像软件分析载玻片

  1. 启动组织病理学图像分析软件并选择 本地计算机.
  2. 打开存储扫描数据的文件。
  3. 从2X到40X的范围内选择合适的放大倍数。
  4. 调整颜色以设置最佳对比度 通过 切换颜色调整.
  5. 手动圈出并命名每张图像中的感兴趣区域。
    注意：例如，你可以圈出一个区域并将其命名为 肿瘤区域.
  6. 选择 插件 和 质量控制此时， 情景构建器 弹出。
  7. 选择 密度定量 并调整 检测 巴
    注意：此步骤应谨慎操作。该金属条 蓝光耐受性 用于调整细胞核的颜色。该标尺 棕色耐受性 用于调整图像中填充颜色的饱和度。调整后的图像结果应与原始图像保持一致。
  8. 调节 评分等级 使圈出区域的染色强度与原始图像相似。
    注：深棕色表示强阳性，黄褐色表示中等阳性，浅黄色表示弱阳性，白色表示阴性。
  9. 将模型存储并命名为文件。将该模型应用于其他切片并选择 精选注释”.
  10. 让软件自动计算图像中圈出区域的H评分。

4. 使用H评分系统对评分进行定量分析9,10

  1. 计算免疫染色的阳性细胞百分比及染色强度（0：阴性，1+：弱阳性，2+：中等强度，3+：强阳性）。
  2. 采用评分系统（H-score）计算肿瘤组织及邻近非肿瘤组织的病理学评分。
    注：H-score =（弱强度染色细胞百分比 × 1）+（中等强度染色细胞百分比 × 2）+（强强度染色细胞百分比 × 3）。因此，若所有细胞均呈强强度染色，则H-score最高为300。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

我们通过免疫组化法（IHC）检测了28对非小细胞肺癌（NSCLC）组织样本（肿瘤组织及相邻非肿瘤组织）中ZWINT的表达水平，其中包括14例鳞状细胞癌（SCC）和14例腺癌（ADC）。全切片数字化扫描提供了高质量的数字图像（图1A）。结果显示，肺癌组织的H评分显著高于相邻非癌组织（P < 0.0001，双尾t检验）（图1A和1B）。此外，我们发现ZWINT在鳞状细胞癌中的表达水平显著高于腺癌（图1C）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

全片扫描因其能够稳健地扫描并生成高质量图像，正成为临床和研究领域的热点话题11,12,13。载玻片扫描显微镜可在数分钟内生成图像11,12,13。通过应用该方法，我们获得了ZWINT免疫组化（IHC）切片的高质量图像，并比较了肿瘤组织与非肿瘤组织之间的H评分。在本方案中，最关键的步骤包括高质量IHC切片的制备、图像采集，以及在病理评分前对肿瘤区域和非肿瘤区域进行准确界定13,14,15,16。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目得到国家自然科学基金（编号：81500151、81400121、81270607、81541027 和 81501352）以及湖北省自然科学基金（中国）（编号：2017CFB631）的支持。作者感谢武汉谷歌生物科技有限公司郭琴、常敏、李辉及其同事提供的技术支持。同时感谢 Muhammad Jamal 在语言润色方面的帮助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
全景 MIDI3D HISTECHCat: PMIDI-040709一款具有卓越功能集的全自动数字切片扫描仪：支持12张切片容量、荧光扫描，以及更多功能。
QuantCenter3D HISTECH从公司官方网站下载3DHISTECH 图像分析应用的框架平台。
LEICA RM2235Leica MicrosystemsCat: 14050038604新型附件具有更高精度，可方便组织块与刀具的接近操作以及样本定位。
兔抗人 Anti-ZWINT 抗体AbcamCat: ab197794用于人肺组织中 ZWINT 的免疫组化分析。
抗兔二抗武汉谷歌生物科技Cat:GB23303-1用于免疫组化染色的二抗。
磷酸盐缓冲液武汉谷歌生物科技Cat:G0002含有磷酸盐缓冲体系的溶液。
OLYMPUS CX23OLYMPUSCat:6M87620用于检测 H&E 或免疫组化切片的显微镜。
二甲苯上海凌峰化学试剂Cat:1330-20-7一种无色、易燃液体，用作组织切片制备过程中的溶剂和透明剂。
苏木精染色液武汉赛维尔生物科技Cat:G1039常用于组织学研究，通常使细胞核染成蓝色。
Tween 20BaitgCat:2005-64-5一种山梨醇聚氧乙烯酯类非离子型表面活性剂，由山梨醇经乙氧基化后再与月桂酸结合而成，常用于药理学应用中的去污剂和乳化剂。
柠檬酸修复液武汉赛维尔生物科技Cat:G1202用于免疫组化过程中固定后抗原的修复。
LEICA ASP200sLeicaCat: 14048043626专为常规及研究性组织病理学设计，最多可处理200个组织盒。
LEICA Arcadia HLeicaCat: 14039354103一种加热式石蜡包埋台，操作简便，控制精确，有助于提高包埋质量、优化工作流程并增强可靠性。
LEICA Arcadia CLeicaCat: 14039354102冷台设备，其大工作面可容纳超过60/65个组织盒，配备环境自适应控制模块，确保操作温度始终稳定在-6°C。
CaseViewer 软件3DHISTECH

参考文献

  1. Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation. The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).
  2. Wang, H., et al. Human Zwint-1 specifies localization of Zeste White 10 to kinetochores and is essential for mitotic checkpoint signaling. Journal of Biological Chemistry. 279 (52), 54590-54598 (2004).
  3. Lin, Y. T., Chen, Y., Wu, G., Lee, W. H. Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control. Oncogene. 25 (52), 6901-6914 (2006).
  4. Ying, H., et al. Overexpression of Zwint predicts poor prognosis and promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma by regulating cell-cycle-related proteins. OncoTargets and Therapy. 11, 689-702 (2018).
  5. Yuan, W., et al. Bioinformatic analysis of prognostic value of ZW10 interacting protein in lung cancer. OncoTargets and Therapy. 11, 1683-1695 (2018).
  6. Higgins, C. Applications and challenges of digital pathology and whole slide imaging. Biotechnic & Histochemistry. 90 (5), 341-347 (2015).
  7. Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
  8. Al-Janabi, S., Huisman, A., van Diest, P. J. Digital pathology: current status and future perspectives. Histopathology. 61 (1), 1-9 (2012).
  9. Bonomi, P. D., et al. Predictive biomarkers for response to EGFR-directed monoclonal antibodies for advanced squamous cell lung cancer. Annals of Oncology. 29 (8), 1701-1709 (2018).
  10. Villalobos, M., et al. ERCC1 assessment in upfront treatment with and without cisplatin-based chemotherapy in stage IIIB/IV non-squamous non-small cell. Medical Oncology. 35 (7), 106(2018).
  11. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).
  12. Huisman, A., Looijen, A., van den Brink, S. M., van Diest, P. J. Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning. Human Pathology. 41 (5), 751-775 (2010).
  13. Gray, A., Wright, A., Jackson, P., Hale, M., Treanor, D. Quantification of histochemical stains using whole slide imaging: development of a method and demonstration of its usefulness in laboratory quality control. Journal of Clinical Pathology. 68 (3), 192-199 (2015).
  14. Hofman, F. M., Taylor, C. R. Immunohistochemistry. Current Protocols in Immunology. 103, Unit 21.4 (2013).
  15. Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  16. Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D. K., Grizzle, W. E. A standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotechnic & Histochemistry. 91 (5), 309-326 (2016).
  17. Clarke, E. L., Treanor, D. Colour in digital pathology: a review. Histopathology. 70 (2), 153-163 (2017).
  18. Potts, S. J. Digital pathology in drug discovery and development: multisite integration. Drug Discovery Today. 14 (19-20), 935-941 (2009).
  19. Tabata, K., et al. Whole-slide imaging at primary pathological diagnosis: Validation of whole-slide imaging-based primary pathological diagnosis at twelve Japanese academic institutes. Pathology International. 67 (11), 547-554 (2017).
  20. Saco, A., Bombi, J. A., Garcia, A., Ramírez, J., Ordi, J. Current Status of Whole-Slide Imaging in Education. Pathobiology. 83 (2-3), 79-88 (2016).
  21. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

全片扫描数字图像分析组织制备抗原修复抗体标记DAB染色苏木精复染APE评分计算ZWINT表达
人类肺组织中ZW10相互作用蛋白免疫染色的数字化分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。