使用岩心和 N2O 微传感器估算沉积物反硝化速率

摘要

本方法利用乙炔抑制技术和对积累的N₂O进行微传感器测量，估算沉积物岩心中的反硝化速率。该方案描述了岩心采集、传感器校准、实施乙炔抑制、测量N₂O积累量以及计算反硝化速率的操作步骤。

摘要

反硝化作用是将活性氮从生物圈中移除的主要生物地球化学过程。对该过程的定量评估在评价人为干扰下的全球氮循环以及温室气体排放方面已变得尤为重要。即， N₂O）。目前已有多种测定反硝化作用的方法，但均不完全令人满意。现有方法存在的问题包括灵敏度不足，以及需要改变底物浓度或利用扰动样品改变过程的物理构型。本研究描述了一种结合采样钻孔、乙炔抑制法和微传感器对积累的N₂O. 该方法的主要优点是对沉积物结构的扰动较小，并能够连续记录N₂O₂积累；这些可实现对反硝化速率的可靠估算，最低值可达0.4–1 µmol N₂O m^-2 h^-1操纵关键因素的能力是获得实验洞察的另一优势。本方案描述了采集土芯、校准传感器、实施乙炔抑制、测量氮₂O积累，并计算反硝化速率。该方法适用于估算任何可获取沉积物岩心的水生系统中的反硝化速率。如果N₂当O浓度高于传感器检测限时，可省略乙炔抑制步骤以估算N₂O排放而非反硝化作用。我们展示了如何通过增加硝酸盐的可利用性以及考察该过程的温度依赖性，来估算实际和潜在的反硝化速率。我们以高山湖泊沉积物为例说明该实验流程，并讨论了该技术与其他方法相比的优势与局限性。该方法可根据特定目的进行修改；例如，可与其他技术相结合 ¹⁵氮示踪剂用于评估硝化和反硝化作用或田间过程 原位 反硝化速率的测定

引言

人类活动对氮循环的改变是地球系统面临的最具挑战性的问题之一¹。人类活动至少使生物圈中活性氮的含量增加了一倍以上²。然而，关于如何评估全球氮循环仍存在较大的不确定性。少数通量估算的误差小于±20%，而许多估算的不确定性达到±50%甚至更高³。这些不确定性表明，迫切需要准确估算不同生态系统中的反硝化速率，并深入理解其变异的潜在机制。反硝化是一种微生物过程，通过该过程，含氮氧化物（主要是硝酸盐和亚硝酸盐）被还原为双原子氮气体，即N₂O和N₂⁴。该过程对生物圈中活性氮的可利用性具有重要意义，因为它是活性氮从生态系统中移除的主要途径⁵。N₂O是一种温室气体，在100年时间尺度上的增温潜势是CO₂的近300倍，且由于排放量巨大，目前已成为平流层臭氧耗竭的主要原因^6,7。

下文介绍了一种利用岩芯和N₂O微传感器实验测定沉积物反硝化速率的方案（图1）。反硝化速率通过乙炔抑制法^8,9以及在特定时间段内N₂O积累量的测量来估算（图2和图3）。我们以高山湖泊沉积物为例，展示了该方法的应用。该案例研究突出了该方法在检测相对较低反硝化速率时的性能，同时对沉积物物理结构的扰动最小。

反硝化作用的测量尤为困难¹⁰存在多种替代方法和途径，每种方法都有其优缺点。现有方法的局限性包括需要使用昂贵的资源、灵敏度不足，以及需要改变底物浓度或通过扰动样品来调整工艺的物理构型¹⁰测量N的一个更为根本的挑战₂ 是其在环境中较高的本底水平¹⁰. N的还原₂O 到 N₂ 受乙炔（C₂H₂）抑制₂H₂)^8,9因此，通过测量累积的N可定量反硝化作用₂O 在 C 存在下₂H₂，这得益于环境中较低的N₂O水准

约40年前开发了利用C₂H₂测定沉积物中反硝化速率的方法¹¹，约10年后引入了N₂O传感器¹²。目前应用最广泛的基于乙炔的方法是“静态核心法”。该方法在向密闭沉积物核心顶空加入C₂H₂后，于长达24小时的培养期间测定累积的N₂O¹⁰。本文所述方法遵循这一流程并进行了若干改进：我们通过将气体在核心水相中鼓泡数分钟的方式加入C₂H₂，并在使用微传感器测定N₂O累积之前，先用样品水完全填充顶空部分。此外，我们还引入了一个搅拌系统，可在不重新悬浮沉积物的前提下防止水体分层。该方法可定量测定单位沉积物表面积的反硝化速率（例如，µmol N₂O m^-2 h^-1）。

反硝化作用在空间和时间上的高度变异性为其准确定量带来了另一项挑战¹⁰。通常，通过采集培养过程中顶空样品并使用气相色谱法依次测定氧化亚氮（N₂O）的累积量。本文所述方法通过微传感器提供连续信号，从而实现了对N₂O累积时间变化的更优监测。微传感器万用表是一种数字微传感器放大器（皮安计），可连接传感器和计算机（图1a）。该万用表支持同时使用多个N₂O微传感器。例如，可同时测量来自同一研究地点的最多四个沉积物岩芯，以反映空间变异性。

与某些其他方法相比，该核心方法对沉积物结构的扰动极小例如，泥浆）。若沉积物的完整性被改变，则会导致反硝化速率失真¹³ 仅适用于相对比较。与芯样法相比，淤浆法测得的速率始终更高。¹⁴，因为后者保留了底物扩散对反硝化的限制作用¹⁵泥浆测量结果不能被视为具有代表性 原位 速率¹⁶；它们为采用完全相同程序进行的比较提供相对测量值。

所述方法适用于估算任何可钻取岩心的沉积物类型的反硝化速率。我们特别推荐该方法用于对某些驱动因子进行实验性调控。例如，通过改变硝酸盐有效性和温度来估算反硝化作用的活化能（E_a）的实验¹⁷（图2）。

图 1：实验装置。（a）使用沉积物柱状样和N₂O微传感器估算沉积物反硝化速率的一般实验装置。培养室可确保黑暗环境和受控温度（±0.3 °C）条件。可同时处理五个完整的沉积物柱状样，并分别配备相应的N₂O传感器。（b）N₂O传感器校准室。我们使用橡胶塞和注射器对其进行了改装，以混合含N₂O的水（见实验步骤3.4.3）。其中配有温度计以监测水温。（c）沉积物柱状样样本的特写，传感器已插入PVC盖中央的孔中，接缝处用胶带密封。搅拌子悬于水中，电磁搅拌器靠近搅拌子并固定在亚克力管外侧。（d）由金属部件保护的N₂O微传感器尖端特写。（e）刚刚采集的沉积物柱状样。该样本从深水湖泊中的船上采集；带有沉积物柱状样的亚克力管仍固定在适配信使装置的重力采样器上¹⁹。有关执行本方法所需全部材料，请参见材料表。请点击此处查看此图的放大版本。

方案

1. 准备

注意：在进行测量的前一天开始此步骤。

1. 组装测量装置（图1a，参见 材料表).
   注意：为确保持续且高质量的电源供应，测量设备需连接至握把 通过 一种不间断电源（UPS），也可作为备用电源。在长时间断电的情况下，汽车电池可作为额外的电源。
2. 启动传感器软件，并施加 -0.8 V 电压 极化 N₂O型微传感器信号显示快速下降，随后上升，最后逐渐降低直至达到低而稳定的状态。
   注意：微传感器制造商建议至少极化过夜（或更长时间），以确保传感器信号的稳定性。另一个建议是，如果计划在多日或连续数天内进行测量，应保持传感器处于极化状态。¹⁸.
3. 打开孵育室电源 调整实验条件 (例如，选择关闭光源并将温度设置为与田间预期条件相似的水平。在室内放置一个装有去离子水的容器，以便后续在测量温度下使用该水对传感器进行校准。
   注意：此步骤可在计划测量当天、出发采集岩心之前完成。对于标准测量，建议在避光条件下进行。
4. 打包野外取样所需材料：取芯装置、采样管、橡胶塞、聚氯乙烯（PVC）阀门、螺丝刀、全球定位系统（GPS）设备、温度计、手持测深仪、涉水裤和充气式橡皮艇（参见 材料表）。使用清单以确保包含所有材料。

2. 沉积物岩心采集

1. 根据水深，执行 2.1.1 或 2.1.2。
   1. 对于深水水体
      1. 从船只或平台上使用配重式重力采泥器（适用于信使装置）¹⁹（图 1e）。
      2. 使用螺丝刀将采样管（丙烯酸材质，ø 6.35 cm，长度 ≥ 50 cm）固定在采泥器上。
      3. 根据研究目标选择采样点。记录位置（例如，使用 GPS 坐标）和测量水深（例如，使用手持式测深仪）。若从船上采样，应使用锚（例如，装有石块的袋子）以防止在采集岩芯过程中船只漂移。
      4. 将采样装置下放至距沉积物约 1 m 处。使用带有规律标记的绳索（例如，每 1 m 一个标记）控制采样设备的深度位置。
      5. 稳定采样设备 60 秒（例如，以尽量减少船只晃动）。这将确保沉积物被正确穿透，并获得扰动极小的沉积物岩芯。
      6. 再释放约 1 m 的绳索，使采样管插入沉积物中。注意若插入过深，可能会扰动水-沉积物界面。
      7. 释放信使装置，同时尽量保持绳索张力，使采泥器保持固定并处于垂直状态。当信使撞击采泥器时，可在绳索张力上感受到轻微变化。此时关闭采泥器，形成真空，以便回收沉积物岩芯。
      8. 通过持续而轻柔地拉绳回收采泥器。
      9. 当岩芯接近水面但仍完全浸没（包括确保真空的采泥器橡胶部分）时，在采样管底部放置一个橡胶塞。检查水-沉积物界面；界面应清晰且无明显扰动（图 1e）。若不符合要求，则弃去该岩芯，清洗采样管，并重复步骤 2.1.1.4–9。
      10. 将整个采样系统从水中提起。将采样管从采泥器上取下，并在顶部加盖 PVC 封盖，用胶带密封。避免产生气隙。
   2. 对于沿岸生境和浅水水体
      1. 在极浅水域（<0.6 m）采样时，应穿戴涉水裤。
      2. 在较深水域（最深至 3 m）采样时，使用浮潜装备或水肺装备。
      3. 根据研究目标选择采样点。记录位置（例如，GPS 坐标）。手动将采样管（例如，丙烯酸材质，ø 6.35 cm）插入沉积物中。
      4. 在采样管顶部放置橡胶塞以形成真空。
      5. 将岩芯从沉积物中取出，并迅速在采样管底部插入另一个橡胶塞。
         注：操作过程中必须始终在水下进行；在极浅区域，建议将采样管缩短至 20 cm。有时沉积物含水量较高，当采样管从沉积床中取出时会发生排水。此时，必须在不将岩芯提出沉积物的情况下插入底部橡胶塞。为此，可手动将橡胶塞浸入采样管周围的沉积物中，并小心放置以封闭管底。
      6. 离开水体后，将顶部橡胶塞替换为 PVC 封盖，并用胶带密封连接处。
2. 在将岩芯转移至实验室的过程中，应尽量减少旋转和震动，以保护样品。

3. 一氧化二氮（N₂O）微传感器的校准

1. 使用计算机（条形图、传感器软件）检查传感器信号是否稳定且处于低水平（<20 mV
2. 创建一个新文件（例如，记录校准值和传感器信号，并注明日期和采样地点（130903_Redon_Lake）。
   注意：传感器信号对温度敏感（图4）。使用 相同温度 用于测量和传感器校准。该传感器在0%-2.5% N范围内呈线性响应。₂O²⁰因此，两点校准已足够¹⁸.
3. 用于校准 零氧化亚氮时的数值，保持传感器尖端浸没在N中，读取传感器信号₂无氧水（去离子水）
4. 用N校准₂O水至所需浓度。
   ​注意：使用含有确定氮含量的水进行配制₂O浓度，该浓度将略高于孵育期间预期的最大浓度。我们使用约25 µM的N₂O 作为校准值。注意不要超过传感器最大范围浓度 500 N₂O µM
   1. 获取 N₂通过鼓泡N使水达到O饱和₂在去离子水中浸泡几分钟。
      注意：N₂氧气的溶解度取决于温度和盐度²¹；参见传感器手册附录中的表格¹⁸.
   2. 稀释 N₂通过加入一定体积的饱和N来使水达到饱和₂O水至去离子水的体积。例如，在20 °C时，加入0.3 mL饱和N₂O 水，其氮浓度为 28.7 mM₂O，加水至总体积为375 mL，以获得22.9 µM的N₂O浓度。注意，375 mL是校准室的总体积（图1b).
   3. 轻轻混合N后₂用去离子水在校准容器中稀释饱和水，使其达到所需浓度，待传感器信号稳定后读取数值。该读数为 X µM N 的校准值₂哦，水混合溶液时需小心避免产生气泡，否则会消除N₂来自校准溶液的O
      注意：请注意 N₂水中的氧气会缓慢逸散到空气中，因此配制好的校准溶液只能使用几分钟。

4. 岩心制备与乙炔抑制

1. 更换每个沉积物岩心顶部的PVC盖，换为带有中心孔和悬挂式磁力搅拌器的新盖。用胶带重新密封连接处。
2. 将每个样品的水相减少至大约12 cm的高度（体积≈380 mL）。为此，首先将硅胶管插入中心孔中，然后将沉积物芯样放入圆筒内，并推动底部塞子以产生压力。塞子和沉积物样品上升，多余的水通过管子排出，用水接收容器收集流出的水。
   注意：在此步骤中，颗粒较粗的样品可能会带来问题。若沉积物颗粒卡在塞子与管壁之间，可能导致塞子变形，形成通气小孔，使气泡通过并干扰样品。为避免此问题，应将圆筒对准底部塞子中心，并尽量以均匀的力度推入。用于排出多余水的硅胶管与PVC外罩之间的接头包含一个固体部分（例如，一个去除了最细端的5 mL移液器吸头）插入硅胶管中。
3. 通过乙炔抑制法进行操作 乙炔气体鼓泡 在核心的水相中静置约10分钟。避免重新悬浮沉淀物。
   注意：作为该方法的一种可能改进，在通入乙炔进行潜在反硝化作用测定之前，可通过浓缩液体培养基添加底物（硝酸盐）。例如，如同 图3b, c).

5. 反硝化作用（N₂O 累积量测定）

1. 用之前剩余的水填满样品中的所有空气空间。将传感器通过顶部PVC盖的中央孔插入沉积物岩心中。传感器的尖端应位于搅拌器上方的水相中。图1c).
   注意：在测量过程中，必须密封丙烯酸采样管的所有接头，以防止气体和水泄漏。图1a，c）。在管子的底部，使用橡胶塞即可满足密封需求。而上部的密封则较为困难，需要对PVC盖进行调整。应使用喷灯加热PVC盖，待其材料变软但未烧焦时，将其置入管中，以便塑形。冷却后，还需对盖子进行进一步修整（但用于在步骤2.1.1.10或2.1.2.6中将样品运送至实验室的盖子除外）。需钻出中央孔洞以插入传感器。搅拌子可用鱼线悬挂，并用胶水将鱼线固定在盖子内侧，使搅拌子通过鱼线悬于水中图1c）。此外，所有接头（PVC保护管和PVC保护传感器）均用弹性胶带密封。使用弹性胶带调节传感器的直径，以密封PVC保护罩中央孔与传感器之间的接触面。图1c).
2. 打开搅拌系统中的电磁脉冲电路。
   注意：搅拌系统可防止水相分层，同时不会扰动（重新悬浮）沉淀物。该搅拌系统由一个电路组成，用于控制电磁铁的开关，从而吸引/释放磁力搅拌子（参见 材料列表 有关详细描述）。
3. 移动电磁铁至亚克力管外壁周围，直至搅拌子持续转动，然后用胶带将其固定在该位置（图1c).
4. 关闭孵育室以确保温度恒定（例如，±0.3 °C 的变化范围。
5. 按下记录按钮（传感器软件）以 开始记录传感器信号通常每5分钟记录一次读数。
6. 按下停止按钮 测量周期结束.

6. 最终测量步骤

1. 在读取零 N₂O 校准测量信号前，至少等待约 10 分钟，使传感器尖端浸没于无 N₂O 水（去离子水）中。
2. 进行最终传感器校准。为此，请按照第 3 节步骤重新执行传感器校准，但从步骤 3.3 开始。
3. 保存文件（传感器软件）。

7. 反硝化速率计算

1. 从传感器软件生成的表格输出文件开始，该文件包含传感器信号（mV 和 µM N₂O）的记录以及校准数据。
2. 绘制传感器信号随时间变化的曲线，以可视化 N₂O 的累积趋势（例如，图 2a）。
3. 仅使用呈现线性累积的时间段，排除样品的初始适应期以及由于底物限制可能导致的最终饱和阶段（例如，图 2b）。建立传感器信号（µM）随时间（h）变化的线性模型。
   注意：该线性模型的斜率即为反硝化速率（µM N₂O core^-1 h^-1），若除以岩芯的面积（πr²），可转换为 µM N₂O m^-2 h^-1；若再乘以水体体积（πr²h，其中 h 为水相高度，r 为亚克力管的内半径，本例中分别为 0.12 m 和 0.03175 m），则可转换为 µmol N₂O m^-2 h^-1。

结果

在2013年至2014年期间，采用上述方案对中国台湾 Pyrenean 山区湖泊沉积物中的反硝化速率进行了共计468次估算。我们展示了其中部分结果以说明该实验流程（图2 和 图 3）。通常情况下，N 之间的线性模型₂O浓度与时间具有良好的相关性（R² ≥ 0.9）。该关系的斜率用于估算反硝化速率（步骤 7.3； 例如, 图2d）。如果反硝化活性非常低，传感器的电子噪声将变得更加显著，拟合优度随之下降（例如，传感器4和5在 图 2b 和 图 3a）。尽管N的基线检测限₂O₂在水中的浓度约为0.1 µM²²

讨论

所述方法的主要优点在于使用了扰动极小的沉积物岩心样本，并能够连续记录N₂O积累。这些方法可用于估算相对较低的反硝化速率，该速率可能与实际发生的反硝化速率相近 原位然而，本文讨论了关于取芯、传感器性能及潜在改进的一些方面。

方法中一个看似简单但至关重要的步骤是获得良好的岩心回收率。沉积物/水界面必须满足三个标准：（i）其化学组成或组分未发生改变，（ii）含水量或孔隙比未发生变化，（iii）结构未受到扰动²⁴样本在整个实验流程中受到的干扰越少，结果就越真实、越接近 原位 测得的反硝化速率将取决于这些条件。沉积物柱状样采集有多种设备/技术可供选择²⁵，其选择取决于水深。我们使用一种适配信使装置的重力采样器¹⁹ 对于深层样本（图1e因为它是一种重量较轻的设备，能够快速获取短岩心

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
适用于信使的重力采样器	-	-	参见文稿中的参考文献。由 Glew, J. 制作。
采样管	-	-	丙烯酸材质。尺寸：100 cm（高）× 6.35 cm（内径）× 6.50 cm（外径）。需将插入沉积物一端的边缘打磨锋利，以尽量减少所获取沉积物岩心样品的扰动。
手持式测深仪	Plastimo	38074	Echotest II 测深仪。
橡胶塞	VWR	DENE1012114	带两个孔，用于在标定室中混合N2O-水。尺寸：20 mm（高）× 14 mm（内径）× 18 mm（外径）（孔径 3 mm）。
橡胶塞	VWR	217-0125	用于密封亚克力管底部，并在浅水水体中进行采样。尺寸：45 mm（高）× 56 mm（内径）× 65 mm（外径）。
橡胶塞	VWR	217-0126	将橡胶塞置于采样管顶部，以形成真空，用于在近岸带和浅水水体中采样。尺寸：50 mm（高）× 60 mm（内径）× 70 mm（外径）。
PVC 封盖	-	-	用于密封丙烯酸管的顶部。尺寸：45 mm（高）× 56 mm（内径）× 65 mm（外径）。尺寸：65 mm（外径）。
防水胶带	-	-	防水型。用于确保所有接头（PVC 封盖与采样管、PVC 封盖与传感器）密封，防止漏水。
温度计	-	-	便携式且防水，用于在采集岩心样品后立即测量沉积物上方水体的温度。
全球定位系统（GPS）	-	-	用于记录新采样点的位置或前往先前的采样点。
涉水裤	-	-	用于近岸带或浅水区域的采样。
船只	-	-	若采样点无法通过汽车抵达，充气船因其轻便性为最佳选择。
绳索	-	-	带有标记以显示长度的绳索（例如，使用颜色编码区分每一米）。
N2O 气瓶及减压阀	Abelló Linde	32768-100	气瓶型号。
C2H2 气瓶及减压阀	Abelló Linde	32468-100	气瓶型号。
用于排出多余水的导管	-	-	由一个实心部件（例如，去掉最细端的 5 ml 移液器吸头）插入硅胶管中构成。
带帽氧化亚氮微型传感器	Unisense	N2O-R	我们同时使用 4 个传感器。
四通道微传感器多用表（4 个皮安通道）	Unisense	Multimeter	皮安计连接至笔记本电脑。标准设备支持两个传感器皮安计连接（例如 N2O 传感器）、一个 pH/mV 通道和一个温度计。我们定制了具有四个皮安计连接的设备，可同时使用四个 N2O 传感器。
SensorTrace Basic 3.0 Windows 软件	Unisense		传感器数据采集软件。
带泵的标定室	Unisense	CAL300	标定室。我们使用橡胶塞和注射器对其进行改装，以便在不产生气泡的情况下混合 N2O-水。
培养室	Ibercex	E-600-BV	在恒定温度（±0.3 °C）下工作的必备设备。还可控制光周期。
电动搅拌器	-	-	搅拌系统的一部分。通过鱼线悬挂在水体中，位于待测沉积物上方，鱼线固定在 PVC 封盖上。
电磁铁	-	-	搅拌系统的一部分。固定在丙烯酸管外侧，大致与搅拌器处于同一水平位置。通过电路间歇性激活（约每秒一次开关），通电时吸引搅拌器，断电时释放，从而产生搅动水流的运动。
电磁脉冲电路	-	-	搅拌系统的一部分。通过导线连接至电磁铁，发送电流脉冲以控制电磁铁的通断。
不间断电源（UPS）	-	-	提高到达测量设备的电能质量，过滤电压的波动，从而确保 N2O 传感器信号更加稳定和恒定。