连续无创测量小龙虾心脏及行为活动

摘要

本文介绍了一种用于持续记录和分析小龙虾心脏活动与运动活动的无创生物监测系统。该系统由近红外光学传感器、视频追踪模块以及用于评估反映小龙虾生理状态并在心率波动期间表征其行为的心跳分析软件组成。

摘要

小龙虾是一种重要的水生生物，既可作为无脊椎动物行为学和生理学研究的实用生物学模型，也可作为水质状况的有效生物指示剂。尽管小龙虾无法直接指明导致水质恶化的具体物质，但它们能够通过心脏活动和行为活动的急性变化，在数秒内迅速向人类发出水质恶化的预警。

本研究介绍了一种非侵入性方法，由于该方法将简便性与可靠性集于一个模型之中，因此足够简单，可在各种条件下实施。

这种将生物体引入环境评估过程的方法，能够对周围环境中突发的水质恶化提供可靠且及时的预警，从而防止水质急剧下降。因此，本研究探讨了一种基于小龙虾生理学和行为学参数记录的无创系统，用于检测水生环境的变化。该系统目前已应用于一家本地啤酒厂，用于控制 饮料生产用水的质量，但也可用于任何水处理和供水设施，实现水质的连续实时评估，以及开展小龙虾心脏生理和行为的常规实验室研究。

引言

水生生物的应用研究，无论是作为各种实验室研究的模式生物^1,2，还是作为监测工业及自然/环境水质的工具^3,4，均已得到广泛研究。然而，无论人们是否属于科学界或其他职业领域，这一主题对人类而言仍具有显著的重要性。尽管目前已存在多种先进的方法用于监测某些特定参数（即所谓的"生物标志物"）^5,6,7,8，但选择指示生物时最重要的要求仍包括三个简单因素：(i) 简便性，(ii) 可靠性，以及 (iii) 普遍可获得性。

小龙虾作为淡水动物的重要代表，因其在全球范围内广泛分布，且在大多数情况下⁹具有足够大而坚硬的头胸甲，便于操作，因而具有显著特点。这种甲壳类动物属于高等无脊椎动物，其重要的生理系统和相应器官已得到充分发育，同时仍保持相对简单的结构¹⁰。

基于科学文献中所述的小龙虾生物学和/或行为学参数范围的评估方法，已显著推动了生物监测及小龙虾研究的整体发展。目前可用的大多数侵入性小龙虾心率测量方法均依赖于心电图记录，此类方法需要复杂且精密的外科手术操作^11,12,13；这些操作可能对小龙虾造成显著应激，并需要其进行较长时间的适应。此外，尚不清楚小龙虾能够携带此类电极多长时间，以及在携带此类装置的情况下是否能够顺利完成蜕皮。已有描述的非侵入性方法则基于体积描记法记录，但该方法受限于硬件的复杂性，需要配备用于信号滤波的调理电路¹⁴，以及放大装置或精密且昂贵的光学组件^15,16。

本研究介绍了一种方法，该方法不仅补充了现有研究成果，还为改进当前的小龙虾心率测量流程提供了新的替代方案。其优势包括：（i）快速且无创的传感器安装方式，无需长时间的生理适应；（ii）小龙虾可在一次蜕皮到下一次蜕皮期间（数月内）持续携带传感器；（iii）配套软件能够实时监测小龙虾的心脏活动和行为表现，并可同步分析多只小龙虾的实验数据；（iv）制造成本低且结构简单。本文所描述的生物监测系统，能够基于小龙虾的生态生理特征变化，实现对其心脏活动和运动行为的无创、连续监测。该系统不仅可广泛应用于实验室中对小龙虾心脏生理学和/或行为学的研究，也可用于工业领域，例如在水处理及供水设施中用于水质监控。

方案

1. 螯虾的选择

1. 为了成功将本方法应用于小龙虾，应选择具有足够头胸甲尺寸（即头胸甲长度至少为30 mm）的成年个体用于传感器安装，目视检查其无疾病症状，并确认在触碰时能同时举起双螯。上述参数表明小龙虾处于适宜的健康状态。
   注意：若试验中需使用多只小龙虾并使其暴露于相同条件下，实验组的组建应基于以下多个参数：(i) 相近的体重和体长；(ii) 相近的心率；(iii) 明显的夜间活动性；(iv) 正常的摄食行为；(v) 处于蜕皮间期¹⁷。有时仅通过心率测量、视觉或触觉检查难以判断小龙虾是否接近蜕皮期；因此，分析其血淋巴总蛋白含量可能具有帮助。预计当小龙虾接近蜕皮期时，其血淋巴蛋白含量高于蜕皮间期¹⁸。

2. 螯虾心脏活动与行为的记录

1. 为了无创测量小龙虾的心率，需预先为此实验步骤准备传感器。在此之前，将一只小龙虾放入盛有水的水箱中，使其适应环境数天，以作为传感器准备的前置步骤。¹⁹ 也需要几天时间。
   1. 将红外发光二极管（LED）与光电晶体管进行同轴耦合。将光学传感器电路安装在电路板上，其需要5 V电源供电。连接LED时，在红外传感器电路板上放置一个200 Ω电阻；连接光电晶体管时，在电路板上放置一个220 Ω电阻。
   2. 当传感器连接到小龙虾时，其输出信号会受到小龙虾心肌中血淋巴充盈量的调制，并散射来自LED的入射光。为避免LED发出的红外光与光敏三极管接收到的小龙虾心脏反射红外光之间产生相互干扰，请在LED与光敏三极管之间放置一块黑色防静电塑料小隔板（尺寸为0.5 × 1.5 × 4 mm，厚度 × 高度 × 宽度）。
   3. 将LED置于防水封装中，并在传感器靠近背甲一侧的表面覆盖防水介电凝胶，以保护电子元件免受潜在损伤图1将凝胶干燥3天，以获得最佳保护性能。
   4. 对于模拟信号，将细长的柔性电缆（约3米长）连接至传感器，并接入模数转换器（ADC）；随后，数字化信号将通过USB接口传输至个人计算机，在此通过专用软件实时保存并分析有关螯虾心脏活动的信息（参见 材料表，并储存以供进一步详细分析。
2. 传感器制备完成后，立即将其连接到螯虾。为此，打开计算机并运行软件。确定需连接传感器并记录心率的螯虾数量，以及需保存至数据文件的信息。
3. 将小龙虾从水中取出，用纸巾擦拭其背甲侧面。用纸巾包裹小龙虾的螯足和腹部，以避免手部对其造成损伤，并减少因人手温度较高而给小龙虾带来的额外应激。
   注意： 不要在传感器安装前使用冰块或冷冻机对小龙虾进行预先冷却以使其固定。温度差异会导致小龙虾背部表面渗出液体，进而导致传感器固定不可靠以及粘合剂迅速从虾壳上脱落。
4. 准备一个表面（例如取一小块平整的塑料片，或撕下一段胶带并固定在桌面上）以及一根用于混合胶水的搅拌棒。从装有环氧胶的A管和B管中各挤出一小滴（直径约0.5 cm），迅速将两滴胶液混合。
5. 将传感器固定在螯虾的背甲上，寻找心脏信号振幅最大的位置。用一只手握住带传感器的螯虾，另一只空闲的手在传感器的四根辅助导线上各滴一滴混合胶水（在步骤2.1.1至2.1.4之间完成固定）。胶水固化前至少5分钟内不得移动传感器（胶水固化时间取决于环境温度和湿度）。
   注意： 将传感器固定在螯虾头胸甲上时，应从头胸甲侧面仔细检查整个心脏区域，以确定心脏信号振幅最佳（最大）的部位。这有助于软件提供更精确的心率计算结果。
6. 用空着的手触碰胶水，若不粘手，则将已去包装且附有传感器的小龙虾放入图2) 放入无水的盒子中继续放置几分钟，直至胶水完全干燥。
   注意： 小龙虾和胶水操作的最佳温度范围为18至22 °C。在此温度范围内，胶水在5至7分钟内硬化，并在8至10分钟内完全干燥。在较低温度下，小龙虾的应激反应较轻；然而，胶水硬化所需时间更长，在15 °C和10 °C时分别需要约15分钟和20分钟。在较高温度下，尤其是超过25 °C时，胶水可在3分钟内硬化，但小龙虾的应激显著增加；因此，应尽量减少甲壳类动物在无水条件下暴露于极端环境的情况。
7. 在将螯虾移回水箱之前，将其头胸部多次浸入水中，每次间隔数秒，以排出鳃中积聚的空气， 将小龙虾置于水中约1小时，以去除任何过量的化学物质。此过程完成后，将小龙虾放入水中，并在实验条件下让其适应环境一至两周，具体时间根据观察到的生理指标而定。在适应期间，建议每隔一天进行一次最佳的水体更换。
   注意： 已适应且处于健康状态的小龙虾特征包括明显的昼夜节律性心脏活动和运动行为、规律摄食，以及在白天大部分时间停留于特定庇护所中（若提供）。

3. 相机和软件设置

1. 启动软件，视频摄像头将自动开启。
2. 选择运动检测选项，仔细检测屏幕上每个水箱的区域 ，软件将开始追踪行为并将其与心脏活动记录关联起来。
   注意： 小龙虾运动检测模块由一个从水箱下方追踪小龙虾行为的视频摄像头和一个将行为与心脏活动结合的软件组成。该模块的数据用于通过排除小龙虾表现出强烈运动活动的时段，从而促进更精确的心脏活动数据处理。小龙虾的突然运动（例如逃避反应或开始摄食）可能导致心脏信号出现波动或短暂的尖峰，从而降低心脏间期计算的精确性。

结果

因此，我们获得了小龙虾心脏活动与行为活动的组合数据，并以 txt 格式文件记录和保存（图3）。该文件除包含实验小龙虾的数量、日期和采样率外，还包括三列数据：（1）以 hh:mm:ss 格式表示的连续时间；（2）自动计算得出的心率，单位为每分钟心跳次数（beats per minute）；（3）运动状态，以无运动（0）或有运动（1）表示。当小龙虾无活动时，对应运动的单元格记为零；当其发生移动时，相应单元格则显示为1。在连续记录过程中，数据文件每天在00:00（即午夜12:00 AM）自动生成。将运动信息纳入分析至关重要，因为运动可能引起心率的变化（图4）。在第10秒时，通过蠕动泵将食物气味（研磨、过滤并稀释的摇蚊幼虫）送入盛有小龙虾的水箱中。在第14秒，小龙虾识别到刺激，由于所谓的朝向反应（orienting response），其心率略有下降。在第20秒时，心率开始上升，导致心跳间期缩短。在第26秒，小龙虾向刺激源移动，食物气味引起的生理兴奋以及运动的启...

讨论

已有广泛观点认为，测量某些生理参数（如心率、呼吸频率或二者同时测量）是记录小龙虾反应的一种比评估行为反应更可靠的方法，因为行为反应并不总是立即出现¹¹。然而，显然在评估小龙虾对环境变化的真实反应时，最有效的方法是将心脏活动与行为记录相结合，因为这种方法能够揭示小龙虾心跳变化的原因，以及这些变化究竟是由于周围环境中的化学变化引起，还是由于运动启动所致。在进行水质监测时，必须消除所有外部因素对小龙虾生理指标变化的影响，包括那些会显著影响心率但并不对生物监测系统构成警报的突然运动。

另一种有助于实现更精确、更详尽的心跳评估的方法是分析螯虾心脏活动的变时性和变力性参数，这些参数主要与螯虾心脏信号中的特定波形相关¹⁹。此类分析证实，即使心跳每分钟仅变化几个节拍，某些次要参数仍可反映出螯虾心脏活动的显著变化¹⁹。

尽管使用上述方法具有诸多优势，但围绕小龙虾监测的研究正朝着最大限度减少对小龙虾触觉操...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
红外LED二极管	KINGBRIGHT ELECTRONIC	KP-3216F3C
光电晶体管	EVERLIGHT	ELPT15-21C
电阻器	ROYAL OHM	0805S8J0201T5E
电阻器	ROYAL OHM	0805S8F2200T5E
电容器	KEMET	C0805C334K5RACTU
电缆	TECHNOKABEL	FTP KAT.5E 4X2X0,14C
连接器	HARTING	21348100380005
连接器	HARTING	21348000380005
介电凝胶	KRAYDEN	Sylgard 535
模数转换器	TEDIA	UDAQ-1416CA
胶水	KUPSITO.SK	7338723044
Kinect视频摄像头	ABCSTORE.CZ	GT3-00002
分析软件	捷克布杰约维采南波希米亚大学 渔业与水体保护学院 复杂系统研究所		软件链接：www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring 用户名：frov 密码：CF2018