我们介绍一种基因组工程工作流程，用于构建可模拟前病毒在特定基因组位点整合的新一代体外HIV-1感染模型。通过CRISPR-Cas9介导的位点特异性基因组编辑，可实现对HIV来源报告基因的靶向整合。本文提供了单细胞克隆生成、筛选及正确靶向验证的详细实验方案。
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方法文章
基于CRISPR-Cas9的基因组工程构建整合位点特异的HIV-1感染Jurkat报告模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
人类免疫缺陷病毒（HIV）会将其前病毒DNA非随机地整合到宿主细胞基因组中的特定重复位点和基因组热点区域。本文介绍了一种利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术，构建具有选定基因组整合位点的新型体外HIV感染模型的详细实验方案。通过该方法，可将选定的报告基因序列整合至特定的目标基因组位点，从而模拟临床上相关的整合位点。
本方案中描述了HIV来源的报告基因的设计、靶位点及gRNA序列的选择。构建带有同源臂的靶向载体，并将其转染至Jurkat T细胞中。在靶位点处，Cas9介导产生双链断裂，促进通过同源重组将报告基因序列靶向整合到选定的基因组位点。通过流式细胞术和PCR筛选单细胞克隆以检测靶向事件。挑选阳性克隆进行扩增，并通过PCR、测序和Southern印迹法验证正确的靶向整合。同时分析CRISPR-Cas9介导的基因组编辑可能产生的脱靶效应。
通过使用本方案，可建立模拟HIV感染临床相关整合位点的新型细胞培养系统。尽管单细胞克隆的建立以及报告基因序列正确整合的验证过程较为耗时，但所获得的克隆细胞系是功能上分析前病毒整合位点选择的有力工具。
引言
感染后前病毒DNA整合到宿主基因组中是人类免疫缺陷病毒（HIV）生命周期中的关键步骤。整合完成后，HIV通过在长寿的CD4+ T细胞亚群（如记忆性CD4+ T细胞）中建立潜伏状态而持续存在。HIV的整合似乎并非随机事件1,2。多项研究通过对急性和慢性感染个体中整合位点进行测序，已检测到多个基因组热点区域，这些区域反复出现前病毒DNA的整合2,3,4,5,6,7,8。有趣的是，在某些整合位点，同一基因座在大量感染细胞中被检测到，这提示在重复位点的整合可能对克隆扩增具有促进作用1。
为了加深对重复整合位点重要性的理解，必须探究前病毒整合位点的选择机制。然而，若干技术因素限制了对HIV整合位点选择及其后果的研究。目前广泛使用的HIV潜伏细胞培养模型（如JLat....
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方案
1. 基因组编辑的靶向策略及靶向载体（tv）设计
注意：基因组编辑的第一步是选择并制备用于CRISPR-Cas9介导靶向所需的工具。在此之前，应完成基因组整合位点的选择、靶向细胞类型的确定，以及用于整合的HIV来源报告基因的设计。本方案描述了将HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA最小报告基因靶向整合至Jurkat靶细胞的过程。基于CRISPR-Cas9的靶向、克隆细胞系的构建、筛选与验证工作流程如图1所示。该靶向策略利用S. pyogenes Cas9（SpCas9）在选定的整合位点产生由gRNA引导的双链DNA断裂。随后，通过提供一个包含报告基因序列且两侧分别带有5’和3’同源臂（HA）的非线性化靶向载体（tv），经同源重组将报告基因靶向插入至选定的基因组位点11。
- 靶向位点、gRNA及靶向载体设计的选择
- 根据具体的科学问题选择要靶向的基因组位点。参考不同研究中发表的患者体内HIV反复整合位点列表2,3,4,
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结果
在本代表性实验中，我们选择将一个最小化的HIV-1来源报告基因靶向至BACH2基因第5内含子的两个位点，该报告基因包含LTR、编码tdTomato的序列以及polyA信号序列17。靶位点的选择依据是：这些位点靠近既往在HIV感染者原代T细胞研究中报道的反复出现的整合位点2,4,5,6,7,8，并且含有Cas9介导双链断裂所必需的PAM基序NGG。靶向载体按照所述方案构建并转染。转染操作、检测靶向事件、单细胞克隆的建立以及克隆的筛选与挑选的整体流程如图1所示。
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讨论
本文介绍了一种利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术，在选定的前病毒整合位点构建HIV-1来源的Jurkat报告模型的实验方案。
在规划阶段需仔细注意该方案的几个要点。首先，应谨慎选择靶向位点，因为某些位点可能比其他位点更容易靶向（例如, 取决于该区域的染色质状态以及目标序列本身）。重复序列难以克隆到靶向载体中，且在基因组中通常不具有唯一性。抑制性染色质区域使用 CRISPR-Cas9 系统进行靶向的难度较大19,20.
其次，gRNA 的选择对于 CRISPR-Cas9 介导的靶向至关重要。为了构建具有代表性整合位点的 HIV 感染模型，应使 gRNA 尽可能靠近整合热点结合。然而，该位点可能并不适合 Cas9 的招募；因此，必须在 gRNA 序列与所选整合位点的接近程度和 gRNA 质量之间做出权衡。我们发现 E-CRISP 网络工具在预测功能性 gRNA 方面具有较高的可靠性。也.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Britta Weseloh和Bettina Abel提供的技术协助。同时感谢Arne Düsedau和Jana Hennesen（流式细胞术技术平台，Heinrich Pette研究所）提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | 用于表达 SpCas9 和 gRNA 的载体 |
| pMK | GeneArt | 用于克隆的哺乳动物表达载体 | |
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | 用于克隆的哺乳动物表达载体 |
| BbsI | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | R0539S | 限制性内切酶 |
| NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | E5520S | 用于靶向载体构建的无缝克隆试剂盒 |
| TaqPlus Precision PCR System | 安捷伦科技（Agilent Technologies） | 600210 | 具有校对活性的DNA聚合酶，用于扩增同源臂（步骤1.2.2.2）、验证整合位点和报告基因序列（步骤3.3.3和3.3.5）、生成Southern blot的基因组探针（步骤3.4.1.5）以及脱靶事件分析（步骤3.5.4） |
| 96孔组织培养板（圆底） | TPP | 92097 | 用于稀释涂布的组织培养板 |
| Phusion高保真DNA聚合酶（Phusion High-Fidelity DNA polymerase） | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | M0530 L | 用于检测靶向事件（步骤2.4.2）和生成Southern blot用报告基因特异性探针（步骤3.4.1.4）的DNA聚合酶 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | D9170 | 作为PCR添加剂的二甲基亚砜 |
| 氯化镁（MgCl2）溶液 | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | B9021S | 作为PCR添加剂的MgCl2溶液 |
| 脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物 | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | N0447S | 每种核苷酸浓度为10 mM的dNTP混合物，用于PCR反应 |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | 即用型PCR预混液，用于筛选PCR（步骤3.2.11） |
| QIAamp DNA血液微量试剂盒（QIAamp DNA blood mini kit） | 凯杰（Qiagen） | 51106 | DNA提取与纯化试剂盒 |
| QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAquick PCR Purification Kit） | 凯杰（Qiagen） | 28106 | PCR纯化试剂盒 |
| 不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（RPMI 1640 without glutamine） | 龙沙（Lonza） | BE12-167F | 细胞培养基 |
| 南非胎牛血清批次（Fetal Bovine Serum South Africa Charge） | PAN Biotech | P123002 | 细胞培养基添加剂 |
| L-谷氨酰胺（L-glutamine） | Biochrom | K 0282 | 细胞培养基添加剂 |
| 青霉素/链霉素 10,000 U/mL / 10,000 µg/mL | Biochrom | A 2212 | 细胞培养基添加剂 |
| Gibco Opti-MEM低血清培养基（Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media） | 赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific） | 31985062 | 经优化用于转染的低血清浓度细胞培养基 |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | 转染试剂 |
| 佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate） | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | P8139-1MG | 细胞培养试剂 |
| 离子霉素（Ionomycin） | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | I0634-1MG | 细胞培养试剂 |
| 注射器驱动式滤器单元，PES膜，0.22 µm | Millex | SLGP033RB | 用于无菌过滤的滤器单元 |
| Heracell 150i 培养箱 | 赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific） | 51026280 | 组织培养用培养箱 |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | 带正电荷的尼龙膜，用于DNA和RNA印迹 |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | 紫外交联仪 |
| High Prime | 罗氏（Roche） | 11585592001 | 使用随机寡核苷酸作为引物，以放射性dCTP标记DNA的试剂盒 |
| illustra ProbeQuant G-50 微型纯化柱（illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns） | GE Healthcare | 28-9034-08 | 用于纯化标记DNA的层析离心柱 |
参考文献
- Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
- Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 ....
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