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方法文章

基于CRISPR-Cas9的基因组工程构建整合位点特异的HIV-1感染Jurkat报告模型

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⸱

DOI：

10.3791/58572

⸱

2018年11月14日

 ,  ,  , 
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Department of Anesthesiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 3German Center for Infection Research (DZIF)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种基因组工程工作流程，用于构建可模拟前病毒在特定基因组位点整合的新一代体外HIV-1感染模型。通过CRISPR-Cas9介导的位点特异性基因组编辑，可实现对HIV来源报告基因的靶向整合。本文提供了单细胞克隆生成、筛选及正确靶向验证的详细实验方案。

摘要

人类免疫缺陷病毒（HIV）会将其前病毒DNA非随机地整合到宿主细胞基因组中的特定重复位点和基因组热点区域。本文介绍了一种利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术，构建具有选定基因组整合位点的新型体外HIV感染模型的详细实验方案。通过该方法，可将选定的报告基因序列整合至特定的目标基因组位点，从而模拟临床上相关的整合位点。

本方案中描述了HIV来源的报告基因的设计、靶位点及gRNA序列的选择。构建带有同源臂的靶向载体，并将其转染至Jurkat T细胞中。在靶位点处，Cas9介导产生双链断裂，促进通过同源重组将报告基因序列靶向整合到选定的基因组位点。通过流式细胞术和PCR筛选单细胞克隆以检测靶向事件。挑选阳性克隆进行扩增，并通过PCR、测序和Southern印迹法验证正确的靶向整合。同时分析CRISPR-Cas9介导的基因组编辑可能产生的脱靶效应。

通过使用本方案，可建立模拟HIV感染临床相关整合位点的新型细胞培养系统。尽管单细胞克隆的建立以及报告基因序列正确整合的验证过程较为耗时，但所获得的克隆细胞系是功能上分析前病毒整合位点选择的有力工具。

引言

感染后前病毒DNA整合到宿主基因组中是人类免疫缺陷病毒（HIV）生命周期中的关键步骤。整合完成后，HIV通过在长寿的CD4+ T细胞亚群（如记忆性CD4+ T细胞）中建立潜伏状态而持续存在。HIV的整合似乎并非随机事件1,2。多项研究通过对急性和慢性感染个体中整合位点进行测序，已检测到多个基因组热点区域，这些区域反复出现前病毒DNA的整合2,3,4,5,6,7,8。有趣的是，在某些整合位点，同一基因座在大量感染细胞中被检测到，这提示在重复位点的整合可能对克隆扩增具有促进作用1。

为了加深对重复整合位点重要性的理解，必须探究前病毒整合位点的选择机制。然而，若干技术因素限制了对HIV整合位点选择及其后果的研究。目前广泛使用的HIV潜伏细胞培养模型（如JLat细胞系）并不能反映临床上具有相关性的重复整合位点9。一方面，基于原代患者来源细胞的研究虽可通过测序手段描述整合位点图谱，却无法进行功能分析。据我们所知，目前尚无合适的实验模型可用于对选定的临床相关整合位点进行功能分析。

在此，我们介绍一种利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术构建新型HIV感染模型的详细工作流程。本方案可用于构建T细胞来源的报告细胞系，以模拟HIV感染过程，其基因组中在选定整合位点处稳定整合了前病毒报告元件。因此，这些细胞系可作为研究前病毒整合位点如何影响HIV生物学特性，以及前病毒对不同治疗策略（例如, 由潜伏期逆转剂诱导的表达性）。我们的方法利用了基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术优势，通过Cas9核酸酶在靶位点诱导产生双链断裂，从而促进报告基因序列通过同源重组整合到基因组中。整合靶位点的选择依据来自对HIV感染者研究中所描述的常见整合位点的邻近区域，以及是否存在适合Cas9介导基因组编辑的PAM序列基序。

在我们的示范性结果中，我们聚焦于 BACH2 基因位点，该基因编码 BTB 和 CNC 同源性转录调控因子 2。在接受抗逆转录病毒治疗的慢性 HIV 感染个体中，BACH2 是整合型 HIV-1 序列富集的位点之一3,6,7,8,10。我们选择了一种最小化的 HIV 来源报告系统，包含源自 HIV-1 的长末端重复序列（LTR）、tdTomato 编码序列以及牛生长激素（BGH）多聚腺苷酸化信号（PA），并将其靶向定位至 BACH2 基因第 5 内含子中的两个特定位点。本方案已针对 Jurkat 细胞（一种来源于人 CD4+ T 细胞的悬浮细胞系）进行了优化，但也可适用于其他细胞系，并相应调整实验流程。我们提供了一个详细的工作流程，涵盖靶位点的选择、带有同源臂的靶向载体构建、通过 CRISPR-Cas9 技术将报告系统插入选定基因组位点、克隆细胞系的建立与筛选，以及对新构建的靶向报告细胞系进行全面验证。

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方案

1. 基因组编辑的靶向策略及靶向载体（tv）设计

注意：基因组编辑的第一步是选择并制备用于CRISPR-Cas9介导靶向所需的工具。在此之前，应完成基因组整合位点的选择、靶向细胞类型的确定，以及用于整合的HIV来源报告基因的设计。本方案描述了将HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA最小报告基因靶向整合至Jurkat靶细胞的过程。基于CRISPR-Cas9的靶向、克隆细胞系的构建、筛选与验证工作流程如图1所示。该靶向策略利用S. pyogenes Cas9（SpCas9）在选定的整合位点产生由gRNA引导的双链DNA断裂。随后，通过提供一个包含报告基因序列且两侧分别带有5’和3’同源臂（HA）的非线性化靶向载体（tv），经同源重组将报告基因靶向插入至选定的基因组位点11。

  1. 靶向位点、gRNA及靶向载体设计的选择
    1. 根据具体的科学问题选择要靶向的基因组位点。参考不同研究中发表的患者体内HIV反复整合位点列表2,3,4,5,6,7,8 作为指导原则。 计算机模拟 使用 UCSC 基因组浏览器（http://genome.ucsc.edu）提取目标基因组位点的基因组序列（完整基因序列或至少 5 kb 的基因组序列）。
    2. 使用 E-CRISP 网络工具（http://www.e-crisp.org）选择长度为 20 nt 的向导 RNA（gRNAs），以靶向目标基因组位点。
      1. 选择“Homo sapiens GRCh38”作为物种。输入在步骤1.1.1中提取的覆盖目标基因组位点的2,000 bp基因组序列。
      2. 使用中等应用设置（任意PAM，任意5’碱基，允许脱靶错配，排除内含子/CPG岛）启动gRNA搜索。将显示可能的gRNA设计方案列表，按特异性和效率从高到低排序。
      3. 选择一个gRNA，其特异性和效率得分应尽可能高，并且应尽量靠近目标基因组位点。
        注意： 必须在靠近目标基因组位点与设计特异且高效的gRNA之间找到平衡。
    3. 使用 NCBI blast 浏览器（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）将选定的 gRNA 序列与参考基因组进行比对，以验证 gRNA 结合位点的唯一性。
      1. 选择“人”作为基因组。将gRNA序列输入为查询序列。选择“高度相似序列”（megablast）作为程序。确保gRNA序列具有唯一性。若不唯一，则从步骤1.1.2.3中选择另一条gRNA并重新进行blast分析。
    4. 一旦选定gRNA序列，选择 in silico 从步骤1.1.1提取的基因组序列中，分别截取gRNA序列上下游各1,000 bp作为5’和3’同源臂（HA）。
      注意： gRNAs 应与所选的基因组整合位点区域同源，并位于原间隔序列邻近基序（PAM；例如, NGG（SpCas9的识别序列）（图2a）。tv 包含报告基因序列，该序列的 5’ 和 3’ 两端均被 HA 区域所包围。HA 区域覆盖 gRNA 序列上下游各 1000 bp 的范围11。HA中不应包含完整的gRNA序列，最多可接受5个核苷酸的重叠（图2a).
  2. gRNA 和靶向载体的构建
    注意： 有关载体图谱，请参见 图2b.
    1. 为构建表达 SpCas9 和 gRNA 的载体，使用 pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 作为骨架载体，该载体可同时表达 SpCas9 和单链向导 RNA（sgRNA）。为将 gRNA 序列克隆至该骨架中，使用 BbsI 限制性酶切位点。12.
    2. 要生成tv，选择一种高拷贝质粒作为骨架（例如, pMK 或 cDNA3.1
      1. 首先，通过Gibson组装法将报告基因（本实验方案中：LTR_tdTomato_BGH-PA）连接至载体骨架中13 使用商业化的克隆组装试剂盒，并引入5’和3’侧翼限制性酶切位点（例如, 5’ PacI 和 3’ SmaI）用于后续对HAs进行限制性消化克隆。
      2. 扩增第1.1.4步中选定的HA片段的1000 bp区域，模板为待靶向细胞类型的基因组DNA（gDNA）（本方案中：Jurkat细胞），使用具有校对活性的DNA聚合酶（参见 表1 和 2 用于PCR组分和扩增条件）。随后，在每个同源臂（HA）的5’和3’末端引入报告基因侧翼的限制性酶切位点（两端的5’ HA上为PacI，两端的3’ HA上为SmaI）。
      3. 通过限制性酶切克隆法，将HAs依次克隆至已含有报告基因（于步骤1.2.2.1中构建）的载体骨架中14,15首先使用 PacI 限制性酶切位点克隆 5’ HA，然后使用 SmaI 限制性酶切位点克隆 3’ HA。
        注意： 如果病毒骨架含有额外的荧光报告基因，可通过流式细胞术评估非目的骨架整合（见步骤3.2.2和3.2.3）。如果病毒骨架不含荧光报告基因，则必须通过PCR评估骨架整合（见步骤3.2.8）。

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图1：通过CRISPR-Cas9介导的靶向、生成和筛选具有明确整合位点的克隆报告细胞系的工作流程。（A）构建靶向载体，并将靶向载体与Cas9/gRNA表达质粒共同转导至Jurkat T细胞中。（B）转染后72小时，通过流式细胞术（FACS）富集转染成功的细胞。（C）细胞培养10至14天，通过PCR和流式细胞术确认靶向事件的发生。（D）通过有限稀释法获得单细胞克隆，并培养克隆约3周。（E）在96孔板中通过PCR和流式细胞术筛选正确靶向的克隆，并扩增选定的克隆。（F）通过Southern印迹、PCR和测序验证所选克隆的正确靶向情况，并分析Cas9核酸酶活性的脱靶效应。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：靶向策略与载体设计。（a）gRNA设计及同源臂的选择。20 nt的gRNA与选定的基因组靶位点同源，并位于PAM序列的邻近区域。同源臂应分别与gRNA上下游各1,000 bp的序列互补，且不应包含gRNA本身的序列。（b）靶向载体与gRNA/Cas9载体的示意图。靶向载体由选定的报告基因序列构成，其5'端和3'端分别被同源臂所包围。gRNA/Cas9载体基于pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9骨架构建。（c）同源重组靶向整合的示意图。将靶向载体与gRNA/Cas9载体共转染至Jurkat细胞中。Cas9在基因组靶位点介导双链断裂（以*表示），从而促进同源重组，并实现报告基因序列在基因组靶位点的整合。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 基于 CRISPR-Cas9 的 Jurkat 细胞靶向

  1. Jurkat 细胞转染
    1. 转染前24 h，接种1.25 × 106 6孔细胞培养板中每孔加入2.5 mL RPMI 1640培养基，该培养基添加有10%（v/v）胎牛血清（FCS）和4 mM L-谷氨酰胺［以下简称“不含抗生素（AB）的RPMI”］。单次靶向实验需准备一整块6孔板（即, 每孔6个，每孔含2.5 mL细胞悬液。
    2. 次日，使用适用于Jurkat细胞的转染试剂，将细胞与环状tv以及pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA共转染。
      1. 添加 2 µg 圆形电视及 2 µg 每孔加入 pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA 250 µL 在反应管中加入血清浓度降低的商用RPMI培养基（血清含量减少50%的RPMI培养基），并充分混匀。
      2. 添加 12 µL 将转染试剂缓慢加入DNA/培养基混合液中，避免接触离心管管壁，并轻轻涡旋混匀。室温孵育15分钟，然后逐滴加入至细胞的一孔中。将细胞置于37℃培养 °C 和5% CO₂2.
        注意： 转染反应的制备可按比例放大。转染后无需更换培养基。
  2. 通过荧光激活细胞分选（FACS）富集转染细胞
    1. 转染后72小时，收集转染的细胞，计数，并准备进行FACS富集。将细胞收集至50 mL锥形管中，以300 x g 室温（RT）孵育4分钟，用PBS洗涤细胞一次，再次离心，将细胞沉淀重悬于适量FACS缓冲液（PBS补充1% FCS + 1 mM EDTA）中，浓度为1 × 107 细胞/mL，最后转移至流式管中。
    2. 对细胞进行流式细胞术（FACS），分选表达tv荧光报告基因的细胞（例如, tdTomato 在本方案中）。用补充了10% FCS、4 mM L-谷氨酰胺和50 U/mL 青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基（称为“含抗生素的RPMI”）收集细胞。
    3. 分选后，加入 20 mL 含抗生素的 RPMI 培养基洗涤细胞，300 x g 离心一次 g 室温孵育4分钟。将细胞沉淀重悬于适量含抗生素的RPMI培养基中，根据FACS后的细胞数量，将细胞接种至细胞培养板的单个孔中，加入相应体积的培养基。
      注意： 在小体积中培养并分选细胞（例如, 24孔），因为在靶向后的第一周内已观察到较高水平的细胞死亡（高达80–90%）。
    4. 将混合的靶细胞群体扩增至密度为 1 x 106 细胞/mL，在75 cm²培养瓶中² 细胞培养瓶。此过程在FACS分选后大约需要10–14天。
  3. 通过流式细胞术在混合的靶向细胞群体中确认靶向事件
    1. 经过10–14天的扩增后（当细胞密度达到1 x 106 细胞/mL，在75 cm²培养瓶中2 细胞培养瓶），每孔接种 1 x 106 在12孔细胞培养板中，将混合靶细胞群体的细胞置于1 mL含抗生素的RPMI培养基中。
    2. 通过加入 50 ng/mL 佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯（PMA）诱导报告基因的 HIV LTR（tv 的生成见步骤 1.2.2.1）中的一个孔 1 µM 离子霉素（称为PMA-Iono）。将第二孔中的细胞用作未诱导对照。将诱导和未诱导的细胞均培养24小时。
    3. 取0.5 mL未诱导和诱导的细胞悬液（分别处理），用PBS洗涤一次，再分别重悬于 200 µL FACS缓冲液
    4. 通过流式细胞术分析 100,000 个细胞。根据前向散射和侧向散射的大小对活单细胞设门，并分析荧光报告基因表达。
      注意： 在此步骤（FACS 分选后 10–14 天），转染导致的荧光报告基因的瞬时表达应已不可检测。若在此时间点仍可观察到荧光表达，则表明报告基因序列已发生基因组整合。
  4. 通过PCR检测混合靶向细胞群体基因组DNA中的靶向事件
    注意： 通过PCR检测靶向事件时，设计两对特异性引物分别针对5’整合（int.）连接区和3’int.连接区。对于5’int.连接区PCR，上游引物应结合于5’同源臂（HA）的上游区域，下游引物则结合于报告基因的长末端重复序列（LTR）内（引物P1和P2） 图3a）。3’ 末端整合位点PCR的引物对应从报告基因的PA区延伸至3’同源臂下游100–200 bp处（即引物P3和P4） 图3a）。引物P1和P4也可用于扩增混合靶向群体中的非靶等位基因。示意图见 图3a.
    1. 从步骤2.2.4获得的混合靶细胞群体的2 mL细胞悬液中提取基因组DNA。按照试剂盒生产商的说明书使用基因组DNA提取试剂盒进行操作。随后，以非靶细胞为对照制备其基因组DNA。
    2. 进行整合位点PCR（5’整合位点使用引物P1/P2，3’整合位点使用引物P3/P4）和非靶向等位基因PCR（引物P1/P4），采用高保真DNA聚合酶（参见 表3 和 4 用于PCR组分和扩增条件的分析 5 µL 在1.5%琼脂糖/TAE凝胶上进行PCR产物分析。
      注意： 如果混合的目标细胞群体中含有经过基因组编辑的细胞，则应观察到一条特异性的PCR产物，该产物在非靶向细胞的基因组DNA（阴性对照）中无法检测到。对于非靶向等位基因的PCR扩增，应在靶向和非靶向细胞中均观察到相同大小的扩增产物（基因组P1和P4引物的阳性对照）。若未观察到任何条带，可考虑通过增加循环次数或调整PCR缓冲液（例如添加DMSO或提高Mg²⁺浓度）来优化PCR扩增条件。2+），或通过更换聚合酶。

3. 克隆细胞系的建立与正确靶向的筛选

注意： 通过流式细胞术和PCR确认混合靶向细胞群体中的靶向事件后（第2.2–2.4节），进行单细胞克隆培养（耗时：28至35天），并筛选报告基因序列的正确整合。

  1. 通过稀释涂布法获得单细胞克隆
    1. 提前制备Jurkat条件培养基：从健康且未经处理、生长至1 × 10⁶ cells/mL的Jurkat T细胞中收集含抗生素的RPMI培养基6 细胞/mL，300 × g 离心 5 分钟 g，并使用滤器过滤上清液 0.22 µm 注射器滤器单元
      注意： 将条件培养基置于 4 °C 用于短期储存或 -20 °C 储存时间超过1周时。在进行稀释涂布前，准备20至30 mL的条件培养基。
    2. 从第2.2.4步开始计数目标细胞，在扩增10–14天后，用含抗生素的RPMI培养基稀释至浓度为1 × 105 细胞/mL。取 100 µL 1 × 10 的5 将细胞悬液调整至1,000个细胞/mL，取1 mL该溶液加入9.9 mL培养基，稀释至100个细胞/mL；再取1 mL 100个细胞/mL的溶液加入9 mL培养基，稀释至10个细胞/mL。
    3. 将单个细胞和两个细胞分别接种至96孔板中。对于每孔一个细胞的情况，取1 mL浓度为100个细胞/mL的细胞悬液，与5 mL条件培养基和4 mL新鲜培养基在无菌试剂储液槽中轻轻混匀。
    4. 每孔接种2个细胞时，取2 mL浓度为100个细胞/mL的细胞悬液，轻轻混入5 mL条件培养基和3 mL新鲜培养基。将混合液接种至96孔圆底培养板中 100 µL 每孔相应细胞稀释液的加样，使用多通道移液器。
      注意： 每个靶向构建体需要5到10块96孔板，即可获得用于筛选的克隆。
    5. 将96孔板叠放，每叠上方覆盖一个6孔板，每个孔中加入3 mL PBS，并将板子在37℃孵育 °C 在含5% CO₂的湿润化细胞培养孵箱中2 3 周。
      注意： 在此期间不要更换细胞培养基。每周打开培养箱的次数不要超过一到两次。在带有开放式水盘的培养箱中可获得最佳结果。
    6. 孵育3周后，使用光学显微镜（4倍放大）观察确认菌落的生长情况，并标记出有菌落生长的孔，使这些孔底部的菌落生长位置清晰可见。
    7. 准备一个96孔圆底板 100 µL 每孔加入含抗生素的RPMI培养基。用移液器轻柔吹打混悬已标记孔中的细胞。转移 100 µL 将细胞悬液加入已含有新96孔板的一个孔中 100 µL 加入含抗生素的RPMI培养基，然后用移液器轻轻混匀。转移 100 µL 将该细胞悬液分装至另一个空的96孔圆底板，以复制该板。
    8. 继续处理所有已标记且长有菌落的孔，向所有空白孔中加入 200 µL 含抗生素的RPMI培养基。将培养板置于 37° C 和5% CO₂2.
      注意： 其中一块培养皿将用于单细胞克隆的扩增（“储备板”），另一块作为筛选用的“复制板”。
  2. 通过流式细胞术和PCR筛选单细胞克隆
    注意： 在单细胞克隆扩增的同时，使用步骤 3.1.8 中的重复孔板，通过 PCR（步骤 3.2.4–3.2.12）检测单细胞克隆中报告基因序列的存在，并通过流式细胞术（步骤 3.2.2–3.2.3）检测荧光报告基因的表达图3c).
    1. 将重复的平板置于培养箱中孵育24至48小时，然后再次对平板进行重复接种。操作时，加入 100 µL 向每个孔中加入含抗生素的RPMI培养基，轻轻吹打混匀，然后转移 100 µL 使用多通道移液器将样品转移至新的96孔圆底板。一块板用于流式细胞术筛选，另一块板用于基于PCR的筛选。
    2. 用于流式细胞术筛选时，用 PMA-Iono 刺激细胞。配制一份混合工作液 0.1 µL 离子霉素（1 mM 储存液）， 0.1 µL PMA 的50 µg/µL 储备液），以及 4.8 µL 每孔加入含抗生素的RPMI培养基，具体体积根据孔数确定，然后加入 5 µL 每孔加入主混合液
      注意： 诱导对于成功鉴定克隆是必要的，因为在这些克隆中，LTR 可能处于转录沉默状态，因此荧光报告基因不表达。
    3. 将细胞孵育24 h，然后按照步骤2.3.3中所述方法制备细胞用于流式细胞术。根据前向散射和侧向散射的大小对任何有活力的单细胞设门，并通过流式细胞术分析荧光报告基因表达（示例结果参见 图3c）。如果tv主链包含带有启动子的第二个荧光报告基因（例如, GFP），同时筛选任何克隆是否表达骨架报告基因（见步骤1.2.2及以下说明）。
      注意： 骨架报告基因表达表明骨架序列发生了非预期整合。
    4. 当第二块重复培养板中的克隆生长充分后（通常在96孔板复制后24至48小时），制备含有基因组DNA的细胞裂解液用于PCR筛选。将培养板以300 × g离心10分钟 g 在室温下，小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀。
      注意： 裂解液制备和PCR反应的所有步骤均可使用多通道移液器进行。
    5. 用缓冲液洗涤细胞 100 µL 通过轻轻吹打PBS，并在300 × g下离心5分钟 g 在室温下。吸除 PBS，加入 200 µL 裂解缓冲液的体积 [200 mM NaCl，100 mM Tris-HCl pH 8-8.5，5 mM EDTA，0.1% SDS；然后加入250–1,000 µg/mL 每孔加入蛋白酶K（冻干粉，现配现称）适量。用移液器轻轻吹打混匀，将悬液转移至新的PCR板中。
    6. 用石蜡膜密封培养板，在55℃孵育1小时 °C 在热循环仪中进行。以最大速度离心10分钟（3,000 x g离心去除细胞碎片，将上清液转移至新的PCR板中。
      注意： 此阶段，含有细胞裂解液的培养板可于4℃保存 °C 直至进一步使用。
    7. 准备一个96孔PCR板 110 µL 的 dH2O 并添加 10 µL 细胞裂解液（1:12 稀释）。细胞裂解液可能较为黏稠，难以移液。请使用至少 20-µL 移液器吸头
    8. 通过在 99 ℃ 孵育 10 分钟以灭活蛋白酶 K °C 在热循环仪中进行反应。随后，使用灭活并稀释的细胞裂解液进行PCR筛查。
    9. 根据所选报告基因序列设计用于PCR筛选的引物（P5和P6），以扩增报告基因序列中500–800 bp的片段。对于阳性对照PCR，使用引物P7和P8扩增一个野生型非靶向基因组位点的630 bp片段NUP188 基因）（图3c 和 表5设计第三对引物，用于扩增约500–600 bp的病毒载体骨架序列，作为病毒载体骨架序列非特异性整合的对照（骨架PCR）。
    10. 用于筛选、对照和骨架PCR时，使用商用PCR预混液（参见 表6 和 7 用于PCR组分和扩增条件）。使用 2 µL 以步骤 3.2.8 中制备的稀释并灭活的裂解液作为模板，在 96 孔板中进行 38 至 40 个循环的 PCR 扩增。
    11. 分析 5 µL 在1.5%琼脂糖/TAE凝胶上进行PCR产物分析。
      注意： 对照 PCR 中，每个样本均应观察到一条 630 bp 的特异性条带，表明细胞裂解液的质量足以满足 PCR 要求。筛选 PCR 中出现特异性条带（500–800 bp，取决于引物设计）表明报告基因序列已整合。骨架 PCR 出现特异性条带（500–600 bp，取决于引物设计）表明载体骨架序列发生非预期整合（例如结果见 图3c).
    12. 结合流式细胞术（步骤 3.2.3）和基于 PCR 的筛选（步骤 3.2.12）的结果。选择在筛选 PCR 和阳性对照 PCR 中显示正确大小 PCR 产物、且在 PMA-Iono 诱导后流式细胞术检测到荧光报告蛋白表达的克隆。排除在骨架 PCR 中产生任何 PCR 产物或表达 tv 骨架编码的荧光蛋白的克隆，这些结果提示 tv 骨架序列发生了非特异性整合。
    13. 逐步将96孔储存板中选定的克隆扩增至更大孔径的培养板（48/24/12/6孔），直至达到T75细胞培养瓶的规模，每2至3天更换一次新鲜培养基。维持细胞密度在1 × 10⁵至2 × 10⁵ cells/cm²之间。5 和 1 × 106 cells/mL
    14. 扩增克隆期间务必制备细胞冻存液：计数细胞，室温下以 300 x g 离心 5 分钟，弃上清，轻柔地将细胞重悬于含 10% DMSO 的 FCS 中，细胞密度为 5 x 106 细胞/mL。分装至冻存管中，使用程序降温盒将细胞冷冻至-80℃ °C 在 1 °C/分钟。长期保存时，将其转移至液氮中2.
      注意： 建议保留一个T75细胞培养瓶（即, 约 1 × 107 在扩增过程中，为通过Southern印迹法验证靶向效果而制备基因组DNA时（见第3.4节）。
  3. 通过PCR/测序验证选定克隆中的整合位点
    注意： 通过PCR扩增所选克隆的5’和3’插入位点侧翼序列，并进行Sanger测序，以在DNA序列水平验证正确的靶向整合。
    1. 使用商业基因组DNA提取试剂盒制备所选克隆及Jurkat野生型细胞的gDNA。
    2. 使用引物对扩增报告基因5’端与5’同源臂上游区域的5’整合连接区（引物P1和P2），以及报告基因3’端与3’同源臂下游区域的3’整合连接区（引物P3和P4），具体如步骤2.4所述。使用引物P1和P4扩增未整合报告基因的等位基因上的靶向整合位点图4a).
    3. 以100–200 ng基因组DNA为模板配制PCR反应体系，并使用具有校读活性的DNA聚合酶进行PCR扩增（参见 表1 和 2 用于PCR组分和扩增条件。
      注意： 若未观察到条带，可考虑通过增加循环次数或改变PCR缓冲液（例如添加DMSO或增加Mg²⁺浓度）来调整PCR扩增条件。2+），或通过更换聚合酶。
    4. 分析 5 µL 在1.5%琼脂糖/TAE凝胶上电泳分析PCR产物。若观察到正确大小的条带，使用商业试剂盒纯化剩余的PCR产物，并进行Sanger测序。通过将5’ int. junction、3’ int. junction及无报告基因整合的等位基因靶位点的序列与预期序列比对，验证其序列准确性。
      注意： 同源等位基因中未整合报告基因的序列很可能在靶位点出现Cas9介导的改变，例如核苷酸插入或缺失（图4a).
    5. 对于经序列比对确认具有正确插入位点序列的克隆，进行PCR扩增整个靶向报告基因，并进行Sanger测序以验证插入片段序列的正确性。
  4. 通过所选克隆的Southern印迹分析验证靶向效果
    注意： 对所选克隆进行Southern印迹分析，以验证正确的靶向整合，并排除在靶位点可能发生的Cas9介导的重组事件。
    1. 在开始实验之前，制定适当的基因组DNA消化策略并设计探针。
      1. 选择一种限制性内切酶用于基因组DNA的酶切，该酶应在目标位点产生长度为2至10 kb的合适片段。某些限制性内切酶，例如 Asp718, Bam您好， Bgl我， Bgl二， 生态RV, 后肢三， Nco我， Pst我， Pvu二， Sca我， Stu我，以及 Sst已成功用于消化高分子量基因组DNA。
      2. 设计两种不同的Southern探针：报告基因特异性探针和基因组探针。报告基因特异性探针与报告基因内部的一段序列杂交（即, tdTomato特异性探针）。基因组探针与靠近（但不重叠）一个HA的基因组区域杂交。
      3. 选择基因组探针，使得基因组DNA消化后由基因组探针杂交检测到的片段长度与靶向和非靶向等位基因的片段长度相差超过2 kb。图4b建议探针长度为 400 至 1,000 bp。
      4. 设计PCR引物以扩增两个所需的探针。使用高保真DNA聚合酶，从tv模板扩增报告分子特异性探针（参见 表3 和 4 用于PCR组分和扩增条件。
      5. 使用具有校对活性的DNA聚合酶，从采用商用gDNA提取试剂盒制备的野生型Jurkat基因组DNA中扩增基因组探针（参见 表1 和 2 PCR反应组分和循环条件）。在琼脂糖/TAE凝胶上纯化PCR产物，并根据制造商说明书，使用商品化的胶回收试剂盒提取片段。
    2. 从 1 x 10 提取高分子量基因组 DNA7 野生型Jurkat细胞及步骤3.2.14中筛选的克隆细胞
      1. 通过离心（300 x g）沉淀细胞 g 在室温下孵育5分钟，用PBS洗涤一次，将沉淀重悬于4 mL裂解缓冲液（200 mM NaCl，100 mM Tris-HCl pH 8，5 mM EDTA，0.1% SDS）中，然后加入250–1,000 µg/mL 蛋白酶K（冻干粉末，现用现称）。55℃过夜孵育 °C，于台式恒温混匀仪中以350 rpm振荡。
      2. 加入4 mL异丙醇，倒置混合10至20次。基因组DNA应以白色沉淀形式析出。用玻璃移液管的细尖缠绕收集沉淀的基因组DNA，通过浸入洗涤液中清洗 750 µL 70% 乙醇中，室温干燥（5 至 10 分钟）。
      3. 将沉淀物转移至含有1.5 mL反应管中 500 µL 加入1× TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA），4 °C过夜溶解 °C，以350 rpm振荡。从此步骤起，任何对基因组DNA（gDNA）的移液操作均应使用宽口吸头，以避免剪切。
        注意： 高分子量基因组DNA的制备对于Southern印迹分析至关重要，而市面上可购得的基因组DNA提取试剂盒并不适用。
    3. 消化（两次） 15 µg 选定克隆及野生型Jurkat细胞基因组DNA用特定限制性内切酶（见步骤3.4.1.1）进行酶切 60 µL 反应与 6 µL 酶（20单位/µL）：首先加入DNA、消化缓冲液和ddH2O，37℃过夜孵育 °C，然后加入酶，在酶特异性的消化温度下过夜孵育。每个Southern探针需要15 μg消化后的基因组DNA。
    4. 使用 7 µL 的 60 µL 用于1%琼脂糖/TAE凝胶的分析性凝胶电泳的限制性消化。出现弥散条带表明消化完全，且DNA质量适用于Southern印迹分析。
    5. 通过加入1/10体积的3 M醋酸钠和2体积的100%乙醇沉淀剩余的限制性消化产物，然后在-80 °C孵育1小时 °C 并以 15,600 x g 离心 30 分钟 g 4 ℃时 °C.
    6. 弃去上清，用70% EtOH洗涤沉淀。在15,600 x g下离心15分钟 g 4 ℃时 °C，弃去上清液，室温下将沉淀短暂干燥，然后溶解于 20 µL 去离子水2O.
    7. 运行1%琼脂糖/TAE印迹凝胶，每泳道上样20 μL消化后的gDNA。以60 V、400 mA的条件电泳2小时。
      注意： 琼脂糖凝胶的百分比以及电泳时间/电压可根据第3.4.1.1步计算出的预期片段大小进行调整，以适用于Southern印迹检测。Southern印迹分析的后续步骤在补充方案（步骤1至18）中有详细描述，包括：印迹凝胶的洗涤、将DNA转移至尼龙膜、放射性探针的制备、探针杂交以及放射自显影胶片的显影。在补充方案的第18步完成放射自显影胶片显影后，将获得的条带模式与根据Southern策略预期的模式进行比较（示例结果见 图4b).
  5. 脱靶效应分析
    注意： 由于CRISPR-Cas9介导的基因组编辑可能产生脱靶效应，需通过PCR扩增排名前十的潜在脱靶位点 in silico-对选定克隆中的预测脱靶位点进行Sanger测序。
    1. 使用 CCTop16 （http://crispr.cos.uni-heidelberg.de）生成排名前十的列表 计算机模拟 预测的脱靶序列
      1. 输入用于靶向的gRNA序列（包含PAM）作为查询序列。选择“NGG”作为PAM，选择“人类基因组”作为脱靶预测的参考序列。
      2. 将最大总错配数设置为“4”，并将靶位点长度设置为gRNA的长度（不含PAM序列）。输出文件将提供相应gRNA的基因组脱靶位点排序列表。
    2. 计算机模拟 使用 UCSC 基因组浏览器（http://genome.edu.ucsc.edu）以及 CCTop 结果列表中脱靶位点的位置信息，提取每个排名前十的脱靶位点上下游各 500 bp 的基因组序列。
    3. 针对每个待分析的脱靶位点，设计一对PCR引物，用于扩增包含预测脱靶位点在内的长度为600至700 bp的片段。
    4. 使用商业gDNA提取试剂盒从选定的克隆和Jurkat野生型细胞中提取gDNA。针对每个脱靶位点，使用具有校对活性的DNA聚合酶进行PCR扩增（参见 表1 和 2 对野生型及相应克隆来源的基因组DNA进行PCR扩增（具体PCR组分和循环条件参见相关说明）。
    5. 分析 5 µL 在1.5%琼脂糖/TAE凝胶上电泳分析PCR产物。若观察到正确大小的条带，使用商业化的PCR纯化试剂盒纯化剩余的PCR产物，并进行Sanger测序。比较Jurkat细胞中脱靶位点与靶向克隆的序列。

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结果

在本代表性实验中，我们选择将一个最小化的HIV-1来源报告基因靶向至BACH2基因第5内含子的两个位点，该报告基因包含LTR、编码tdTomato的序列以及polyA信号序列17。靶位点的选择依据是：这些位点靠近既往在HIV感染者原代T细胞研究中报道的反复出现的整合位点2,4,5,6,7,8，并且含有Cas9介导双链断裂所必需的PAM基序NGG。靶向载体按照所述方案构建并转染。转染操作、检测靶向事件、单细胞克隆的建立以及克隆的筛选与挑选的整体流程如图1所示。

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讨论

本文介绍了一种利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术，在选定的前病毒整合位点构建HIV-1来源的Jurkat报告模型的实验方案。

在规划阶段需仔细注意该方案的几个要点。首先，应谨慎选择靶向位点，因为某些位点可能比其他位点更容易靶向（例如, 取决于该区域的染色质状态以及目标序列本身）。重复序列难以克隆到靶向载体中，且在基因组中通常不具有唯一性。抑制性染色质区域使用 CRISPR-Cas9 系统进行靶向的难度较大19,20.

其次，gRNA 的选择对于 CRISPR-Cas9 介导的靶向至关重要。为了构建具有代表性整合位点的 HIV 感染模型，应使 gRNA 尽可能靠近整合热点结合。然而，该位点可能并不适合 Cas9 的招募；因此，必须在 gRNA 序列与所选整合位点的接近程度和 gRNA 质量之间做出权衡。我们发现 E-CRISP 网络工具在预测功能性 gRNA 方面具有较高的可靠性。也...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Britta Weseloh和Bettina Abel提供的技术协助。同时感谢Arne Düsedau和Jana Hennesen（流式细胞术技术平台，Heinrich Pette研究所）提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9Addgene42230用于表达 SpCas9 和 gRNA 的载体
pMKGeneArt用于克隆的哺乳动物表达载体
cDNA3.1InvitrogenV79020用于克隆的哺乳动物表达载体
BbsI新英格兰生物实验室（New England Biolabs）R0539S限制性内切酶
NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit新英格兰生物实验室（New England Biolabs）E5520S用于靶向载体构建的无缝克隆试剂盒
TaqPlus Precision PCR System安捷伦科技（Agilent Technologies）600210具有校对活性的DNA聚合酶，用于扩增同源臂（步骤1.2.2.2）、验证整合位点和报告基因序列（步骤3.3.3和3.3.5）、生成Southern blot的基因组探针（步骤3.4.1.5）以及脱靶事件分析（步骤3.5.4）
96孔组织培养板（圆底）TPP92097用于稀释涂布的组织培养板
Phusion高保真DNA聚合酶（Phusion High-Fidelity DNA polymerase）新英格兰生物实验室（New England Biolabs）M0530 L用于检测靶向事件（步骤2.4.2）和生成Southern blot用报告基因特异性探针（步骤3.4.1.4）的DNA聚合酶
二甲基亚砜（DMSO）西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）D9170作为PCR添加剂的二甲基亚砜
氯化镁（MgCl2）溶液新英格兰生物实验室（New England Biolabs）B9021S作为PCR添加剂的MgCl2溶液
脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物新英格兰生物实验室（New England Biolabs）N0447S每种核苷酸浓度为10 mM的dNTP混合物，用于PCR反应
5PRIME HotMasterMix5PRIME2200400即用型PCR预混液，用于筛选PCR（步骤3.2.11）
QIAamp DNA血液微量试剂盒（QIAamp DNA blood mini kit）凯杰（Qiagen）51106DNA提取与纯化试剂盒
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAquick PCR Purification Kit）凯杰（Qiagen）28106PCR纯化试剂盒
不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（RPMI 1640 without glutamine）龙沙（Lonza）BE12-167F细胞培养基
南非胎牛血清批次（Fetal Bovine Serum South Africa Charge）PAN BiotechP123002细胞培养基添加剂
L-谷氨酰胺（L-glutamine）BiochromK 0282细胞培养基添加剂
青霉素/链霉素 10,000 U/mL / 10,000 µg/mLBiochromA 2212细胞培养基添加剂
Gibco Opti-MEM低血清培养基（Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media）赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific）31985062经优化用于转染的低血清浓度细胞培养基
TransIT-JurkatMirus BioMIR2125转染试剂
佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate）西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）P8139-1MG细胞培养试剂
离子霉素（Ionomycin）西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）I0634-1MG细胞培养试剂
注射器驱动式滤器单元，PES膜，0.22 µmMillexSLGP033RB用于无菌过滤的滤器单元
Heracell 150i 培养箱赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific）51026280组织培养用培养箱
Amersham Hybond-N+GE HealthcareRPN1520B带正电荷的尼龙膜，用于DNA和RNA印迹
Stratalinker 1800Stratagene400072紫外交联仪
High Prime罗氏（Roche）11585592001使用随机寡核苷酸作为引物，以放射性dCTP标记DNA的试剂盒
illustra ProbeQuant G-50 微型纯化柱（illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns）GE Healthcare28-9034-08用于纯化标记DNA的层析离心柱

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CRISPR Cas9 HIV 1 Southern RNA
基于CRISPR-Cas9的基因组工程构建整合位点特异的HIV-1感染Jurkat报告模型
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