筛选棉花基因型对肾形线虫的抗性

摘要

本文介绍了一种对棉花基因型进行快速、非破坏性筛选以鉴定其对肾形线虫抗性的实验方案。该方案包括通过肉眼观察感染线虫的棉花幼苗根部，以确定其感染反应。随后，通过营养繁殖每株植物的营养芽，获得植株用于种子生产。

摘要

为了改进对根结线虫的防治，需要建立一种快速、非破坏性的肾形根结线虫（Rotylenchulus reniformis）筛选方法，以促进抗性棉花（Gossypium hirsutum）品种的培育。目前大多数方法需要从棉花根系或盆栽土壤中提取线虫的蠕虫状个体或虫卵，以测定其种群密度或繁殖率。这些方法通常耗时较长，且仅能评估少量基因型。本文介绍了一种替代方法，即通过肉眼观察根系的线虫侵染情况。该方法包括在棉花播种后7天接种蠕虫状线虫，并在接种后28天统计附着于根系上的雌虫数量。数据以每克鲜根重量上的雌虫数量表示，以校正根系生长差异带来的影响。该方法能有效评估与线虫建立侵染位点能力相关的寄主植物抗性；但无法评估抑制线虫繁殖的抗性类型。与其他筛选方法类似，该方法在实验内外不同个体基因型之间常观察到线虫侵染程度的变异。文中提供了数据以展示该方法所观察到的变异范围。为校正此类变异，实验中需包含对照基因型。尽管如此，该方法仍为评估寄主植物抗性提供了一种简便而快速的手段。该方法已成功用于从G. arboreum种质资源库中鉴定抗性材料，并用于评估超过300个个体的分离群体，以解析抗性的遗传基础。此外，还开发了一种营养繁殖方法，用于抗性育种中植株的回收。在线虫评估取样去除根系后，将地上营养茎重新栽种，以促使其形成新的根系。通常超过95%的茎段可成功发育出新根系，并正常生长至成熟。

引言

Rotylenchulus reniformis（Linford 和 Oliveira），通常称为肾状线虫，是美国东南部土壤中主要的寄生性线虫物种之一^1,2,3。该线虫是一种专性定居型半内寄生线虫，必须依赖寄主植物完成其生活史^2,4。幼虫期的雌性线虫呈蠕虫状，可侵入寄主植物的根系，并在中柱内建立取食位点^2,3。随着线虫取食并逐渐成熟，其位于寄主根外的后部在产卵期间会膨胀，形成典型的肾形结构（图1）。Rotylenchulus reniformis 能够侵染超过300种植物的根系，包括棉花⁴。陆地棉（Gossypium hirsutum L.）在美国东南部广泛种植，但由于缺乏对 R. reniformis 具有抗性的品种，导致线虫防控困难^2,3。目前采用的防控策略包括使用杀线虫剂以及与非寄主作物轮作，以降低土壤中 R. reniformis 的种群密度^5,6，但籽棉产量损失通常仍可达1%至5%²。R. reniformis 感染的症状可能包括植株矮化、根系生长受抑、营养缺乏、落果以及成熟延迟²。然而，由于田间症状分布均匀，可能不易察觉；因此，需要有效的评估方法来检测 R. reniformis 感染，以鉴定和培育抗性陆地棉品种。棉花对 R. reniformis 抗性的评价被认为较为困难⁷，因为即使植株表现出感染症状，其受侵染的根系外观仍可能看似正常⁸。

为了从棉花种质资源库中鉴定出对 R. reniformis  具有抗性的材料，并确定这些材料的抗性遗传特性，需要建立一种有效的线虫筛选方案。该方案将有助于将抗性基因导入陆地棉。已有多种生物测定方法被用于评估棉花中 R. reniformis 的侵染情况^{8,9,10,11,12,13,14,15}。总体而言，目前用于鉴定 R. reniformis 抗性棉花基因型的方法主要有两类。最常用的方法是从未病植株或土壤中提取卵和/或蠕虫状线虫^{8,11,12,14,15}。该方法的一般流程为：将不同棉花基因型的种子分别种植于独立的花盆中，待幼苗生长7至14天后，通过向土壤中添加含有 R. reniformis 蠕虫态线虫的混合液进行接种，随后让线虫侵染根系30至60天。接着，从每株植物的受侵染根系或盆栽土壤中提取蠕虫状线虫和/或卵。通过计数所提取的线虫或卵的数量，估算其种群密度和繁殖率，并与对照基因型进行比较，从而鉴定出具有抗性的基因型。

另一种替代方法（如本文所述）包括在显微镜下检查被线虫侵染的棉花根系，以确定寄生在根部的雌性线虫数量^10,16。与其他方法类似，将不同棉花基因型分别种植于独立的花盆中，并在播种后约7天接种蠕虫状线虫。接种后30天内，从各植株上取出根系，并将根部附着的土壤冲洗干净。随后，使用红色食用染料对附着在根系上的线虫进行染色¹⁷，并在显微镜下观察根系，统计感染位点的数量，从而比较抗性棉花基因型（依据每克根组织中的线虫数量确定）与感性对照之间的差异¹⁶。该第二种方法的优势在于提高了通量，缩短了评估所需天数，并可在单次实验中评估更多独立基因型。相比基于感染症状视觉观察的筛选方法，评估种群密度或繁殖率的方法通常更为耗时⁷。然而，该方法的一个局限性在于无法评估由卵产量所反映的、抑制线虫繁殖的寄主植物抗性¹³。

筛选方案 R. reniformis 抗性常在评估过程中破坏根系⁷ 并涉及丢弃营养枝。为克服这一限制，已开发出一种营养繁殖方法，以实现植株的回收用于种子生产¹⁸在去除根系以进行线虫评估后，将营养茎种植于盆栽土壤中，以促进根系重新生长。该方法适用于大多数 R. reniformis 筛选方案。一种简单快速的无性繁殖方法对于育种至关重要 R. reniformis 需要恢复后代以将抗性基因型推进到下一代的抗性陆地棉品种。

本文介绍了一种用于大规模筛选棉花基因型对肾形线虫抗性的实验方案。该方案旨在建立一种简单、快速且非破坏性的筛选方法，以评估棉花育种群体对线虫的抗性，从而助力抗性陆地棉品种的培育。采用本方案，通常可在35天内获得数据，单次实验可评估超过300个基因型。文中提供了抗性与感性基因型的数据，以展示使用该方法时常见的变异情况。

方案

1. 维持具瘤根结线虫（R. reniformis）接种源

1. 将15 cm直径、13.5 cm高的红陶土花盆填入经蒸汽巴氏消毒的混合基质，基质由1份砂壤土 和2份沙子组成。在每个花盆中种植易感番茄（Solanum lycopersicon）品种，并将花盆置于温室中。
   注意：也可使用其他易感植物品种（如棉花）代替番茄。
2. 用线形肾形线虫接种番茄植株（参见步骤3.3）。在温室中将植株维持在约28 °C的温度条件下。

2. 种植棉花基因型以评估对R. reniformis的抗性

1. 将2份细沙与1份砂质壤土混合，制备土壤 从野外采集。
2. 对土壤混合物进行蒸汽巴氏消毒，以确保土壤中无线虫和土传植物病原体。
3. 将土壤混合物加入圆锥形塑料盆（直径4 cm，高21 cm）中。在装土前，先在盆底放置一团棉花，以防止土壤流失。将土壤填充至距盆口约2 cm处。
4. 为每个花盆准备一根塑料标签桩，用于标明将要种植的基因型。
5. 种植用于评价的棉花基因型的种子。
   1. 在评估分离群体时，每个花盆中播种一粒种子，每粒种子代表一种独特的基因型。
   2. 对于棉花品种或种质资源材料，每盆播种2至3粒种子，以确保至少有一株成功萌发，其余幼苗在接种线虫前从盆中移除。
      注意：或者，种子可在播种前萌发24至72小时，以减少因种子无活力而导致的无效种植盆数。
6. 种植选定的抗性与感性对照基因型的植物种子。
   注意：对照基因型需重复5到10次，以评估筛选方法本身固有的自然变异。
7. 用额外的土壤填满花盆，以覆盖每个花盆中的种子。
8. 将花盆放入生长室中。生长室温度保持恒定在28 °C，即环境空气温度。采用荧光灯与白炽灯混合光源提供人工照明，光照周期为16小时。
9. 在每个花盆中放置滴灌头，使用自动灌溉系统每天浇水两次。根据植物的生长情况，调节灌溉系统以增加供水量。

3. 棉花植株的线虫接种及根部样品制备

1. 在接种前一天，采用淘洗法¹⁹和离心漂浮法²⁰，从感病番茄植株上提取虫形肾形线虫（见步骤1）。将提取的线虫在4 °C下保存。
   注：贝尔曼漏斗法提取²¹是线虫提取的替代方法。
2. 通过计数100 µL样品中线虫的数量，确定所提取线虫的总数，并用自来水配制含1,000条线虫/mL的悬浮液用于接种。
3. 在播种后7天，用线虫悬浮液接种棉花幼苗。在植株旁的土壤中挖一个小凹坑，用移液器将1 mL肾形线虫悬浮液加入凹坑中。
4. 接种后28天，取出植株进行线虫评估。
   注：此时植株高度约为15 cm，具有4至6片完全展开的叶片。
   1. 在将植株从盆中取出前，用剪刀剪除大部分完全展开的叶片。
   2. 为取出植株，轻轻挤压花盆，将土壤连同植株一起滑入手掌中。
   3. 将根系在10 L容器内的自来水中轻轻晃动，以去除根部附着的土壤。随后在另一容器的清洁自来水中短暂漂洗根系。
   4. 用剪刀在土壤线以下约1 cm处剪下根系。
5. 将根系放入一个120 mL的塑料、非无菌、一次性样本容器中，并放入原花盆中的塑料标签桩以便识别。
   注： 在进入步骤3.7之前，可同时处理多个样本。接下来进入步骤4，对植株地上部分进行营养繁殖。
6. 用自来水配制12.5%（v/v）的红色食用染料溶液，用于染色附着在根系上的线虫¹⁷。
7. 向样本容器中的根系样品加入约30 mL红色食用染料溶液，确保完全浸没根系。
8. 将样本容器放入微波炉中加热，直至染色液开始沸腾。取出样本后，于室温下冷却。
9. 倒去根系样品中的红色食用染料溶液，向样本容器中加入约100 mL自来水以去除多余染料。盖上容器盖子，将样品在4 °C冰箱中保存。接下来进入步骤5，评估根部感染情况。
   注： 在进入步骤5之前，本方案可在此处暂停。

4. 营养繁殖以恢复植株用于种子生产

1. 在锥形塑料花盆底部放入一团棉花（参见步骤 2.3），并用泥炭藓栽培基质部分填满花盆。然后将营养枝放入花盆中，并牢固地添加栽培基质直至填满花盆。在每个花盆中插入一根新标记的塑料支撑杆，以标明棉花基因型。
2. 将花盆托盘放入一个塑料容器（长 73.6 cm × 宽 45.7 cm × 高 15.2 cm）中，并加入水，短暂浇水以润湿栽培基质。将花盆置于生长室中，设置恒温 28 °C，光照周期为 16 小时。根据需要向塑料容器中补充水，以保持基质湿度。
3. 约 30 天后，将植株移栽至较大的花盆中用于种子生产。用栽培基质部分填满一个 6 L 的塑料花盆（参见步骤 4.1），从原小花盆中取出植株，将其放入 6 L 花盆中，并牢固地添加栽培基质直至填满花盆。
4. 将植株移入玻璃温室中，并加水润湿栽培基质。将温室温度维持在约 28 °C（无需人工照明）。
   1. 根据需要手工浇水，持续约 30 天。
   2. 当约 75% 的植株需要每日浇水时，改用自动浇水系统进行每日浇水。根据植株生长需要，调整自动浇水系统以增加浇水频率。
   3. 在花芽起始前，向每个花盆中添加约 10 g 缓释肥料。
5. 植株成熟后进行收获，并处理棉花种子样品以获得用于进一步评估的种子。
   1. 收获棉花种子时，手工从植株上打开的棉铃中取出棉花，并放入标记好的纸袋中。种子附着在棉纤维上，后续步骤将去除这些纤维。
   2. 使用 10 锯片实验室轧花机去除种子样品上的绒毛纤维。
   3. 使用浓硫酸去除种子样品上的短绒纤维。将种子样品在 15%（v/v）的碳酸钠溶液中中和，用自来水冲洗样品，并在强制通风干燥器中干燥样品。
   4. 将种子样品放入标记好的信封中储存。

5. R. reniformis 根部感染的评估

1. 从样本容器中取出根系样本，在体视显微镜（20倍放大）下计数附着在根系上的雌性线虫数量。
   注意： 只有肾形线虫的雌性个体能够侵染植物根部。
2. 将根系置于纸巾上约10分钟，以去除多余水分。称量根系重量，记录鲜根重。
3. 将线虫数量和鲜根重数据输入计算机电子表格程序，计算每克根组织中的雌性线虫数量。

结果

Rotylenchulus reniformis 对两种棉花品种根系的侵染情况见图1。与感病棉花基因型相比，抗病基因型中能够成功建立取食位点的雌性肾形线虫数量相对较少。不同材料之间的根系生长差异较为常见，如图2所示。通过鲜根重量测定的这种差异，在同一基因型的不同植株之间也可观察到（表1）。Gossypium arboreum 基因型的根系生长速率通常低于陆地棉基因型。为校正此类差异，需收集各基因型的鲜根重量数据，并据此计算每克根组织中雌性肾形线虫的数量。抗病基因型每克根组织中的雌性肾形线虫数量通常少于10条，而感病基因型每克根组织中的线虫数量通常超过30条。

筛选棉花基因型对R. reniformis抗性的一个挑战是实验内部及实验...

讨论

为了评估抗性遗传特性以及培育抗性品种，需要一种有效的筛选方案来：1）鉴定抗R. reniformis的棉花基因型；2）培育抗性品种。大多数方案通过从棉花根系或盆栽土壤中提取线形线虫或虫卵，来评估R. reniformis的种群密度或繁殖率^{8,11,12,14,15}。这些方法通常更为耗时，且实验内部及实验之间的结果变异性较大。此外，在未设重复的温室实验中，使用这些方案可能导致棉花基因型更频繁地被误判¹¹。然而，对于所评估的不同方案或参数，仍可获得相似的结果^9,13。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ray Leach 锥形容器	Stuewe and Sons Inc.	SC10U
锥形容器托盘	Stuewe and Sons Inc.	RL98
沙子	多种品牌
棉球	多种品牌
Pylon 4 英寸植物标签（4 英寸长 × 5/8 英寸宽）	Pylon Platics	L-4-W	任何品牌或供应商均可接受。
4 盎司样品容器	Fisher Scientific	16-320-731	任何品牌或供应商均可接受。
红色食用色素	McCormick & Co., Inc.
1 mL 移液器吸头	多种品牌
10 L 容器	多种品牌		廉价的桶即可满足要求。
6 L 花盆	Nursery Supplies Inc.	Poly-Tainer-Can No2A	任何品牌或供应商均可接受。可使用不同尺寸的花盆。
育苗基质	Sun Gro Horticulture	Metro-Mix 360	任何品牌或供应商均可接受。
肥料	Everris NA Inc.	Osmocote Plus	任何品牌或供应商均可接受。
塑料容器（73.6 cm 长 × 45.7 cm 宽 × 15.2 cm 深）	Rubbermaid	3O29	任何品牌或供应商均可接受。