本文介绍了一种应用点击化学辅助的RNA相互作用组捕获（CARIC）策略的详细方案，用于鉴定与编码RNA和非编码RNA结合的蛋白质。
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方法文章
利用点击化学辅助的RNA相互作用组捕获（CARIC）策略捕获与鉴定RNA结合蛋白
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
全面鉴定RNA结合蛋白（RBPs）对于理解细胞内的转录后调控网络至关重要。目前广泛使用的RBP捕获策略依赖于靶标RNA的多聚腺苷酸化[poly(A)]，该修饰主要存在于真核生物成熟mRNA上，导致大多数非poly(A) RNA结合蛋白未被识别。本文详细描述了一种近期报道的方法——点击化学辅助RNA相互作用组捕获技术（CARIC），该方法通过结合RNA的代谢标记、体内紫外交联以及生物正交标记，实现了对poly(A)和非poly(A) RBP的全转录组范围捕获。
引言
人类基因组被转录成多种类型的编码和非编码RNA（ncRNA），包括mRNA、rRNA、tRNA、小核RNA（snRNA）、小核仁RNA（snoRNA）以及长链非编码RNA（lncRNA）1。这些RNA中的大多数都结合了RNA结合蛋白（RBP），并以核糖核蛋白颗粒（RNP）的形式发挥功能2。因此，全面鉴定RNA结合蛋白（RBP）是理解RNA与RBP之间调控网络的前提，该网络与多种人类疾病相关3,4,5。
过去 近年来，已在多种真核系统中发现大量RNA结合蛋白2,6，包括人类7,8,9,10,11，小鼠12....
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方案
警告：在适用情况下，所用试剂应购买无RNase的形式，或溶解于无RNase的溶剂中（大多数情况下，使用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水）。在处理RNA样本和无RNase试剂时，务必佩戴手套和口罩，并频繁更换，以避免RNase污染。
1. 代谢标记并进行紫外交联细胞裂解液的制备
- EU 和 4SU 的代谢标记
- 在添加了 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 HeLa 细胞。为准备一次标准质谱检测的一个实验组或对照组样本，培养约 4 × 107 个 HeLa 细胞（分置于两个 15 cm 培养皿中）。
- 当培养的 HeLa 细胞融合度达到约 80% 时，吸除培养基，并向每个 15 cm 培养皿中加入 15 mL 预热的新鲜培养基。
- 向每个培养皿中加入 15 μL 的 100 mM EU（溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中），使其终浓度为 1 mM；同时加入 7.5 μL 的 100 mM 4SU（溶于 PBS 中），使其终浓度为 0.5 mM，用于实验组和 noUV 对照组样本。对于 no4SU 对照组样本，仅向每个培养皿中加入 15 μL 的 100 mM EU（溶于 PBS 中），使其终浓度....
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结果
展示了质量控制步骤的代表性结果。结果包括步骤 2.3.2 中描述的凝胶内荧光分析图（图 1）、步骤 4.1.3 中描述的蛋白质印迹分析图（图 2A）以及步骤 4.2.2 中描述的银染分析图（图 2B）。质量控制步骤对于优化 CARIC 实验方案至关重要。在进行大规模 RBP 鉴定实验制备时，务必包含质量控制环节。
图1：步骤2.3.2中所述点击标.......
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讨论
保持RNA完整性良好是成功进行CARIC实验的关键之一。通过使用适当的Cu(I)配体并谨慎操作，RNA降解可显著减少，尽管仍观察到部分降解现象。实验样品中EU和4SU的取代率分别为1.18%和0.46%（数据未显示）。对于长度为2,000 nt的完整RNA，约90%的RNA至少含有一个EU和一个4SU；对于长度为1,000 nt的部分降解RNA，约70%的RNA至少含有一个EU和一个4SU。因此，RNA的部分降解不会显著降低CARIC的效率，但严重降解是不可接受的。
另一个关键步骤是步骤1.4，即点击反应的准备。RNA上的Cu(I)催化点击反应对LDS浓度敏感。高浓度（> 0.1%）的LDS会导致含EU的RNA上的标记信号减弱，同时蛋白质上的背景信号增强（数据未显示）。
除了 EU 之外，CARIC 还可与其他可点击核苷兼容，例如炔基和叠氮基腺苷类似物33,34,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金项目 91753206、21425204 和 21521003 以及国家重点研发计划项目 2016YFA0501500 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HeLa | ATCC | ||
| DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基） | 赛默飞世尔科技 | 11995065 | |
| FBS（胎牛血清） | 赛默飞世尔科技 | 10099141 | |
| 青霉素 && 链霉素 | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | |
| EU（5-乙炔基尿苷） | 芜湖华仁科技有限公司 | CAS:69075-42-9 | |
| 4SU（4-硫代尿苷） | Sigma Aldrich | T4509 | |
| 10×PBS（磷酸盐缓冲液） | 赛默飞世尔科技 | AM9625 | |
| 紫外交联仪 | UVP | CL-1000 | 配备365 nm紫外灯 |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | Sigma Aldrich | D5758 | 用于处理水。有剧毒！ |
| Tris·HCl，pH 7.5 | 赛默飞世尔科技 | 15567027 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
| Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
| 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | 赛默飞世尔科技 | 88265 | 每50 mL裂解缓冲液使用一片。 |
| LDS（十二烷基硫酸锂） | Sigma Aldrich | L9781 | |
| 15 mL 超滤管（截留分子量 10 kDa） | Millipore | UFC901024 | |
| 0.5 mL超滤管（截留分子量10 kDa） | 默克密理博 | UFC501096 | |
| 链霉亲和素磁珠 | 赛默飞世尔科技 | 88816 | |
| DMSO（二甲基亚砜） | Sigma Aldrich | 41639 | |
| 叠氮-生物素 | 点击化学工具 | AZ104 | |
| 硫酸铜(II) | Sigma Aldrich | C1297 | |
| THPTA [三(3-羟丙基三唑基甲基)胺] | Sigma Aldrich | 762342 | |
| 抗坏血酸钠 | Sigma Aldrich | 11140 | |
| 叠氮-Cy5 | 点击化学工具 | AZ118 | |
| LDS 样品缓冲液（4×) | 赛默飞世尔科技 | NP0008 | |
| 10% bis-Tris 凝胶 | 赛默飞世尔科技 | NP0301BOX | |
| EDTA | 赛默飞世尔科技 | AM9260G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
| SDS（十二烷基硫酸钠） | 赛默飞世尔科技 | 15525017 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Brij-97 [聚氧乙烯（20）油醚] | J&K | 315442 | |
| 三乙醇胺 | Sigma Aldrich | V900257 | |
| 链霉亲和素琼脂糖 | 赛默飞世尔科技 | 20353 | |
| 尿素 | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Sarkosyl（月桂酰肌氨酸钠）N月桂酰肌氨酸钠盐 | Sigma Aldrich | 61743 | |
| 生物素 | Sigma Aldrich | B4501 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma Aldrich | 30970 | |
| MaxQuant | 版本：1.5.5.1 |
参考文献
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T.
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重印与许可
