用于人工晶状体的软质聚硅氧烷-脲弹性体的合成

摘要

本研究描述了氨基丙基封端的聚二甲基硅氧烷和聚二甲基-甲基-苯基硅氧烷-嵌段共聚物的合成路线，以及基于软质聚硅氧烷的脲（PSU）弹性体的制备方法。文中介绍了PSU作为可调节人工晶状体的应用，并提出一种评估方法 体外 细胞毒性也进行了描述。

摘要

本研究探讨了一种用于可调节人工晶状体（a-IOLs）的软质聚硅氧烷基脲（PSU）弹性体的合成路线。此前已制备了氨基丙基封端的聚二甲基硅氧烷（PDMS）。 通过 环状硅氧烷八甲基环四硅氧烷（D₄）的环-链平衡₄）和1,3-双(3-氨基丙基)-四甲基二硅氧烷（APTMDS）。苯基被引入到硅氧烷主链中 通过 D的共聚反应₄ 以及2,4,6,8-四甲基-2,4,6,8-四苯基环四硅氧烷（D₄^Me,Ph）。这些聚二甲基-甲基-苯基硅氧烷嵌段共聚物的合成旨在提高聚硅氧烷的折射率。作为人工晶状体（a-IOL）的应用，聚硅氧烷的折射率必须与人年轻晶状体的折射率相当。聚硅氧烷的分子量通过环状硅氧烷与封端剂APTMDS的摩尔比进行调控。PSU弹性体的透明性通过紫外-可见分光光度计在200至750 nm波长范围内对薄膜的透光率进行测定来评估。在750 nm（可见光谱的上限）处的透光率数值被绘制为PDMS分子量的函数， > 在分子量达到 18,000 g·mol 之前，可观察到 90% 的透射率⁻¹采用冲压成型的哑铃形试样进行应力-应变测试，以研究PSU弹性体的力学性能。为评估其力学稳定性，通过循环拉伸（10次）试样至5%和100%的应变来测定力学滞后性。随着PDMS分子量的增加，滞后性显著降低。 体外 采用 MTS 细胞活力检测法评估部分选定 PSU 弹性体的细胞毒性。本文所述方法可用于合成一种柔软、透明且无细胞毒性的 PSU 弹性体，其折射率约等于年轻人体晶状体的折射率。

引言

老年性白内障影响60岁及以上人群，导致天然晶状体出现明显的混浊。这种与年龄相关的疾病可能由氧化改变引起，而紫外线照射会加速这一过程。^1,2,3老年性白内障的传统治疗方法包括手术摘除混浊的晶状体，随后将人工眼内镜片（IOL）植入空的晶状体囊袋中 通过 一种注射系统²然而，大多数人工晶状体由丙烯酸类聚合物（疏水性和亲水性丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚合物）制成，其结构极为刚性，因此眼睛失去了对不同距离的调节能力。^2,4因此，单焦点人工晶状体植入患者在近视力方面依赖于眼镜例如，例如阅读报纸或书籍时⁵.

已有多种方法被报道用于恢复白内障手术后的调节能力。在这些方法中，可区分出两种主要策略：通过注射液体或凝胶状聚合物来填充空的晶状体囊，以及开发柔软、可折叠的人工晶状体（a-IOLs）^6,7,8。其中，“"晶状体囊填充"”这一概念具有前景，因为所制备的凝胶其杨氏模量可低至接近天然人眼晶状体的水平（ca. 1 - 2 kPa）⁹；然而，该方法目前仍处于实验阶段⁸，相关研究仅在动物眼球上进行。

通过植入可膨胀的硅胶球囊来重新填充晶状体囊¹⁰ 填充液态硅胶或直接注射硅胶^11,12 随后在胶囊中固化 通过 氢硅化反应。然而，已观察到与球囊表面皱褶、与术前状态相比适应幅度较低，以及严重继发性白内障（前囊和后囊混浊）形成相关的问题^7,8,12,13特别是，较长的固化时间（70 分钟至 12 小时）会增加渗漏至周围眼部腔室的风险，从而导致术后炎症^10,14因此，建议使用其他材料替代晶状体，包括基于二丙烯酸聚乙二醇、丙烯酸酯修饰的乙烯醇（N-乙烯基吡咯烷酮）共聚物的水凝胶¹⁵甲基丙烯酸酯修饰的聚硅氧烷^16,17泊洛沙姆¹⁸以及二异氰酸酯交联的多元醇⁹。然而，单体的黏度（即注射后凝胶膨胀及交联问题、折射率过低或过高、机械稳定性与完整性不足、术后屈光度不可预测、调节范围小以及后发性白内障形成是主要问题^{6,7,8,9,15,18}临床上，主要通过开发可折叠的人工晶状体（a-IOLs）来恢复眼的调节能力。这类a-IOLs应通过人工晶状体光学部向晶状体囊前方的移动来实现调节功能。 通过 睫状肌的收缩。市场上已先后于1996年、2001年和2002年推出了多种模型。^7,8然而，在临床研究中，植入人工晶状体（a-IOL）的受试者所测得的调节幅度极低（≤ 1.5 D），无法满足无需矫正即可阅读所需的调节需求（3 - 4 D）。^6,7,8,19,20因此，一种由两个连接光学元件组成的有晶状体眼人工晶状体（双光学元件IOL）正在被开发，以增加调节范围^6,21仅有一种晶状体的设计在人眼中的调节性能方面得到了研究，但已有相互矛盾的结果被报道^22,23,24,25.

通常，硅橡胶被认为具有生物惰性和无毒性，因此在医学和医学工程领域作为生物相容性材料已有长期应用历史（例如，用于乳房假体、颅面假体、关节假体、伤口敷料、导管、引流管和分流管^26,27由于其柔软性、透明性以及高透氧性，硅酮弹性体也被用于制造隐形眼镜和人工晶状体^2,28,29然而，硅酮必须通过共价交联，并且通常需要添加增强填料以获得足够的机械强度。交联的缺点在于其会阻碍 随后通过热塑性方法对弹性体进行加工（例如，注塑成型）或通过溶液加工（例如溶剂浇铸）。相比之下，热塑性聚氨酯具有良好的机械稳定性，但在生物环境中易发生降解，特别是当使用聚酯或聚醚类大分子二醇时。因此，目前的研究重点在于将含羟基或氨基的聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为软段引入聚氨酯、聚氨酯脲和聚脲中，以兼具柔韧性、水解或氧化稳定性以及优异的机械性能²⁷为了增强极性聚氨酯或脲硬段与高度非极性的PDMS软段之间的相容性，并改善材料的力学性能，将不同聚醚类大分子二醇与PDMS共同引入体系中^30,31,32特别是Thilak Gunatillake团队系统地研究了硅酮型聚氨酯的开发，以改善其生物稳定性和机械性能，用于起搏器绝缘或人工心脏瓣膜等长期生物医学应用³³他们合成了具有混合软段的芳香族聚氨酯，软段包括羟基封端的PDMS、不同的聚醚以及脂肪族聚碳酸酯二醇。在所有合成的聚氨酯中，聚己亚甲基氧化物（PHMO）与PDMS的组合在硬段相容性方面表现出最佳的机械性能³⁰在后续研究中，他们进一步考察了PDMS与PHMO的比例以及引入基于二硅氧烷的扩链剂对硅酮聚氨酯机械性能的影响。^34,35,36结果表明，采用80 wt% PDMS和20 wt% PHMO组成的宏观二醇，并添加如1,3-双(4-羟丁基)-四甲基二硅氧烷（BHTD）等共链延伸剂，可制得具有优良机械性能和热塑性加工性能的较软聚氨酯。此外，与常用的软质聚醚型聚氨酯相比，这类硅氧烷-聚氨酯表现出更优的生物稳定性。^37,38,39.

类似材料的生物相容性、稳定性及其在心血管领域的应用已有报道^40,41,42。基于这些研究结果，采用二硅氧烷基链延伸剂的硅酮基聚脲弹性体（或称PSUs）被认为具有高柔韧性和柔软性，同时具备足够的机械强度，可在反复施加应力后仍保持其形状。例如，Hermans et al. 构建了一种基于聚氨酯的双光区人工晶状体实验原型，因为此前用于硅酮材料制造的设计在处理去核猪眼内的载荷时过于柔软⁴³。

本文描述了一种基于有机硅氧烷的软性PSU的合成方法，该材料的力学和光学性能已针对可调节人工晶状体（IOL）的应用进行了优化。由于PSU弹性体的力学性能可通过有机硅氧烷的分子量进行调节，因此相同的方法也可用于开发其他有机硅氧烷基PSU，这些材料可能在涂层和皮肤敷料领域具有应用前景。此外，若使用羟基封端的聚二甲基硅氧烷（PDMS），该方法还可用于制备有机硅氧烷基聚氨酯或聚氨酯-脲弹性体。根据所用二异氰酸酯（即脂肪族或芳香族）类型的不同，反应条件（包括时间、温度以及可能的溶剂组成）可能需要相应调整。当使用脂肪族二异氰酸酯（如4,4'-亚甲基双(环己基异氰酸酯)（H₁₂MDI）或异佛尔酮二异氰酸酯）时，需使用有机锡催化剂（如二月桂酸二丁基锡或乙酸氧基四丁基二锡氧烷）来加速反应。例如，在催化剂存在下，羟丙基封端的PDMS与H₁₂MDI之间的反应可顺利进行，且反应温度需升高至50–60 °C。当使用芳香族二异氰酸酯（如4,4'-亚甲基双(苯基异氰酸酯)（MDI））时，由于芳香族二异氰酸酯通常比脂肪族二异氰酸酯对亲核基团更具反应活性，因此反应温度需适度但充分地提高。MDI与羟基封端PDMS的反应可通过使用无水四氢呋喃（THF）与二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基乙酰胺（DMAc）的混合溶剂来促进，因为叔胺类物质表现出一定的催化活性。

方案

警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。合成过程中使用的多种化学品具有急性毒性，对皮肤和眼睛有强烈刺激性，吸入后亦有害。请佩戴个人防护装备（实验服、护目镜、手套、长裤和封闭式鞋），并在通风橱内或通风良好的场所操作化学品。所有合成操作均应在通风橱内进行。五水合四甲基氢氧化铵（TMAH）：TMAH为强碱，吞咽后具有急性毒性，接触皮肤可导致皮肤和眼睛严重化学灼伤。该物质对空气敏感且具吸湿性，应冷藏并在氮气氛围下储存。由于TMAH具有强烈的类似氨的气味，应在通风良好的场所操作。APTMDS：APTMDS对空气敏感，必须在氮气氛围下储存。该物质可导致严重皮肤灼伤和眼睛损伤。H₁₂MDI：H₁₂MDI吸入后有毒，对皮肤和眼睛具有刺激性。D₄：D₄可能损害生育能力。四氢呋喃（THF）：THF有害，吸入后会引起刺激，且可能具有致癌性。氯仿（CHCl₃）：CHCl₃吸入后有害，可能具有致癌性，可能对生育能力和未出生胎儿造成损害，其蒸气可能引起嗜睡。

1. 催化剂与氨基封端聚硅氧烷大分子单体的合成

1. 四甲基铵-3-氨丙基-二甲基硅醇盐催化剂的合成
   注意：该催化剂的合成方法依据 Hoffman 和 Leir 报道的方法进行⁴⁴。
   1. 使用前在真空下对 APTMDS 进行脱气处理，并在氮气氛围下储存。用注射器吸取约 10 g APTMDS。
   2. 将 8.13 g（33.0 mmol）脱气后的 APTMDS 和 11.88 g（66.0 mmol）TMAH 加入一个 100 mL 三颈圆底烧瓶中。加入 20 mL THF 以溶解 APTMDS 并悬浮 TMAH，同时放入一个较大的椭圆形磁力搅拌子。
      警告：TMAH 是一种吸湿性、腐蚀性且有毒的物质，具有强烈的类似氨的气味，应密封保存于冰箱中。称量 TMAH 时应在通风良好的地方立即进行；操作时需佩戴防护手套和安全眼镜。APTMDS 对空气敏感，可引起皮肤灼伤和眼部损伤。应使用注射器从密封瓶中称取 APTMDS；操作时需佩戴防护手套和安全眼镜。
   3. 将三颈圆底烧瓶装配回流冷凝器以及氮气进出口，使用甘油或硅油加热浴将反应混合物加热至 80 °C。在回流条件下，持续通入少量氮气，搅拌反应混合物 2 小时。
      注意：初始略显浑浊的悬浮液在 2 小时内逐渐变为澄清溶液。
   4. 移除回流冷凝器，使用真空抽吸装置蒸除 THF。然后，在 Schlenk 线上，于 70 °C 和 0.1 mbar 真空条件下干燥淡黄色粗产物 5 小时。
      注意：此步骤完成后，粗产物可在 10 °C 冰箱中储存至次日。
   5. 将粗产物重新悬浮于 50 mL THF 中。如有必要，使用刮刀打碎大块聚集体，并用真空抽吸装置过滤悬浮液。用 20 mL THF 分批洗涤沉淀物至少 3 次，直至产物变为白色粉末状固体。
   6. 在室温下，于 0.1 mbar 真空条件下干燥产物 3 小时。随后，在氮气氛围下将催化剂储存于 10 °C 冰箱中，待用。
2. α,ω-双(3-氨丙基)-聚二甲基硅氧烷的合成
   注意：合成分子量约为 15,500 g·mol^-1 的 PDMS。
   1. 使用前在真空下对 D₄ 和 APTMDS 进行脱气处理。用注射器吸取约 1.5 g APTMDS。
   2. 将 19.5 g（65.7 mmol）脱气后的 D₄ 和 0.9 g（3.6 mmol）APTMDS 加入一个 100 mL 三颈圆底烧瓶中，该烧瓶配备聚四氟乙烯（PTFE）涂层的离心搅拌子以及氮气进出口。
   3. 加入约 26 mg 催化剂（来自步骤 1.1），在持续通入少量氮气的条件下，于 80 °C 搅拌反应混合物 30 分钟。
      注意：可使用甘油或硅油加热浴。
   4. 使用滴液漏斗在 2–3 小时内将 45.5 g（153.4 mmol）D₄ 缓慢滴加至反应混合物中，并在持续通氮条件下于 80 °C 继续搅拌 24 小时。
      注意：反应可过夜进行。
   5. 将反应混合物加热至 150 °C，搅拌 2 小时以分解催化剂。随后，使 PDMS 冷却至室温。
   6. 将离心搅拌子更换为较大的椭圆形磁力搅拌子，并用两个塞子密封三颈圆底烧瓶。连接带阀门的适配器，在 0.1 mbar 真空条件下通过 Schlenk 线缓慢加热 PDMS 至 150 °C，以蒸除环状副产物。使 PDMS 冷却至室温。
      注意：真空蒸馏通常持续 4–5 小时。
3. α,ω-双(3-氨丙基)-聚二甲基-甲基-苯基硅氧烷的合成
   注意：本节描述了分子量约为 15,500 g·mol^-1 且含 14 mol% 甲基-苯基硅氧烷单元的聚硅氧烷的合成方法；该方法与第 1.2 节所述 PDMS 的合成方法类似。
   1. 使用前在真空下对 D₄ 和 APTMDS 进行脱气处理。用注射器吸取约 1.5 g APTMDS。将 D₄^Me,Ph 置于真空腔中，在 70 °C 下加热 3–5 小时，以完全熔化并均质化产物，备用。
   2. 将 4.54 g（15.3 mmol）D₄、14.96 g（27.5 mmol）D₄^Me,Ph 和 0.9 g（3.6 mmol）APTMDS 加入一个 100 mL 三颈圆底烧瓶中，该烧瓶配备聚四氟乙烯（PTFE）涂层的离心搅拌子以及氮气进出口。
   3. 加入约 26 mg 催化剂（来自步骤 1.1），在持续通氮条件下于 80 °C 搅拌反应混合物 30 分钟。
   4. 使用滴液漏斗在 2–3 小时内将 45.5 g（153.4 mmol）D₄ 缓慢滴加至反应混合物中，并在持续通氮条件下于 80 °C 继续搅拌 24 小时。
      注意：反应可过夜进行。
   5. 后续步骤参照 1.2.5 和 1.2.6 进行。

2. 聚硅氧烷分子量的测定

1. 聚硅氧烷的理论分子量
   1. 根据以下方程计算聚硅氧烷的理论分子量 ：
      （1）
      其中， 为聚二甲基硅氧烷的数均分子量，m 为所用单体 D₄ 和 APTMDS 的质量（g），n 为 APTMDS 的物质的量（mol）。
2. 通过 ¹H-NMR 波谱法测定聚硅氧烷的分子量
   1. 将 10 - 20 mg 聚硅氧烷溶解于 0.5 mL CDCl₃ 中，记录其核磁共振谱图，并将化学位移 [δ] 以溶剂信号 7.26 ppm 为基准进行校准。
   2. 根据以下方程，利用积分值计算聚硅氧烷的分子量 ：
      （2）
3. 通过滴定法测定聚硅氧烷的分子量
   1. 将 1.5 - 2 g 聚硅氧烷加入 250 mL 锥形瓶中，加入 50 mL 四氢呋喃（THF），并在磁力搅拌下持续搅拌使其溶解。
   2. 使用溴酚蓝作为指示剂，以 0.1 M HCl 滴定氨基基团，直至溶液颜色由蓝色变为黄色。对三个样品重复滴定操作，以计算数均分子量。

3. 聚硅氧烷-脲弹性体的合成

注意：本部分描述了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的尿素弹性体的合成步骤，其硬段含量（HS%）为10 wt%（PDMS：15,500 g·mol^-1）。

（3）

1. 加入 2.939 g（11.2 mmol）的 H₁₂将MDI加入250 mL四颈圆底反应瓶中，该反应瓶配备聚四氟乙烯涂层的离心搅拌子、滴液漏斗以及氮气进出口，再溶于20 mL THF中。
   警告：H₁₂MDI 是一种低挥发性二异氰酸酯，会对皮肤和眼睛造成刺激。操作时应佩戴防护手套和安全护目镜。
   注意：或者，将 H 溶解₁₂在50 mL烧杯中加入MDI的THF溶液，通过漏斗或郁金香形玻璃漏斗将溶液加入反应瓶中。然后用10 mL THF冲洗烧杯和漏斗。
   1. 将45.0 g（2.9 mmol）脱气的PDMS溶于100 mL THF中；将该溶液逐滴加入H₁₂在室温下，于持续搅拌和氮气流条件下，通过滴液漏斗加入MDI溶液。用50 mL THF冲洗烧杯和滴液漏斗，并将此溶液加入反应混合物中。
   2. 控制预聚物的形成 通过 傅里叶变换红外光谱（FTIR）
      注意：反应进程可通过两种方式监测：使用在线或离线ATR-FTIR光谱法。
      1. 对于原位ATR-FTIR光谱分析，将连接至光谱仪的原位ATR-FTIR探头插入反应起始处的中央接头。使用大型椭圆形磁力搅拌子代替聚四氟乙烯涂层搅拌子。开始记录H的光谱₁₂MDI 溶液，并选择在 2266 cm⁻¹ 处的 NCO 吸收峰^-1 用于追踪异氰酸酯基团的转化。
      2. 对于离线ATR-FTIR光谱分析，使用巴斯德吸管取反应混合物样品，并将几滴样品滴加至ATR晶体表面。在氮气流下蒸发溶剂，直至ATR晶体表面残留一层薄膜。在反应的不同阶段记录光谱（PDMS完全加入后，以及每次加入APTMDS后的阶段）。
   3. 向预聚物溶液中加入化学计量量的扩链剂 APTMDS 部分。
      注意：扩链剂的添加可通过两种方式进行（见步骤 3.1.3.1 和 3.1.3.2）。
      1. 将称量好的扩链剂溶于5 - 10 mL THF中，使用巴斯德吸管或滴液漏斗将溶液逐滴加入反应混合物中，随后再用3 mL THF冲洗。
      2. 将扩链剂分批加入注射器中，并将扩链剂逐滴加入反应混合物中。此时，使用橡胶隔膜塞密封第四个接口。
         1. 加入1.65 g（6.6 mmol）APTMDS，相当于计算量的APTMDS的80%，加入预聚物中。随后，控制反应进程 通过 傅里叶变换红外光谱法
         2. 然后，向反应混合物中加入0.21 g（0.8 mmol）APTMDS（总量为计算量的90%），并通过FTIR监测反应进程。
         3. 向反应混合物中加入0.1 g（0.4 mmol）APTMDS（总量为95%），并使用FTIR监测反应进程。
         4. 最后，向反应混合物中加入剩余部分的扩链剂（0.102 g，0.41 mmol），并检测FTIR谱图中NCO吸收峰是否消失。
            注意：加入第一部分扩链剂后，可观察到黏度升高。
   4. 将PSU溶液倒入覆有PTFE膜的玻璃培养皿中，在通风橱内过夜蒸发溶剂。随后，将PSU置于80 °C的真空干燥箱中干燥12 h。

4. 机械测试程序

1. 聚硅氧烷-脲弹性体薄膜的制备
   1. 将7 - 8 g小块聚硅氧烷-脲（PSU）溶解于300 mL锥形瓶中的200 - 250 mL氯仿（CHCl₃）中，用玻璃塞松散密封锥形瓶，并使用磁力搅拌子搅拌混合物至少24 h。如有必要，可分批加入额外溶剂。
      警告：氯仿可能具有致癌性。吸入其蒸气可能导致嗜睡。操作氯仿时应在通风良好的场所进行。
   2. 将均一溶液倒入玻璃培养皿中，并用带孔的铝箔覆盖。将培养皿置于通风良好的地方或通风橱内（通风橱窗开启），使溶剂缓慢蒸发。
      注：若将培养皿置于通风橱中，应尽可能降低气流。溶剂蒸发过快会导致薄膜不均匀，并在透明薄膜中形成不透明斑点。
   3. 在80 °C的真空干燥箱中干燥薄膜12 h。
   4. 使用小而薄的刮刀小心地从玻璃表面剥离薄膜，并将PSU薄膜存放在透明信封中，以备后续进行力学性能表征。
2. 聚硅氧烷-脲弹性体薄膜的应力-应变测试
   1. 根据Keiper⁴⁵（S2型）方法，使用冲模从PSU薄膜上制备狗骨状试样。将包有保护膜的PSU薄膜置于如图4所示形状的冲切装置下方，压下杠杆以冲出测试试样，并在环境温度（23 ± 2 °C）下存放至少72 h。
   2. 打开拉伸试验机和计算机，点击图标启动软件。选择测试方法为拉伸测试，并检查试验机中是否已安装正确的负荷传感器（100 N）。
   3. 选择方法助手，并确认所有测试设置正确。进入测试前设置，检查以下参数是否已启用：原始样品长度（L₀）为20 mm，预加载力为0.1 MPa，达到预加载力的速度为5 mm/min。
   4. 进入测试参数，检查以下设置是否已启用：测定杨氏模量时的速度为1 mm/min，样品断裂前的速度为25 mm/min，样品断裂检测为80% F_max，杨氏模量的测定方法为回归法，杨氏模量测定的起始应变为2%，终止应变为6%。退出方法助手，切换至软件主界面。
   5. 按下试验机上的开机按钮，并在软件主界面中点击前往起始位置按钮。
   6. 去除保护膜，在正交偏振器下检查样品，排除内部应力。使用卡尺测量样品厚度和宽度，并将测得的厚度和宽度数值输入软件主界面的相应字段中。
   7. 将测试试样固定在试验机的上夹具之间。在软件主界面中点击力值归零按钮。随后将试样底端固定在试验机的下夹具之间。
      注：若夹具表面光滑，可在试样两端之间夹入细粒砂纸，以防止测量过程中试样滑动。
   8. 点击开始测量按钮，启动拉伸测试。
   9. 完成一次测量后，重复步骤4.2.6和4.2.7。在将试样固定于上夹具并选择力值归零后，点击软件主界面中的前往起始位置按钮，然后将试样底端固定于下夹具之间，并再次点击开始测量。
   10. 对同一PSU样品至少重复步骤4.2.6 - 4.2.8三次以上，以进行杨氏模量、抗拉强度和断裂伸长率的统计学评估。
3. PSU弹性体薄膜的滞后回线测试
   1. 打开拉伸试验机和计算机，点击图标启动软件。选择测试方法为循环拉伸测试，并检查试验机中是否已安装正确的负荷传感器（100 N）。
   2. 选择方法助手，并确认所有测试设置正确。进入测试前设置，检查以下参数是否已启用：原始样品长度（L₀）为20 mm，预加载力为0.05 MPa，达到预加载力的速度为5 mm/min。
   3. 进入测试参数，检查以下设置是否已启用：循环次数为10次，设定加载应变为100%，设定卸载应变为0%，测试速度为25 mm/min。退出方法助手，切换至软件主界面。
   4. 执行步骤4.2.5 - 4.2.8。
   5. 对两个试样重复滞后回线测量，以进行统计学评估。根据以下公式计算每一循环的力学滞后：
      (4)

5. HaCaT 细胞的培养步骤

1. 将装有 HaCaT 细胞和 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）的冻存管置于 37 °C 水浴中预热。在微生物安全操作台内，迅速将细胞悬液转移至已加入温热 DMEM 的 10 mL 圆锥形离心管中。
   1. 将细胞悬液在 845 × g 条件下离心 6 分钟。使用连接真空泵的一次性玻璃巴斯德吸管吸除大部分上清液，并用移液器轻轻吹打细胞团块，使其在残留液体中重新悬浮。
   2. 将重悬的细胞转移至 25 cm² 细胞培养瓶中，加入 9 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM。将细胞置于 37 ± 1 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育。每天使用倒置显微镜观察细胞增殖情况，每三天更换一次 DMEM，直至细胞达到亚汇合状态。
   3. 在安全操作台内进行细胞传代：使用一次性玻璃巴斯德吸管吸除培养瓶中的 DMEM。加入 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞层，再用一次性玻璃巴斯德吸管吸除 PBS。
   4. 向 25 cm² 细胞培养瓶中加入 1 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液以解离细胞，并将培养瓶放入 CO₂ 培养箱中孵育。使用倒置显微镜检查细胞是否已从瓶壁脱落并悬浮于溶液中。
   5. 向细胞培养瓶中加入 3 mL DMEM 以终止胰蛋白酶的消化作用。将细胞悬液转移至离心管中，在 845 × g 条件下离心 6 分钟。使用玻璃巴斯德吸管吸除大部分上清液，将细胞沉淀用残留的 DMEM 重悬，再加入 10 mL 含 10% FBS 的新鲜温热 DMEM。
   6. 将 5 mL 细胞悬液分别接种至多个 75 cm² 细胞培养瓶中，每瓶加入 15 mL 含 10% FBS 的新鲜温热 DMEM。将 HaCaT 细胞在 37 ± 1 °C、5% CO₂ 的 CO₂ 培养箱中继续培养，直至细胞达到亚汇合状态。
   7. 重复步骤 5.1.3 至 5.1.6 进行细胞传代，但此次使用 2 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液，并用 6 mL DMEM 终止胰蛋白酶反应。

6. 使用 HaCaT 细胞进行 MTS 细胞活力检测的操作步骤

注意：体外 细胞毒性试验按照 Wenzelewski⁴⁶ 的方法进行，使用细胞培养基提取物。PSU 样品和医用级聚氨酯样品采用环氧乙烷灭菌。

1. 在 37 ± 1 °C 及 5% CO₂ 条件下培养 HaCaT 细胞₂ 在添加了10% FBS的DMEM中，置于75 cm²培养瓶中² 细胞培养瓶。将细胞用于 体外 细胞毒性试验，至少在第四代传代后进行。
   1. 将 PSU 无菌样品和参比材料（0.7 g）加入 50 mL 圆锥形离心管中，用不含 FBS 的 DMEM 在 37 °C、5% CO₂ 条件下提取 72 ± 2 h₂ 以0.1 g/mL的提取比例进行提取，每份PSU样品制备三份提取物。通过将不含FBS的DMEM加入50 mL锥形离心管中制备盲样，并进行相同的提取操作。
   2. 在提取程序的第2天，使用2 mL胰蛋白酶/EDTA和6 mL DMEM，按照步骤5.1.3 - 5.1.5进行细胞解离。取100 µL细胞悬液，加入100 µL DMEM。从此稀释后的悬液中取20 µL，加入10 µL 0.5%台盼蓝溶液以染色死细胞。
   3. 将细胞孵育 2 分钟。使用微量移液器填充血细胞计数板，并立即计数四个计数室内的细胞。计算活细胞与非活细胞数量，以百分比形式评估细胞活力。
      注意：也可使用细胞计数系统对细胞进行计数。
   4. 以 20 × 10⁴ 个细胞的浓度接种 HaCaT 细胞（第四代）³ 细胞/孔，每孔加入200 µL DMEM，接种于96孔微孔板中，于37 °C、5% CO₂条件下培养24小时₂.
   5. 第3天，在提取后，向每份提取物和盲样中加入10% FBS，并使用水浴将样品温育至37 °C。吸去每孔中已接种的DMEM培养基，更换为提取物、盲样以及相应的阳性和阴性对照。对于每份PSU提取物（每份PSU样品使用三种提取物），用移液器将200 µL提取物加入六个孔中。
   6. 将200 µL盲样（DMEM + 10% FBS）加入六个孔中。将200 µL新鲜DMEM（含10% FBS，阴性对照）加入另外六个孔中。将200 µL阳性对照（DMEM + 10% FBS + 1% SDS）加入其余六个孔中。将细胞与提取物及对照物在37 °C、5% CO₂条件下孵育24 h。₂.
      注意：为制备阳性对照，先将20%的SDS溶液溶于水中，再以1:2的比例用DMEM稀释。随后，进一步用DMEM稀释，制备成1%的SDS溶液。
   7. 第4天，在孵育即将结束前，配制MTS与不含FBS的DMEM的储备液（每孔使用20 µL MTS溶液 + 100 µL DMEM）。孵育结束后，移除各孔中的提取物、盲样溶液及对照液，用移液器向每孔加入120 µL MTS储备液，同时向六个无细胞的孔中也加入等量溶液以测定背景值。将细胞在37°C、5% CO₂条件下继续孵育4小时。₂.
   8. 孵育 MTS 溶液第 4 天，使用酶标仪在 492 nm 波长下测定各孔的吸光度。用接种细胞孔的吸光度值减去背景孔的吸光度值。假设阳性对照组测得的吸光度值代表 0% 增殖，将这些吸光度值设为 0；假设阴性对照组测得的吸光度值代表 100% 增殖，将这些吸光度值设为 100。
   9. 根据吸光度值计算细胞增殖率，以阴性对照（100%增殖）和阳性对照（0%增殖）的吸光度值为基准计算百分比。将细胞增殖率在81%以下的样品提取物判定为无细胞毒性。
      注意：根据供应商提供的信息⁴⁷随后测定吸光度。每孔加入25 µL 10% SDS溶液以终止反应，将微孔板置于室温湿润环境中避光保存，最多可存放18小时。

结果

D₄ 和 D₄^Me,Ph 与封端剂 APTMDS 发生环链平衡反应，分别生成了氨基丙基封端的聚二甲基硅氧烷和聚二甲基-甲基-苯基-硅氧烷共聚物。通过调节 D₄ 与 APTMDS 的单体比例，可合成分子量介于 3,000 至 33,000 g·mol^-1 的产物（图6）。所制备 PDMS 的分子量 通过 ¹H-NMR 谱图（图 5）测定，结果与滴定法所得数值相近，并与理论计算值（最高达 15,000 g·mol^-1）相符。在制备高分子量 PDMS 时，实测分子量略高于理论计算值。含侧链苯基的环状硅氧烷 D₄^Me,Ph 的共聚反应成功实现了聚硅氧烷折射率的轻微提升。折射率（使用阿贝折射仪在 37 °C 下测定）从未改性 PDMS 的 1.401 提高至含 14 mol% 甲基-苯基-硅氧烷单元的 1.4356（图7）。PSU 弹性体采用所制备的氨基丙基封端 PDMS、脂肪族二异氰酸酯 H₁₂MDI 和 APTMDS，以 THF 为溶剂，分两步合成。该方法可构建具有软段（PDMS）和硬段（二异氰酸酯 + 脲）分段结构的高分子量 PSU。在线 FTIR 光谱证实，异氰酸酯基团与来自 PDMS 和链延伸剂 APTMDS 的氨基之间反应极为迅速（图3 和 图8）。与需耗时数小时的聚氨酯弹性体制备过程不同，PSU 弹性体的制备更为便捷。PSU 弹性体的透明性和力学性能依赖于 PDMS 的分子量。当 PDMS 分子量不超过 18,000 g·mol^-1 时，所得透明 PSU 弹性体薄膜的透光率可达 >90%；当 PDMS 分子量进一步升高时，PSU 薄膜逐渐变得不透明（图9）。随着 PDMS 分子量的增加，可获得更柔软的 PSU 弹性体。PSU 弹性体的杨氏模量从 PDMS 分子量为 3,000 g·mol^-1 时的约 5.5 MPa 下降至 PDMS 分子量 ≥26,000 g·mol^-1 时的 0.6 MPa（图10）。此外，当 PSU 弹性体由高分子量 PDMS 制备时，其在反复施加应力下的力学滞后性降低，表明机械稳定性提高。在 100% 应变条件下的首个循环中，滞后值从 PDMS 分子量为 3,000 g·mol^-1 时的 54% 下降至 PDMS 分子量为 33,000 g·mol^-1 时的 6%（图11）。所采用的合成方法可制备不出释细胞毒性残留物的 PSU 弹性体，这一点已在 HaCaT 细胞上使用若干选定 PSU 弹性体提取物进行的细胞活力测试中得到验证（图12）。

图1：四甲基铵-3-氨基丙基-二甲基硅醇盐催化剂的合成。
将五水合四甲基氢氧化铵（TMAH）与1,3-双(3-氨基丙基)-四甲基二硅氧烷（APTMDS）在THF中于80 °C反应2小时。粗产物经THF洗涤后，得到白色固体，即为目标催化剂四甲基铵-3-氨基丙基-二甲基硅醇盐。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：氨基丙基封端的聚二甲基硅氧烷（PDMS）及聚二甲基-甲基-苯基硅氧烷共聚物的合成路线。 在80 °C下，以四甲基铵-3-氨基丙基-二甲基硅醇盐为催化剂，使用二硅氧烷封端剂APTMDS对环状单体D₄/D₄^Me,Ph进行24小时的平衡反应。本图改编自Riehle et al.⁴⁸。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：分段式聚硅氧烷基脲弹性体（PSU）的两步合成法 第一步，通过H反应后形成含有活性异氰酸酯基团的预聚物₁₂MDI与氨基丙基封端的聚硅氧烷（R = CH₃：PDMS；R = Ph；共聚物）。在第二步中，聚合物的分子量被提高 通过 剩余的活性异氰酸酯基团与扩链剂APTMDS的反应。所得弹性体是一种嵌段聚合物，包含脲键硬段和硅氧烷软段。该图已根据Riehle修改 等⁴⁸. 请点击此处查看此图的放大版本。

图4：用于应力-应变试验的狗骨状试样规格。 本图改编自Keiper⁴⁵。 请点击此处查看此图的放大版本。

图5：氨基丙基封端聚二甲基硅氧烷的¹H-NMR谱图。 在分子量计算中，使用了亚甲基质子d（δ 2.69 ppm）和b（δ 0.56 ppm）以及甲基质子a（δ ~ 0.07 ppm）的积分值。峰c（δ ~1.5 ppm）与HDO峰重叠⁴⁹，该峰对应于痕量水与溶剂CDCl₃之间的质子交换；因此，该峰不用于分子量计算。本谱图中PDMS的分子量约为16,365 g·mol^-1。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：分子量之间的线性相关性 氨基丙基封端的聚二甲基硅氧烷及封端剂浓度。 数值已确定 通过 ¹核磁共振氢谱（H-NMR）分析、氨基端基滴定法，以及根据公式（1）进行的理论计算。该图经Riehle许可转载 等⁴⁸. 请点击此处查看此图的放大版本。

图7：氨基丙基封端的聚二甲基-甲基-苯基-硅氧烷共聚物的折射率。 使用阿贝折射仪测定了聚二甲基-甲基-苯基-硅氧烷共聚物在20 °C（黑色方块）和37 °C（红色圆圈）下的折射率（RI）。RI值随引入的甲基-苯基-硅氧烷单元含量的增加呈线性上升。0 mol%时的RI值对应于未改性PDMS，其分子量与聚二甲基-甲基-苯基-硅氧烷共聚物相当。当甲基-苯基-硅氧烷含量为14 mol%时，共聚物在37 °C下获得最优RI值1.4346。本图经Riehle et al.⁴⁸许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。

图8：聚二甲基硅氧烷-脲（PSU）合成过程中异氰酸酯基团的转化情况。 该图显示了在PSU合成过程中，通过在线傅里叶变换红外-衰减全反射（FTIR-ATR）光谱法监测2,266 cm¹处NCO吸收峰随时间变化的趋势。加入氨基丙基封端的聚二甲基硅氧烷后，NCO吸收峰高度降低，表明生成了NCO封端的预聚物链。随后加入扩链剂APTMDS后，红外光谱中NCO吸收峰完全消失。本图经Riehle et al.⁵⁰许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

图9：PSU弹性体薄膜在750 nm处的透光率与聚二甲基硅氧烷分子量之间的关系。 PSU薄膜的透光率通过紫外-可见光谱法测定。当使用分子量在3,000至18,000 g·mol^-1范围内的PDMS合成PSU时，其在750 nm（可见光谱的上限）处的透光率>90%。随着PDMS分子量的增加，薄膜的不透明度也随之增加。本图经Riehle et al.⁴⁸许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。

图10：PSU弹性体的杨氏模量随聚二甲基硅氧烷分子量的变化关系。杨氏模量（YM）由PSU薄膜的应力-应变测量结果确定。数值表示五次重复测量所得的平均值，误差棒代表标准偏差。当使用分子量在3,000至9,000 g·mol^-1范围内的PDMS合成PSU时，观察到YM下降最为显著。当PDMS分子量在12,000至18,000 g·mol^-1之间时，YM值介于1.5 MPa与1.0 MPa之间。当分子量大于26,000 g·mol^-1时，YM值约为0.6 MPa。本图经Riehle et al.⁴⁸许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。

图11：PSU弹性体的100%滞后回线。 显示了PSU弹性体在100%伸长率下的首圈滞后回线。聚合物命名法指PDMS的分子量（例如，PSU-3T是由分子量为3,000 g·mol^-1的PDMS制备的聚脲弹性体）。由低分子量PDMS合成的PSU弹性体表现出最高的力学滞后性（43%–54%），这体现在明显的滞后回线上。随着PDMS分子量的增加，滞后性从14%（15,000 g·mol^-1）降低至6%（33,000 g·mol^-1）。本图经Riehle等⁴⁸许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。

图12：结果 体外 PSU提取物处理HaCaT细胞的细胞毒性试验 该图显示了用 PSU 弹性体的细胞培养基提取物处理的 HaCaT 细胞的增殖情况。数据表示每种样品三个提取物的平均值，每个提取物重复测量六次（共 18 个重复）。误差线表示这些测量值的标准偏差。空白组为细胞培养基 DMEM（不含样品），其处理方式与用于提取的细胞培养基相同。选用医用级聚醚型聚氨酯作为参照材料。以 PDMS 为基础、分子量分别为 18,000 和 16,000 g·mol 的硅基聚脲弹性体（PSU-18T、PSU-16T 和 PSU-14Ph）被选为典型的测试样品。^-1 （PSU-18T 和 PSU-16T），而 PSU-14Ph 则基于一种聚二甲基-甲基-苯基-硅氧烷共聚物，其中甲基-苯基-硅氧烷含量为 14 mol%，分子量约为 16,600 g·mol⁻¹^-1PSU弹性体提取物及参比聚氨酯处理的HaCaT细胞平均增殖率均达到或超过100%。因此，PSU弹性体提取物及参比聚氨酯无细胞毒性。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

获得高分子量氨基丙基封端的聚二甲基硅氧烷 通过 使用无水强碱性催化剂对于实现环链平衡至关重要。其他常用的催化剂，如四甲基氢氧化铵（TMAH）或氢氧化钾（KOH），含有水分残留，会促进副反应的发生，因此会得到分子量相近的双官能、单官能和非官能聚二甲基硅氧烷（PDMS）链的混合物。⁴⁴此外，如果使用TMAH，反应需要 >48 小时完成，且并不总是能进行到单体完全消耗⁴⁴.

特别是，端基阻聚剂APTMDS的称量对于获得目标分子量的PDMS至关重要。例如，按照方案第2.1节所述，若合成PDMS时使用0.85 g APTMDS而非0.9 g，则理论分子量将约为 >900 g·mol^-1此外，理论分子量取决于转化情况。如果环状副产物未被显著去除 通过 真空蒸馏时，将获得较高的转化率。例如，采用相同的合成步骤（如方案第2.1节所述），计算得到90%的转化率时，理论上计算的分子量为910 g·mol⁻¹^-1 高于假定转化率为85%时的情况。通过滴定法测定聚硅氧烷分子量时可能出现偏差，这可能与将聚二甲基硅氧烷（PDMS）称量至烧瓶中的操作有关，尤其是在使用50 mL滴定管进行滴定时。若聚硅氧烷称量偏差为0.06 g，则可能导致计算出的分子量差异约为~650 g·mol⁻¹^-1因此，建议使用半自动滴定仪。

通过引入苯基团可提高聚二甲基硅氧烷（PDMS）的折射率^17,51卤代苯基团⁵²，或含硫基团⁵³尝试将苯基引入聚二甲基硅氧烷 通过 八苯基环四硅氧烷（D₄^pH）如 Yilgör、Riffle 和 McGrath 所述⁵⁴ 在所采用的反应条件下未能成功，可能是因为庞大的环状骨架使得催化剂在选定的反应温度下无法断裂硅氧烷键。D₄^pH 若使用KOH并在160 °C的反应温度下进行反应，环状结构可被打开。然而，所得聚硅氧烷的分子量极高，且可能含有大量非功能性杂质。此外，从这些共聚物中去除催化剂KOH并不容易，需采用乙醇盐酸进行中和，随后通过水相萃取除去催化剂。之后，PDMS必须溶解于有机溶剂（如CH₂Cl₂，以分离水相和含有机PDMS的有机相。最后，有机相应在MgSO₄上干燥₄，随后通过旋转蒸发仪进行过滤和减压蒸馏⁵⁴相比之下，本论文所述方法可立即去除催化剂 通过 热分解。因此，不使用固体单体 D₄^pH，通过液体单体D与PDMS主链的共聚反应，成功将苯基引入PDMS主链₄^Me,Ph，经证实 ²⁹Si-NMR波谱法⁵⁰.

合成的PSU弹性体表现出0.6–5.5 MPa的杨氏模量（YM）和高弹性，其断裂伸长率高达1,000%。如此高的伸长率不仅与聚合物的嵌段结构有关，还与PSU弹性体的高分子量相关。 > 100,000 g·mol^-1)⁴⁸氨基与脂肪族异氰酸酯基团在室温下发生瞬时反应，导致分子量迅速增加。这一结果在溶剂中进行反应时得到了进一步证实，因为尽管黏度略有上升，但并未显著减缓反应速率，而若反应速率受到明显影响，则在接近化学计量比平衡的条件下会显著改变产物分子量。相比之下，当使用短链二醇（如1,4-丁二醇）作为扩链剂时，所得聚氨酯-脲弹性体不仅弹性较差，且机械稳定性显著下降，尤其是在使用高分子量PDMS进行合成时更为明显。这一现象可能与弹性体的分子量显著偏低有关（结果未发表），对应于聚加成反应最后阶段异氰酸酯基团未能完全转化。此外，氨基与羟基对脂肪族二异氰酸酯的反应活性差异显著，这对所获得的结果产生了重大影响 体外 细胞毒性试验。由氨基扩链剂APTMDS制备的PSU弹性体的提取物对HaCaT细胞未表现出任何细胞毒性作用（图12然而，若使用基于硅氧烷的聚氨酯-脲弹性体的提取物，则细胞活力显著降低（结果未发表），这可能与低分子量的浸出物及残留的未反应异氰酸酯基团有关。

本方案描述了一种制备氨基功能化聚硅氧烷的便捷方法，所得产物可作为大分子二胺用于合成高分子量、柔软且具有弹性的聚硅氧烷-脲弹性体。由于聚硅氧烷-脲（PSU）的力学性能可根据聚二甲基硅氧烷（PDMS）的分子量进行调节，因此这些聚合物可应用于其他领域。此外，该氨基功能化聚硅氧烷的制备方法还可用于引入乙烯基等侧基团。 通过 含侧链乙烯基的环状硅氧烷的共聚反应（结果未显示）。这可能开辟新的应用领域，包括软质交联聚硅氧烷凝胶的制备（例如，通过氢化硅烷基硅油的铂催化硅氢化反应，或巯基功能化PDMS的紫外光引发硫醇-烯加成反应（结果未显示）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
八甲基环四硅氧烷 (D4)，97%	ABCR GmbH	AB111277	可能损害生育能力，使用前必须脱气 CAS: 556-67-2
1,3-双(3-氨丙基)-四甲基二硅氧烷，97%	ABCR GmbH	110832	对空气敏感，必须在氮气下储存 CAS: 2469-55-8
2,4,6,8-四甲基-2,4,6,8-四苯基环四硅氧烷	Sigma Aldrich	40094	工业级 CAS: 77-63-4
五水合四甲基氢氧化铵	Alfa Aesar	L09658	吞咽及皮肤接触有毒，强碱性，对空气敏感，易吸湿，需冷藏并在氮气下储存 CAS: 10424-65-4
4,4¢-亚甲基双(环己基异氰酸酯) (H12MDI)	Covestro via CSC Jäkle Chemie GmbH & Co. KG		吸入有毒，对皮肤和眼睛有刺激性 CAS: 5124-30-1
四氢呋喃（无水），99.8%	Alfa Aesar	44608	以BHT稳定 CAS: 109-99-9
氯仿，99%	Grüssing GmbH Analytica	1025125000	以乙醇稳定，可能具有致癌性，可能损害生育能力并导致胎儿损伤 CAS: 67-66-3
氘代氯仿，99.8%	Sigma Aldrich	151823	CAS: 865-49-6
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）高糖	Thermo Fisher Scientific Life Technologies GmbH	41965-039
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific Life Technologies GmbH	A3160801
胰蛋白酶/EDTA，0.25% 酚红	Thermo Fisher Scientific Life Technologies GmbH	25200056
Cell Titer Aqueous One Solution 细胞增殖检测试剂（MTS）	Promega GmbH	G3580
HaCaT 细胞	CLS Cell Lines Service GmbH	300493
BioComFold	Morcher GmbH		可折叠调节型人工晶状体
Accommodative 1CU	Human Optics AG		可折叠调节型人工晶状体
CrystaLens	Bausch and Lomb Inc.		可折叠调节型人工晶状体
Silmer OH-Di10	Siltech Corp.		羟基封端聚二甲基硅氧烷
Synchrony	Visiogen Inc.		双光学元件可折叠调节型人工晶状体
Elast-Eon	AorTech International plc		用于医疗应用的热塑性PDMS-PHMO基聚氨酯
Pellethane 2363-80A	Lubrizol Life Sciences		用于医疗应用的热塑性聚醚基聚氨酯
Zwick 81565 型万能拉力试验机及 testXpert II 软件	Zwick GmbH & Co. KG		拉力试验机
CASY	Roche Innovatis AG		细胞计数系统
Multisizer	Beckman Coulter Life Sciences		细胞计数系统