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低成本小鼠新物体识别与物体位置行为测试

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DOI：

10.3791/58593

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2018年11月20日

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1Department of Psychology, Ohio State University, 2Department of Neuroscience, Ohio State University, 3Center for Chronic Brain Injury, Ohio State University

本文内容

摘要

本文提供了一种经济高效的小鼠物体位置和新物体识别行为测试的完整实验方案，包括所需设备的设计、成本、制作方法，以及行为学测试的实施、数据采集与分析的详细操作步骤。

摘要

在利用小鼠模型研究各种生理或病理变化对认知功能影响的研究中，符合动物行为学相关性的行为学测试是至关重要的组成部分。物体位置任务（OLT）和新物体识别任务（NORT）是两种常用且有效的行为学任务，可用于揭示参与记忆功能的特定脑区的功能状态及其相对健康程度。尽管这两种测试均利用小鼠对新异刺激的天然偏好来评估其对先前接触过物体的记忆能力，但OLT主要评估依赖海马体活动的空间学习能力；相比之下，NORT则评估不依赖空间信息的物体身份识别学习能力，该过程涉及多个脑区的协同作用。这两种任务均需要一个开放场测试环境、对小鼠具有等效内在价值的物体、适当的环境线索，以及视频记录设备和配套软件。虽然市面上有现成的商用系统可供使用，但其成本较高。本文详细描述了一种简单且经济高效的方法，用于构建OLT和NORT所需的测试环境并配置相应设备。此外，本文还介绍了一种高效的测试流程，可同时整合OLT与NORT，并提供了典型的数据采集与分析方法以及代表性实验结果。成功实施这些测试可为多种小鼠模型系统的记忆功能提供有价值的见解，并评估支持这些功能的神经基础区域。

引言

有效的认知测试通过在受控环境中检测行为，来分离并评估特定脑区的神经功能1。在人类研究中，已设计出特定任务以评估目标脑区的功能，例如用于评估前额叶功能的威斯康星卡片分类任务，或剑桥神经心理测试自动化成套测验（CANTAB）中的配对联想学习测试，用于评估海马功能2,3。这些测试旨在通过评估由特定脑区神经活动所引发的行为，来研究人类特定脑区的功能。大多数生物医学研究的最终目标是改善人类健康；然而，许多关于健康或疾病状态下脑功能的研究因伦理原因无法在人类受试者中开展。对于无法使用人类受试者的研究，小鼠等小型啮齿类动物通常是首选模型。使用小鼠模型可直接控制实验干预，包括基因表达的改变、损伤的诱导，甚至通过光遗传学技术对神经环路活动进行调控。对小鼠的行为测试与人类测试类似，旨在通过测量依赖于特定脑区的行为，来评估实验变量对脑功能的影响。

海马体对人类和啮齿类动物的记忆形成至关重要4更具体而言，海马体在涉及关系表征的陈述性记忆中起着关键作用，但不参与依赖大脑运动中枢的程序性记忆。4海马记忆功能一直是神经科学多个领域的研究重点，因其对干扰极为敏感。从长期压力和衰老到癫痫发作及中风等负面干扰均与海马损伤相关。5相比之下，积极干预措施（如社交互动、物理环境丰富化或运动）可改善海马功能6,7,8通过适当的海马体记忆测试开展啮齿类动物研究，能够揭示记忆的细胞与分子机制，以及不同环境干预对海马体功能的影响。

在啮齿类动物中，已开发出多种用于研究依赖海马体的学习与记忆的测试方法9,10,11。这些方法大致可分为两类：一类需要具有情绪效价的刺激以引发行为改变，另一类则利用啮齿类动物对新奇刺激的探索偏好11。例如，情境恐惧条件反射将一种不愉快的刺激（足底电击）与特定环境背景配对，随后通过测量恐惧诱导的僵直行为来检测动物对情境的记忆9,11。莫里斯水迷宫及其干式版本——巴恩斯迷宫，则利用负性外部强化来促进空间学习4,11。在这两种情况下，啮齿类动物分别因浸入冷水或暴露于明亮平台而处于厌恶情境中，从而驱动其寻找逃脱路径。相比之下，放射臂迷宫依赖正性强化，动物通过自然觅食行为结合空间记忆来获取少量食物奖励4,11。这些任务被广泛使用，并为理解海马体记忆功能奠定了重要基础。然而，依赖负性或正性外部强化，或使用如电击等诱发恐惧的刺激，会为这些行为测试引入情绪成分，在某些情况下可能并不理想。例如，背侧和腹侧海马体分别主要参与空间记忆和情绪调节功能12。如果腹侧海马体的情绪调节功能同时受损，那么依赖情绪反应的测试可能无法准确反映空间记忆的损伤情况。

新物体定位测试（OLT）是一种简单且有效的实验方法，可用于评估依赖海马体的空间记忆能力13。该任务基于动物对新异刺激的内在偏好，无需额外的外部强化，因此通常可避免因不同情绪反应所引起的干扰13。本实验方案以小鼠为对象介绍OLT操作流程，但若适当调整设备尺寸，该方法同样适用于大鼠。该方案包括让小鼠适应开放场测试环境，随后使其在空间环境线索的背景下探索两个物体。之后将小鼠移出测试区域，在一段延迟时间（即试次间间隔，ITI）内移动其中一个物体。ITI结束后，将小鼠重新放入测试区域并允许其自由探索。通常情况下，小鼠具有对新异性的偏好；若其能够记住初次暴露时物体所处的位置，则会花费更多时间探索被移动过的物体。而具有海马损伤的动物则表现出空间情境学习能力受损，因而对处于新位置的物体不表现出探索偏好14,15。

OLT 可单独使用，也可与另一种依赖多个脑区神经活动的记忆测试——新物体识别任务（NORT）联合使用。NORT 在测试阶段之前与 OLT 完全相同，区别在于测试阶段中，其中一个物体被一个新物体替代，而非移动至新位置。与 OLT 类似，对物体记忆良好的小鼠会自发地更倾向于探索新物体。与主要依赖海马区结构的物体位置记忆不同，物体识别记忆似乎依赖于多种脑区，而海马区是否参与其中尚存争议。许多研究报道，海马区损伤或失活不会影响对新物体的偏好10,13,16,17，而另一些研究则得出了相反结论18,19。然而，NORT 仍被广泛用于评估啮齿类动物的一般记忆功能。

本文所述方案详细介绍了启动和实施开放场测试（OLT）与新物体识别测试（NORT）的步骤，这两种测试均使用开放场测试 arena。 commercially available behavioral testing equipment 可能价格昂贵，尤其对于规模较小的实验室而言。本方案包含 arena 的设计以及在成本最低且无需专业工具的情况下自行构建 arena 的简单步骤。此外，本方案还详细说明了理想的行为学测试区域，包括 arena 的摆放位置、环境线索以及视频记录系统，为实施 OLT 与 NORT 方案提供了必要条件。文中展示了成功与失败研究的代表性结果，强调了针对每项研究优化所有材料与操作流程的重要性。

描述选项数量
部件 A：亚克力板 - 不透明白色 (0.635 cm × 40 cm × 40.64 cm)铣边2
部件 B：亚克力板 - 不透明白色 (0.635 cm × 40 cm × 41.91 cm)铣边2
部件 C：亚克力板 - 不透明白色 (0.635 cm × 41.91 cm × 41.91 cm)铣边1
亚克力胶水 (1 品脱)不适用1
16 号规格低致敏性点胶器不适用1
组合角尺不适用1
高清网络摄像头不适用1
视频采集软件不适用1
USB 2.0 延长线不适用1
电缆护套管不适用1

表1：行为学测试所需材料与设备的详细清单。

方案

本方案已获得俄亥俄州立大学（OSU）机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 构建实验区域

  1. 根据表1订购材料：五片丙烯酸板、丙烯酸胶水和一支16 G针头的注射器。
  2. 根据制造商的说明佩戴适当的安全设备，可能包括眼部、皮肤及其他类型的防护。
  3. 从丙烯酸板上去除保护纸涂层。
  4. 对所有材料进行干装配，以确认尺寸正确（图1A）。
  5. 组装注射器并装入丙烯酸胶水。
  6. 将一个侧壁（部件B）的长边与底板（部件C）的顶边对齐，并使用组合角尺或机械师角尺确保两者相互垂直。
  7. 使用注射器，在待连接的两个部件的接缝处直接均匀地施加少量连续的胶线。
  8. 将两个部件（部件B和C）固定到位，直至初步固化（约5分钟）。
    注意：通常情况下，24小时内可达到80%的固化程度，但5分钟后即可继续组装操作。
  9. 对另一侧壁（部件B）与同一底板重复步骤1.5–1.7。
  10. 依次使用步骤1.5–1.7将两个内侧壁（部件A）连接到底板上。
  11. 此外，使用注射器在外部侧壁（部件B）与内部侧壁（部件A）之间新形成的接角处，直接均匀地施加少量连续的胶线。
  12. 将这些部件固定5分钟。
  13. 24–48小时后，开始搭建行为学测试环境。

2. 行为测试环境与设备的设置

  1. 在测试区域中，将环境线索（如讨论部分所述）放置在相对的位置，并朝向测试区域的各个竞技场（图1B）。
  2. 将四个测试竞技场以2×2方式排列，放置于地面或稳固的桌面上，与线索及摄像头保持适当距离，以最大化小鼠的视觉输入（图1B）。
  3. 使用米尺从每个竞技场底部靠墙处向上延伸至线索方向，检查视线是否通畅，以确认竞技场与线索之间的距离合适。
  4. 通过调节摄像头或桌子的高度，确定最佳光学路径长度，以确保能够同时对全部四个竞技场进行视频记录（图1B）。
  5. 将摄像头连接至USB延长线。
  6. 使用线槽沿天花板布线，并沿墙面引下至运行视频采集软件的计算机。
  7. 将计算机隐藏在窗帘后方，以使测试区域中的小鼠与研究人员相互隔离（图1C）。
  8. 准备至少3种不同类型、每种4个的测试物体，物体尺寸约为长宽2–5 cm、高度不超过10 cm（图1D）。

静态平衡示意图，ΣFx=0，实验装置，尺寸，屏幕校准，带尺子的木偶。
图1：行为学测试准备。（A）旷场测试装置的组装示意图，其中部件A为内侧壁，部件B为外侧壁，部件C为底座。组装完成后，底座（部件C）四周将安装两个完整的外侧壁（部件B），并在相邻边缘之间的外侧壁内嵌入两个内侧壁（部件A）。所有侧壁均置于底座上方。（B）测试区域中四个测试装置在高度为0.62 m的桌面上的典型布局，包括尺寸为60 × 90 cm的环境线索、照明设备以及用于同时记录四个测试装置的摄像机。（C）实验过程中，用帘子将实验操作者和计算机系统与小鼠隔离开。拍摄本图时打开了顶部照明灯，但在实际测试过程中仅使用落地灯照明。此外，本图中移除了一项环境线索，而在正式测试时，测试区域前方会设置第四个线索，正对桌子后方的全黑色线索。（D）适用于小鼠物体位置识别（OLT）或新物体识别（NORT）测试的代表性物体（附尺子作为比例参照）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 验证这些对象。
    1. 获取至少8只野生型小鼠，其性别、品系和年龄组应与实验所用小鼠一致例如， 6至9周龄的雌性和雄性C57Bl/6小鼠
    2. 在测试前3–5天内，每天对所有小鼠进行1分钟的抓握操作。
    3. 将小鼠分为每组4只，若尚未单只饲养，则将其转移至单独的清洁饲养笼中。
    4. 将它们带入测试室，并使其适应环境至少30分钟。
      注意：在实验的这 30 分钟内，实验人员待在房间内可减少小鼠在任务过程中的应激反应，特别是当实验人员为男性时20.
    5. 适应期结束后，当实验人员准备就绪，即可开始录制视频。
    6. 将每只小鼠面向旷场某一角落的墙壁放置（该角落称为释放角）图2A).
    7. 让小鼠在实验区域内自由探索10分钟。
    8. 停止录制视频。
    9. 将小鼠放回清洁的饲养笼中，静置 20 min。
    10. 使用动物设施推荐的清洁方法（如用70%乙醇擦拭）彻底清洁所有实验区域，以在下次使用前尽量减少嗅觉线索。
    11. 使用双面胶带，将两个不同的物体固定在非释放端的两个角落附近，使物体在 arena 内达到反向平衡，且每个物体大小为 6 cm × 6 cm2 从该角落的每一面墙图2B).
    12. 开始录制视频。
    13. 将每只小鼠面向墙壁放置于释放角落。
    14. 让小鼠在实验区域和物体中自由探索10分钟。
    15. 停止录制视频。
    16. 将小鼠放回其清洁的饲养笼中，静置20分钟。
    17. 使用动物设施推荐的清洁方法（如用70%乙醇擦拭）彻底清洁所有实验区域和物体，以尽量减少嗅觉线索。
    18. 用两个新物体固定在相同位置重复训练试验，直到每只小鼠均已测试过所有物体（若同时进行OLT和NORT，则至少使用三种不同的物体）。
    19. 排除允许小鼠坐在其顶部的物体。
    20. 根据步骤4分析每只小鼠与每个物体的探究时间。
    21. 排除具有负内在值或正内在值的对象。

3. 进行行为学测试

  1. 测试前一周：对行为测试操作人员进行适应性熟悉
    1. 在测试前3–5天内，每天对6至9周龄的成年雌性和雄性C57Bl/6小鼠进行1分钟的手动操作处理。
  2. 第1天：适应性训练阶段
    1. 将小鼠分为每组4只，如果尚未单独饲养，则将其转移至单独的清洁暂养笼中。
    2. 将小鼠带入测试房间，并让其在测试房间内适应至少30分钟。
      注意：实验人员在房间内停留这30分钟可减少小鼠在任务过程中的应激反应，特别是当实验人员为男性时20。
  3. 适应完成后，当实验人员准备开始时，启动视频录制。
  4. 将每只小鼠单独放入一个测试区域（每个区域一只小鼠），使其面朝释放角落的墙壁（图2A）。
  5. 允许小鼠在测试区域内自由探索6分钟。
  6. 停止视频录制。
  7. 在试验间歇期（ITI）期间，将小鼠放回其清洁的暂养笼中。
  8. 使用动物设施推荐的清洁方法（例如用70%乙醇擦拭）清洁所有测试区域，以尽量减少嗅觉线索残留。
  9. 重复步骤3.3–3.9两次，使每只小鼠共完成3次适应性训练。
  10. 将所有小鼠放回其原饲养笼中。
  11. 在次日使用前，使用动物设施推荐的清洁方法（例如用70%乙醇擦拭）彻底清洁所有测试区域，以尽量减少嗅觉线索残留。
  12. 第2天：训练试验、物体位置识别测试（OLT）、新物体识别测试（NORT）
    注意：NORT为可选测试。
    1. 24小时后，将同一批小鼠带入测试房间，并像前一天适应阶段一样，让其在测试房间内适应至少30分钟。
    2. 使用放置在测试区域内的两个物体进行训练试验（图2B）。
      1. 使用双面胶带将两个6 × 6 cm2大小的物体固定在两个非释放角落，确保物体在测试区域内位置平衡。
      2. 开始视频录制。
      3. 将每只小鼠面朝释放角落的墙壁放入测试区域，方式与适应阶段相同。
      4. 允许小鼠自由探索测试区域及物体10分钟。
      5. 停止视频录制。
      6. 将小鼠放回其清洁的暂养笼中，进行20分钟的试验间歇期（ITI）。
      7. 使用动物设施推荐的清洁方法（例如用70%乙醇擦拭）清洁所有测试区域和物体，以尽量减少嗅觉线索残留。
    3. 进行物体位置识别测试（OLT）。
      1. 将训练试验中使用的一个物体移动至一个新的非释放角落，并使用双面胶带将其固定在该角落的两面墙各6 cm处（图2C）。
        注意：另一个物体应保留在训练试验中的原始位置。
      2. 开始视频录制。
      3. 将每只小鼠面朝释放角落的墙壁放入测试区域。
      4. 允许小鼠自由探索两个物体10分钟。
      5. 停止视频录制。
      6. 将小鼠放回其清洁的暂养笼中，进行20分钟的试验间歇期（ITI）。
      7. 使用动物设施推荐的清洁方法（例如用70%乙醇擦拭）清洁所有测试区域和物体，以尽量减少嗅觉线索残留。
    4. 进行新物体识别测试（NORT）。
      1. 将OLT中未移动的物体替换为一个新物体，并使用双面胶带将新物体固定在角落的两面墙各6 cm处（图2D）。
      2. 开始视频录制。
      3. 将每只小鼠面朝释放角落的墙壁放入测试区域。
      4. 允许小鼠自由探索两个物体10分钟。
      5. 停止视频录制。
      6. 将小鼠放回其原饲养笼中。
      7. 在下次使用前，使用动物设施推荐的清洁方法（例如用70%乙醇擦拭）清洁所有测试区域和物体，以尽量减少嗅觉线索残留。

盒内小鼠行为分析；带有彩色物体的实验装置，四个图示步骤 A-D。
图 2：实验的场地配置。（A）适应阶段使用的无物体开放场测试场地。黑色箭头指示释放角落。该角落应在每个场地中处于相同的相对位置，并且对每只测试小鼠及每次试验均保持一致。（B）训练试验中，将两个不同的物体固定在开放场内，距离各自墙壁 6 × 6 cm 处。（C）在物体位置识别试验（OLT）中，将其中一个物体移动至新位置，新位置同样距离墙壁 6 × 6 cm，且不位于释放角落。（D）在新物体识别试验（NORT）中，用一个新物体替换在 OLT 中保持不动的物体，而之前在 OLT 中被移动过的物体则成为熟悉物体。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 行为测试数据分析

注意：视频分析应由至少两名独立且不知分组情况的实验人员完成。

  1. 打开视频文件。
  2. 在屏幕上方应用一个透明圆圈，为每个物体周围提供 2 cm 的边界，以帮助确定主动探究行为。使用在实验区域中放置了标尺的视频图像来校准该网格。
  3. 观察小鼠行为，并记录小鼠主动探究物体的时间，即其鼻尖朝向物体且与该物体的距离不超过 2 cm 的时间段。
    1. 记录小鼠开始探究某一物体的时间戳以及停止探究该物体的时间戳。
    2. 在试验持续期间，对实验区域内的两个物体重复此操作。
    3. 通过将每次探究的停止时间减去开始时间，计算每次探究的持续时间，并将所有持续时间相加，得出小鼠对每个物体的总探究时间。
  4. 使用以下公式计算总探究时间的百分比或辨别指数：
    1. 计算总探究时间的百分比 =
      新奇偏好指数公式；方程展示新物体与熟悉物体互动比率。
      注：数值高于 50% 表示对新位置或新物体的探究更多。
    2. 计算辨别指数 =
      新奇恐惧指数公式；统计图；测量对新奇刺激的反应时长。
      注：正值表示对新物体的探究时间更长。辨别指数为零表示对两个物体的探究时间相等。
  5. 根据比较组数，使用 t 检验或方差分析（ANOVA）对结果进行图形化表示并完成统计分析。

结果

图3展示了使用本方案在成年雄性和雌性C57Bl/6小鼠中获得的典型阳性与阴性结果示例6。OLT和NORT数据的解读始终基于群体的汇总数据（见下文讨论）。单只小鼠的探索时间不能被解释为存在或缺乏记忆。然而，可以通过统计学检验将一组小鼠（即，多个样本）的表现与其他组或固定偶然水平进行比较。在典型的训练试验中，小鼠群体平均而言对任一物体均无显著偏好，因为两个物体对它们来说都是同样新颖的，且对小鼠本身不具有内在的正性或负性价值（图3A和3B）。如果某组小鼠的汇总数据显示在训练阶段对某一物体存在显著偏好，则不应使用这些物体，因为这种固有的偏好或厌恶会影响后续试验的结果。此外，所有小鼠的总探索时间必须达到最低标准（传统上设定为20秒21），并应进行比较，以确保在探索行为基线上不存在可能影响后续记忆测试的差异。

在物体位置记忆测试（OLT）中，小鼠对移动后物体的平均探索时间显著超过总探索时间的50%，表明其具备物体位置记忆能力（图3A）。若各小鼠的总探索时间差异较大，则以物体的辨别指数来呈现结果更为合适（图3B）。图3B中平均辨别指数的显著升高表明，小鼠在物体移动后对其探索时间更长。无论采用探索时间百分比还是辨别指数进行衡量，物体移动后探索时间的增加均提示小鼠能够记住训练阶段中该物体的原始位置。

本方案的最后一次试验用于评估物体识别记忆。一个代表性示例显示，一组小鼠的平均探索时间百分比（图3C）以及辨别指数（图3D）均高于固定的对照值50%和0。与OLT数据类似，若个体小鼠之间的总探索时间存在显著差异，则辨别指数可能是更优的数据可视化方法。图3E展示了一个在新物体识别试验（NORT）中进行两组比较的示例，以及此类测试中可能出现的一些统计学复杂情况（见讨论部分）。尽管对B组进行的单样本t检验显示其探索时间显著高于50%，但对A组进行的相同检验则未显示显著性。这一结果并不意味着A组与B组之间存在差异。要确定组间差异，必须单独进行两样本非参数Mann-Whitney检验，以比较B组与A组。对该代表性组数据进行的两样本非参数Mann-Whitney检验显示，两组在新物体探索时间百分比上无显著差异（p = 0.66）。

新物体识别（OLT）和新物体位置识别（NORT）实验均对物体的内在价值高度敏感，因此必须对物体的等效性进行充分测试，以确保不存在可能干扰实验结果的内在偏好偏差。图3F 和3G 展示了物体选择不当的一个示例。在一项样本量为4只小鼠的预实验中，当物体A与物体B配对时，小鼠对物体A的探索时间呈现出低于50%的趋势（图3F）。当这些物体随后用于新物体识别任务（NORT），以物体A作为新物体，并将样本量扩大至16只小鼠时，小鼠对物体A的探索时间显著低于50%（图3G）。这种对新物体的回避行为明显反映出实验中的技术缺陷，也正说明了为何在实验前必须通过预实验检测动物对物体本身是否存在固有偏好或回避倾向。

行为学分析图；% 探究时间 vs. 辨别指数；物体识别测试。
图3：野生型成年C57Bl/6小鼠的行为学测试数据。（A）训练试验与OLT期间对移动物体的总探究时间百分比比较显示，物体移动后探究时间显著增加。****p < 0.0001，配对t检验。（B）训练试验和OLT期间对移动物体探究的代表性结果以辨别指数表示，同样显示物体移动后对其探究显著增加。****p < 0.0001，配对t检验。（C）NORT中对新物体的总探究时间百分比显示小鼠显著偏好探究新物体。**p = 0.0024，单样本t检验 vs. 50%。（D）NORT中新物体探究的代表性结果以辨别指数表示，同样显示对新物体的探究偏好。**p = 0.0024，单样本t检验 vs 0。（E）涉及两组不同小鼠的NORT分析代表性结果。通过单样本t检验，B组与50%相比差异显著（**p = 0.0024），而A组无显著差异（p = 0.5837）。在另一项用于比较组间差异的分析中，由于组间样本量不均，采用双样本Mann-Whitney检验，未发现探究时间的显著差异（p = 0.66，ns）。（F）在小样本量的验证试验中，与物体接触的时间百分比显示出对物体的回避趋势。p = 0.2159，单样本t检验。（G）在更大样本量下，将（F）中的物体作为NORT中的新物体，发现即使为新物体，小鼠仍对其表现出显著回避。*p = 0.0270，单样本t检验。此为物体选择技术失败的一个示例。数据以均值 ± 标准误表示。图C-E的数据改编自先前发表的研究6。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案提供了一种经济有效的方法，用于在小鼠中开展物体位置识别和新物体识别行为测试。这些测试可用于评估海马功能以及其他皮层区域（如参与物体识别的前额叶皮层）的功能10。物体位置测试（OLT）和新物体识别测试（NORT）的优势在于无需使用莫里斯水迷宫、情境恐惧条件反射、巴恩斯迷宫或放射臂迷宫所必需的具有强烈情绪效价的刺激。此外，这些测试也避免了放射臂迷宫所需的禁食处理。同时，本方案描述了一种简单的两天测试流程，执行和分析过程均无需复杂或昂贵的设备。这类任务的一个缺点是无法测量学习或习得过程。对新物体探索时间的差异可能源于训练期间对物体信息的学习较差、对已学内容的记忆能力较差，或两者兼有。探索物体的总时间是排除探索动机本身存在固有差异的重要指标，但不能作为学习能力的衡量标准。如果实验问题需要评估学习能力，则可能更宜选择水迷宫、巴恩斯迷宫或放射臂迷宫。

自行定制行为实验装置有望节省数百美元，使各类实验室在经费允许范围内开展物体测试。本方案消除了诸多障碍，简化了制作流程，使无丙烯酸材料专业加工经验的科研人员也能更便捷地在实验室内部完成装置的构建。需要注意的是，应选购与小鼠体色形成对比的彩色丙烯酸板，例如为黑鼠选用白色丙烯酸板，为白鼠选用黑色丙烯酸板，这将有助于数据的采集与分析，尤其是在使用 commercially available 分析软件时。订购已裁切至所需尺寸并带有"铣边"的板材可省去台式锯机的使用（表1）；使用丙烯酸胶水则可避免钻孔和沉头预钻孔的操作。由于丙烯酸材质较脆，拧紧紧固件、钻孔或切割时常会导致材料断裂、崩边或开裂。由于该胶水是一种溶剂，它会渗入接合区域，溶解并软化所接触的丙烯酸材料。因此，不应像使用传统胶水那样将胶水分别涂在各个部件上。与普通胶水不同，丙烯酸胶水不能填充空隙，也不依赖表面粘附。这是必须订购"铣边"板材的主要原因，因为铣边可确保边缘平滑且平整，从而形成更牢固的结合。当胶水干燥后，将通过一种称为"溶剂焊接"的过程，使两块丙烯酸板融合为一个整体。类似于金属焊接，最终产物为单一构件，但焊接区域始终是结构中最薄弱的部分。因此，实验装置投入使用后，应避免在这些接合处施加直接冲击或极端应力。

本方案还展示了如何设置4个实验区域，以同时对最多4只小鼠进行测试（图1 和图2）。实验区域的不透明墙壁可防止小鼠在测试期间相互看见，但仍有可能因房间内存在其他小鼠而产生气味或噪音干扰，从而影响测试结果。如本文所述，通过适应性训练试验可在一定程度上缓解此类问题，因为在行为学测试前，小鼠已预先暴露于多只动物共处的环境条件下。然而，如果其他小鼠或实验人员在处理其他小鼠时产生的噪音干扰问题较为严重，也可仅使用一个实验区域和一只小鼠进行测试，尽管这将延长完成OLT和NORT所需的时间。理论上也可使用超过4个实验区域，但大多数摄像头的视野不够宽，无法以良好的分辨率同时显示如此多的实验区域。

此处提供的尺寸和距离是在典型测试房间（尺寸为 16 x 16 x 16 m3）中进行小鼠行为测试的一般性指导原则（图 1B 和 1C）。适当的环境线索、测试区域以及视频记录设备的设置必须根据每个具体环境进行优化。线索可由大型形状或图案组成（通常为黑白），以帮助小鼠在物体位置识别测试（OLT）中进行空间定向。线索不仅可以放置在相对的不同位置，也可以直接安装在测试区域的墙壁上。本方案建议使用帘子将测试房间分隔开，以在行为测试期间遮挡研究人员和计算机。在所有适应期、试验间期以及主动试验期间，研究人员应关闭帘子，使自身与测试区域隔离。如果此操作不可行，计算机可保留在小鼠视线范围内，但研究人员必须在任务进行期间移出小鼠视野。若研究人员留在现场，小鼠可能会试图将其作为空间线索加以依赖。

所有行为学测试应在温度和湿度受控的环境中进行，光照应微弱且均匀，照度约为 310 lux，同时尽量减少额外的声音干扰或强烈的环境气味线索（例如实验人员身上的香水气味）。每次试验之间以及每天测试结束后，所有测试区域和物体均应使用动物设施推荐的消毒方法进行清洁，例如用 70% 乙醇或无香型含氯消毒湿巾擦拭，以最大限度减少嗅觉线索残留。 若使用化学消毒剂，建议最后用 70% 乙醇冲洗一遍，因为许多化学消毒剂可能对动物足部产生刺激。  与任何行为学任务一样，在测试前需对小鼠进行数天的抓握适应训练，使其熟悉将要执行 OLT 和 NORT 实验的人员，从而降低测试过程中的应激反应20,22。由于小鼠在测试区域附近遇到不熟悉人员时可能会产生急性应激，因此建议所有行为学测试均由相同的一名或多名实验人员完成。本方案中详述的测试参数和条件已针对 6 至 9 周龄的成年 C57Bl/6 小鼠进行了优化，最适合用于揭示该年龄段小鼠因损伤导致的记忆障碍，或老年小鼠因年龄本身引起记忆功能下降的情况。如果目标是检测年轻小鼠的记忆改善情况，则建议采用更长的间隔时间（ITI），范围从 1 小时到 1 天，以避免在较简单的 20 分钟 ITI 版本中出现表现上限效应。实际上，ITI 可根据实验的具体需求、小鼠品系和年龄，从 5 分钟（用于即时回忆）到数小时甚至数天（用于远期记忆）之间调整。重要的是，无论 ITI 长短，在同一实验的不同测试会话之间必须保持一致。由于不同品系和年龄的小鼠在行为和学习能力方面存在差异，因此每个试验的时间安排、间隔时长、测试区域布局以及所用物体均可根据具体的小鼠品系、年龄以及所研究的损伤/疾病/干预模型进行相应调整9,21,23,25。

尽管在新物体定位实验（OLT）中测试的空间记忆功能对海马体的依赖性已有充分证实，但新物体识别实验（NORT）可能依赖也可能不依赖于海马体。解读NORT实验数据时应考虑这一局限性。目前尚无共识确定哪些变量会影响海马体是否参与物体识别记忆，可能的因素包括间隔时间（ITI）的长短或空间线索的显著性18。值得注意的是，本方案中先进行空间OLT再进行NORT，这可能会使小鼠在NORT中更倾向于使用海马体相关的认知过程。因此需要指出，根据实验人员的研究问题和实际需求，两种实验的顺序可以调换，也可以独立进行。

对象选择是OLR和NORT实验中的关键环节22,24。理想的对象应具有足够的重量，以免被小鼠轻易移动，并由玻璃或金属等材料制成，以防止小鼠通过啃咬或抓挠造成损坏。木材、泡沫或软塑料制成的对象不适用，因为它们容易变形且难以保持无气味状态。此外，实验中使用的所有对象在大小、质地、气味和材质方面应相对相似。图1D展示了一个合适的对象示例。这个橙色塑料小鸡模型内部填充了沙子以增加重量，并经过密封处理，防止清洁剂或其他产生气味的物质泄漏。由于其顶部形状特殊，小鼠无法攀爬或停留在该对象上。在OLR或NORT实验中，该对象最好与另一个在大小、重量、材质、颜色和复杂程度上相似的对象配对使用，例如一个类似的塑料兔子模型。为确保对象探索行为真实反映对新奇性的偏好，所有对象必须使用与实验组相同品系、性别和年龄的小鼠（至少8只）进行内在价值均等性的验证，具体方法见方案第2.9节。此外，为进一步确保对象本身的固有特性不会影响偏好判断，应在同一研究中不同小鼠之间随机分配哪个对象为新对象或移动对象。对象的放置位置也会显著影响OLR和NORT实验的成功与否。对象在实验区域中必须进行交叉平衡放置，且不应过于靠近墙壁。若角落被对象占据，会成为小鼠藏身的有利位置，从而干扰对探索行为的准确测量。

数据采集的一个重要前提是定义"主动探究"，即小鼠将鼻尖朝向物体并在距离物体不超过2 cm的范围内与之互动。小鼠从物体上方经过或视线越过物体均不构成主动探究。此外，由于物体位置识别测试（OLT）和新物体识别测试（NORT）依赖于小鼠对物体空间位置或具体特征的记忆，因此在训练试验期间必须对这些特征进行充分的探究。因此，研究人员必须设定一个最低探究时间，并排除任何未达到该基准探究水平的个体，传统上这一标准设定为20秒21。

对象探索时间的量化可以通过多种方式实现，无论是否使用昂贵的分析软件均可完成。如果采用此处所述的手动评分方法，最全面的数据采集方式是在视频中记录小鼠探索对象时的时间戳。在三次独立实验过程中记录对象探索的开始和结束时间，可生成一份永久性的、无偏倚的时间戳记录，从而便于准确地手动计算数据，相较于使用秒表累加记录小鼠对每个对象探索的总时间等其他方法更为精确。

也有商用软件包可用于评分物体探究行为。市售软件能够提供远超本文所述人工评分数据的丰富信息，包括总移动距离、在实验区域特定位置停留的时间以及运动速度16,23。软件在经过适当校准并确认可可靠检测物体探究行为后，其数据产出速度也远快于人工评分。从长远来看，这种更快的数据产出速度可能相比人工评分所需的人力工时带来净成本节约。然而，大多数行为分析软件的前期成本较高，对许多实验室而言可能难以承受，而人工评分通常可由学生研究人员完成，从而使行为评分的小时成本降至最低。此外，商用软件通常对可同时使用软件的用户数量有所限制，从而制约了数据处理通量和时间节省效果。尽管这些软件包具有诸多优势，但获取OLT和NORT实验中物体探究时间这一核心信息并非必须依赖此类软件。能够通过人工方式获取该数据，使得新物体识别任务对更广泛的研究人员而言在经济上更具可及性。

本方案的另一个特点是，习惯化阶段的第一次实验本质上是在开放场环境中进行的试验，可提供关于活动水平和焦虑程度的数据。如果有轨迹追踪软件，可以通过总移动距离或平均速度来量化活动水平。同样，利用轨迹追踪软件，焦虑程度可通过动物在 arena 中心区域停留的时间或在中心区域移动的距离来评估。这些数据也可以通过手动方式获取，即在 arena 视频上叠加网格，统计穿越网格的次数。此类开放场数据有助于排除可能影响后续物体探究的明显运动功能缺陷或过度焦虑情况。

本方案中使用的统计检验方法代表了传统的分析方法。在比较两组小鼠时，建议采用双样本、双尾t检验，以检验各组在探索移动物体或新物体的时间百分比上的差异是否具有显著性。如果样本量不均衡、变异度过高，或组间变异度不一致，则建议改用非参数检验，因为在这些情况下，t检验的许多基本假设将被违反。在比较三组或更多组小鼠时，建议采用方差分析（ANOVA），以检验组别对探索移动物体或新物体的时间百分比是否有显著影响。随后可应用误差校正的事后检验（如Tukey检验或经Bonferroni校正的成对比较），以检验每两组之间探索时间百分比的差异。对于物体位置识别测试（OLT），另一种数据分析方法是检验从训练阶段到OLT测试阶段，探索移动物体的时间百分比是否发生显著变化。若仅有一组小鼠，该检验可采用配对双尾t检验，检测每只小鼠在训练阶段与OLT阶段探索移动物体的时间百分比是否存在显著变化（需注意这是配对分析而非独立测量，因为每只小鼠提供两个数据点）。若为两组小鼠，则应采用重复测量双因素方差分析（重复测量因素为试验阶段（训练 vs OLT）），组别分配为第二个因素。针对处理组间差异的事后检验，应在各试验阶段内对组别进行相互比较。

或者，如果仅需检验OLT或NORT中是否存在记忆表现，可采用单样本t检验，将探索物体的时间百分比与50%的固定值进行比较。若时间百分比显著高于50%，则提示对该物体存在记忆；若显著低于50%，则提示存在某种原因的厌恶反应，此时应重新评估物体选择。然而，单样本t检验无法揭示两个或多个组之间是否存在差异。例如，在一项包含两组小鼠的实验中，若通过单样本t检验将各组与50%比较后发现，A组探索新物体的时间占比为60%（p = 0.049），而B组仅为59%（p = 0.051），则仅A组与50%的差异具有统计学意义（而B组无显著差异）。但由此得出“A组与B组之间存在显著差异”的结论是错误的。实际上，对A组和B组进行双样本t检验可能很容易显示这两组在统计学上并无显著区别。如果最终目标是比较两个或多个组的记忆表现，则必须对这些组之间进行直接的统计学比较，而不仅仅各自与外部标准值比较。该原则同样适用于比较训练阶段与OLT阶段中动物对移动物体的探索时间。在此情况下，若发现某一组在训练与OLT之间对移动物体的探索时间百分比存在显著差异，而另一组无此差异，这并不表明两组之间具有统计学上的显著差别。正确的做法是在每次试验中对各组进行事后组间比较，而不仅仅是在组内进行跨试验比较。

需要注意的是，单只小鼠的探索时间不能作为判断其记忆能力的依据。相反，在这些任务中，对物体位置或物体身份的记忆只能基于汇总数据，通过与另一组的汇总数据或固定的偶然水平（时间的偶然水平为50%，辨别指数的偶然水平为0）进行统计比较后得出结论。所需的样本量在很大程度上取决于特定操作的效应量以及行为的变异性，而这两者又取决于所使用的小鼠品系。年龄、性别和实验操作均会影响变异性。在图3A和3B所示的示例数据中，使用了n = 14只动物，配对t检验（α = 0.05）的效应量为0.68，检验效能为0.65。若希望该比较的检验效能达到0.8，则需要18只动物的样本量。

本讨论围绕 p 值和显著性阈值展开，因为这些是 OLT 和 NORT 数据最常报告的统计指标和分析方法，因此实验人员和审稿人可能对此较为熟悉。然而，这种对 p 值的依赖已被广泛批评为在统计学上存在缺陷26。尽管存在其他分析方法，且部分期刊已推荐使用27，但迄今为止，行为科学和生物医学领域尚未普遍采纳任何一种替代方法作为标准26。

总之，该方案能够以最低成本有效检测小鼠的记忆功能。文中包含了对该方案进行适当修改的建议，以确保在任何小型啮齿类动物模型中均能成功实施。将该方案应用于特定损伤或治疗干预模型，可揭示出有价值的生理功能相关性，从而补充所研究的细胞与分子机制。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）的R00 NS089938项目以及俄亥俄州立大学慢性脑损伤与发现主题计划的启动资金资助，资助对象为EDK。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
标志白色 - 9% 半透明和不透明彩色浇铸亚克力（Chemcast）TAP PlasticsNA1/4" x 15.75" x 15.75" 带铣边
标志白色 - 9% 半透明和不透明彩色浇铸亚克力（Chemcast）TAP PlasticsNA1/4" x 15.75" x 16.5" 带铣边
标志白色 - 9% 半透明和不透明彩色浇铸亚克力（Chemcast）TAP PlasticsNA1/4" x 16.5" x 16.5" 带铣边
TAP 亚克力胶水（1 品脱）TAP PlasticsNA
16 号针筒式胶水涂抹器TAP PlasticsNA
Debut 视频采集软件专业版NCH SoftwareNA
Stanley 英制/公制组合角尺Grainger6R171
Logitech Pro Stream C922x 网络摄像头CDW4429927
Belkin 16 英尺 USB 2.0 有源延长线CDW570691
Panduit Pan-Way LD 表面线槽（8 英尺）CDW300902
空间/环境线索可变NA
测试用物体可变NA
70% 乙醇可变NA
双面胶带可变NA

参考文献

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