单壁碳纳米管递送 MALAT1 反义寡核苷酸在体内抑制多发性骨髓瘤细胞生长

摘要

本文描述了一种单壁碳纳米管（SWCNT）偶联的MALAT1反义间隔子DNA寡核苷酸（SWCNT-anti-MALAT1）的合成方法，该复合物在体外和体内均表现出可靠的SWCNT递送效果以及anti-MALAT1的显著治疗作用。文中详细介绍了SWCNT-anti-MALAT1的合成、修饰、偶联及注射所采用的方法。

摘要

单壁碳纳米管（SWCNT）是一种新型纳米颗粒，已被用于将多种药物递送至细胞内，例如蛋白质、寡核苷酸和合成的小分子药物。SWCNT具有可调控的尺寸、较大的比表面积，并可通过其表面的不同修饰灵活地与药物结合，因此是一种理想的细胞内药物递送系统。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，不能翻译为蛋白质，但在生物学和病理生理过程中发挥重要作用。转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1）是一种高度保守的lncRNA。研究表明，MALAT1表达水平升高与多种癌症的不良预后相关，包括多发性骨髓瘤（MM）。我们已发现MALAT1可调控MM中的DNA修复和细胞死亡过程，因此可将MALAT1视为MM治疗的潜在靶点。然而，如何高效地将反义寡核苷酸递送至体内以抑制或敲低MALAT1表达仍是当前面临的问题。在本研究中，我们使用PEG-2000修饰SWCNT，并将抗MALAT1寡核苷酸偶联至其上，在体外测试该复合物的递送效果，随后将其通过静脉注射给予弥散性MM小鼠模型，观察到MM进展显著受到抑制，表明SWCNT是递送抗MALAT1缺口寡核苷酸DNA的理想载体。

引言

单壁碳纳米管（SWCNT）是一种新型纳米材料，可在体外¹和体内²以理想的耐受性和最低毒性，稳定高效地递送多种类型的药物，如蛋白质、小分子和核酸。经过功能化的SWCNT具有良好的生物相容性和水溶性，可作为小分子的载体，并携带这些分子穿透细胞膜^3,4,5。

长链非编码RNA（lncRNA）是一类从基因组转录为mRNA但不能翻译成蛋白质的RNA分子（>200 nt）。越来越多的证据表明，lncRNA参与基因表达的调控⁶，并涉及包括多发性骨髓瘤（MM）在内的大多数癌症的起始与进展过程^7,8,9。MALAT1是一种核富集型非编码转录本2（NEAT2），属于高度保守的lncRNA¹⁰。MALAT1最初在转移性非小细胞肺癌（NSCLC）中被发现¹¹，但随后发现其在多种肿瘤中均呈过表达状态^5,12,13；它是表达水平最高的lncRNA之一，并且与MM患者的不良预后相关^8,14。在病程危重的髓外多发性骨髓瘤患者中，MALAT1的表达水平显著高于仅诊断为MM的患者¹⁵。

在之前的一项研究中，我们已证实，通过在多发性骨髓瘤（MM）细胞中使用靶向MALAT1的缺口型DNA反义寡核苷酸（anti-MALAT1），anti-MALAT1寡核苷酸可显著诱导MM细胞发生DNA损伤和凋亡¹⁶。这种缺口型DNA由反义DNA序列组成，两端连接2'-OMe-RNA，一旦与靶标结合，可借助RNase H活性促进MALAT1的降解¹⁷。然而，反义寡核苷酸在体内的递送效率仍限制了其临床应用。

为了检测SWCNT递送抗MALAT1间隔寡核苷酸的效果，将抗MALAT1间隔寡核苷酸DNA与DSPE-PEG2000-胺功能化的SWCNT偶联。随后将SWCNT-抗MALAT1通过静脉注射注入多发性骨髓瘤（MM）弥散型小鼠模型；经过四次治疗后，观察到显著的抑制效果。

方案

所有涉及动物的实验均事先获得克利夫兰诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 功能化单壁碳纳米管的合成

1. 在20 mL玻璃闪烁瓶中，加入1 mg SWCNTs、5 mg DSPE-PEG2000-Amine和5 mL无菌无核酸酶水，充分振荡以完全溶解所有试剂。
2. 将闪烁瓶置于水浴超声仪中，在室温（RT）下以40 W功率超声处理1小时（20分钟×3次，每20分钟更换一次水以防止过热）。随后在24,000 × g 条件下离心6小时，收集上清液。该功能化SWCNT溶液可在4 °C保存2个月。
3. 取1.2步骤中的SWCNT溶液1 mL，加入100 kDa分子量截留值（MWCO）的离心过滤装置中，再加入4 mL无菌无核酸酶水。在室温下以4,000 × g 离心10分钟，以去除多余的DSPE-PEG2000-amine。重复加4 mL水并离心，共5次。每次离心后，滤膜上残留的SWCNT溶液将超过0.5 mL。
4. 最后一次洗涤后，使用紫外/可见光分光光度计在808 nm处测定滤膜中残留SWCNT溶液的浓度。最终浓度通常约为50 mg/L（根据Kam等人建立的方法计算¹⁸）。
   注意：确保在1.4步骤后，DSPE-PEG功能化的SWCNTs具有水溶性，并在数周内于不同生物溶液中保持稳定，无可见聚集现象。

2. 将两侧带有2'-O修饰RNA的抗MALAT1间隔序列DNA与功能化单壁碳纳米管（SWCNT）偶联

1. 将 0.5 mg Sulfo-LC-SPDP 加入 450 µL DSPE-PEG2000-胺基功能化的 SWCNT 中。加入 50 µL 10x PBS，然后在室温下孵育 2 小时。
2. 为去除多余的 Sulfo-LC-SPDP，将步骤 2.1 的反应液加入 100 kDa 截留分子量的离心过滤装置中，随后加入 4 mL 无核酸酶水。在室温下以 4,000 × g 离心 10 分钟。重复加入 4 mL 水及离心操作共 5 次。
3. 将 200 nM 巯基修饰的 anti-MALAT1-Cy3 gapmer DNA 加入 1.5 mL 商业 DTT 溶液中，在室温下孵育 90 分钟。按照制造商的说明，使用 NAP-5 柱纯化产物。用 500 µL 无菌无核酸酶的 1x PBS 洗脱 anti-MALAT1-Cy3。
   注意： 功能化 SWCNT 可在添加 DTT 的条件下储存，这可能裂解硫醇化 anti-MALAT1 gapmer DNA 储存期间形成的二硫键。在与 SWCNT 偶联前，可通过 NAP-5 柱去除所添加的 DTT。
4. 收集滤膜上残留的经 sulfo-LC-SPDP 处理的 DSPE-PEG2000-胺基 SWCNT 溶液，并用 500 µL anti-MALAT1-Cy3 溶液稀释。然后在 4 °C 下孵育 24 小时。偶联产物 SWCNT-anti-MALAT1 可在 4 °C 下保存 3 周。 按照相同步骤，可合成与随机反义寡核苷酸偶联的 SWCNT，作为 SWCNT 对照使用。

3. 尾静脉注射 SWCNT-Anti-MALAT1

1. 构建多发性骨髓瘤（MM）弥散性小鼠模型。
   1. 为获得最佳比较效果，将14只8周龄NOD.CB17-Prkdcscid/J小鼠随机分配至实验组或对照组（每组7只），并保持两组间性别比例一致。
   2. 清洁操作台，并用70%酒精进行消毒。
   3. 使用加热灯对小鼠进行加温，以促进尾静脉显现；使用尾部注射固定器妥善固定小鼠。
   4. 通过尾静脉向小鼠注射50 µL PBS中含5 x 10⁶ MM.1S-Luc-mCherry细胞，无需麻醉。注射后用酒精棉片按压注射部位30秒。标记已注射小鼠，并将其放回清洁的笼具中。
2. 在MM.1S细胞注射后的第7天开始治疗。
   1. 通过尾静脉向小鼠注射含SWCNT-anti-MALAT1的PBS溶液50 µL。对照组使用含SWCNT-control的PBS溶液。
   2. 注射后用酒精棉片按压注射部位30秒。
   3. 观察小鼠尾部局部出血情况及整体行为1分钟，随后将其放回清洁笼具中。在将笼具放回动物架之前，再次观察所有注射过的小鼠，以确保其耐受性良好。
3. 每隔7天重复注射一次，直至实验终止。
   1. 当小鼠整体健康状况恶化时终止实验：如出现拒食或拒饮、足部苍白、皮下出血、呼吸急促、活动减少、下肢瘫痪和/或腹部可触及肿块等情况时。

4. 疾病进展的评估

1. 在注射 MM.1S-Luc-mCherry 细胞后，每天评估小鼠的一般状态。若小鼠出现下肢瘫痪，需特别关注。
2. 在注射 SWCNT-anti-MALAT1 前，每周使用活体成像系统评估一次肿瘤生长情况。
   1. 用 1× PBS 配制新鲜的 15 mg/mL D-荧光素酶底物（D-Luciferin）。
   2. 使用异氟烷蒸发器对小鼠进行麻醉（诱导浓度为 3–5%，维持浓度为 1–3%，根据小鼠状态调整）。
   3. 成像前 5 分钟，每只小鼠腹腔注射 150 mg/kg 的 D-Luciferin；随后将小鼠置于俯卧位，使用光谱成像系统进行成像。
   4. 每 2 分钟采集一次小鼠的连续图像，直至荧光信号达到饱和。根据 D-Luciferin 的吸收/信号情况调整采集时间间隔。
3. 实验终点到达后，使用 CO₂ 处死小鼠。
4. 由于本实验为多发性骨髓瘤（MM）弥散模型，按以下步骤处理小鼠。
   1. 解剖前称量小鼠体重。
   2. 从心脏采集外周血，使用血细胞计数仪进行全血细胞计数（CBC）检测。白细胞和红细胞计数以及淋巴细胞比例为主要指标。
   3. 分离脾脏并称重。计算脾脏/体重比值；若比值>0.5%，视为脾脏肿大。
   4. 采集骨髓、脾脏、淋巴结、肾脏以及可见转移病灶的组织。
   5. 若小鼠出现下肢瘫痪，需采集脊柱组织。
   6. 从骨髓样本中提取 RNA 和蛋白质。
   7. 将所有剩余组织用福尔马林固定。
   8. 固定 24 小时后，将骨组织样本浸入 0.25 M EDTA 溶液（pH 8.0）中脱钙 5 天。
   9. 所有样本浸入 75% 乙醇中长期保存。
5. 比较两组小鼠在相同时间点的荧光素酶信号强度。记录两组中每只小鼠的处死日期，并使用软件绘制生存曲线。
   注意：所有操作步骤总结于图 1中。

结果

为了验证抗MALAT1间隔DNA在多发性骨髓瘤（MM）中的抑制作用，我们敲低了MALAT1的表达，并将其应用于H929和MM.1S细胞。48小时后，收集细胞以分析转染抗MALAT1间隔DNA或对照DNA后的敲低效率及细胞凋亡状态。qRT-PCR结果显示，抗MALAT1间隔DNA能有效降低H929和MM.1S细胞中MALAT1的表达水平（图2A）。通过流式细胞术检测细胞凋亡状态，结果表明MALAT1表达下调可显著诱导细胞凋亡（图2B）。

这些结果表明，抗MALAT1寡核苷酸在体外可有效抑制多发性骨髓瘤（MM）。然而，抗MALAT1寡核苷酸在体内仍需开发一种高效的递送方法或载体，这也是反义寡核苷酸在临床应用中的主要障碍；因此我们关注单壁碳纳米管（SWCNT）。SWCNT是...

讨论

已有证据表明，长链非编码RNA（lncRNA）参与调控多种癌症中的生理及病理生理过程，包括多发性骨髓瘤（MM）^7,8,9；它们具有作为癌症治疗靶点的潜力，可通过反义寡核苷酸实现靶向干预^20,21,22。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准多种反义寡核苷酸药物，包括用于巨细胞病毒性视网膜炎的fomivirsen²³、用于纯合子家族性高胆固醇血症的mipomersen²⁴、用于脊髓性肌萎缩症的nusinersen²⁵，以及用于杜氏肌营养不良症的eteplirsen²⁶。在本研究中，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
单壁碳纳米管（SWCNTs）	Millipore-Sigma	704113
DSPE-PEG2000-胺	Avanti Polar Lipids	880128
超声水浴仪	VWR	97043-992
4 mL 离心过滤器	Millipore-Sigma	Z740208-8EA
紫外/可见光分光光度计	Thermo Fisher Scientific	accuSkan GO UV/Vis 微孔板分光光度计	在 808 nm 处的消光系数为 0.0465 L/mg/cm
Sulfo-LC-SPDP	ProteoChem	c1118
DTT 溶液	Millipore-Sigma	43815
NAP-5 层析柱	GE Healthcare	17-0853-01
活体成像系统	PerkinElmer
NOD.CB17-Prkdcscid/J 小鼠	Charles River 实验室	250
流式细胞仪	Becton Dickinson
Lipofectamine	Invitrogen	11668019	Lipofectamine2000
胎牛血清（FBS）	Invitrogen	10437-028
RMPI-1640 培养基	Invitrogen	11875-093
MALAT1-QF：	由 IDT 公司合成		5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’
MALAT1-QR：	由 IDT 公司合成		5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’
GAPDH-QF：	由 IDT 公司合成		5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’
GAPDH-QR：	由 IDT 公司合成		5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’
使用 SYBR Green PCR 主混合液进行定量 PCR	Thermo Fisher Scientific	A25780
RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒	Thermo Fisher Scientific	K1621
抗 MALAT1	由 IDT 公司合成		5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’
细胞活力检测试剂盒	Promega Corporation	G7570	CellTiter-Glo 发光法细胞活力检测试剂盒
accuSkan GO UV/Vis 微孔板分光光度计	Thermo Fisher Scientific
离心过滤器	Millipore-Sigma	UFC910008
SPSS 软件	IBM	版本 24.0
D-荧光素	Millipore-Sigma	L9504