本文旨在为开发和使用VX2癌兔肝癌模型提供基础指导。
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本文内容
摘要
摘要
兔VX2肿瘤是一种在介入放射学领域常用于肝细胞癌（HCC）转化研究的动物模型。该模型采用一种未分化型鳞状细胞癌，可在供体兔的骨骼肌中稳定且可靠地传代培养，随后收获并异体移植至未经处理的受体兔肝脏中。移植后的肿瘤在受体兔肝脏内迅速生长，形成在血管造影中可识别的肿瘤，其特征为具有坏死核心，并被一层存活的高血管化包膜所包围。兔的解剖尺寸足够大，便于进行血管介入操作，从而适用于多种介入技术的应用与测试。尽管具有上述优势，目前仍缺乏系统性的技术资料作为研究人员使用该模型的明确参考。本文旨在为初学者和有经验的研究人员提供一份全面的可视化技术指南，涵盖兔VX2肿瘤模型的建立、生长、传代及血管造影应用等各个环节。
引言
兔VX2肿瘤模型自1935年建立以来，在实验肿瘤学中发挥了重要作用1,2。该肿瘤是一种病毒诱导的未分化鳞状细胞癌，具有高度血管化、生长迅速以及易于在骨骼肌中传代的特点3,4。尽管兔VX2肿瘤模型已被用于研究多种癌症5,6,7,8，但本文的重点是肝癌9。
本方法旨在建立一种可用于介入放射学领域转化研究的原发性肝癌（即肝细胞癌，HCC）模型。该模型可用于药代动力学研究、治疗学研究以及消融技术的测试10,11,12,13,14,15。
本文所述方法相较于其他同类模型（如大鼠、小鼠、土拨鼠等啮齿类动物模型，或灵长类等较大动物模型）具有多项优势16。其中主要优势之一是肿瘤生长迅速且稳定，研究人员可在首次后肢接种后一个月内建立活跃的肿瘤细胞系17。此外，该肿瘤具有清晰的超声可见性以及富血供的周边区域，因而既适用于经动脉局部区域治疗，也适用于消融疗法。最后但最为重要的是，兔的血管尺寸适宜，便于可行且技术上易于操作的血管介入器械应用18。
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方案
以下方案遵循伊利诺伊大学芝加哥分校规定的所有要求和指南。在实施前，已通过当地机构动物护理和使用委员会的审查和批准。
1. VX2 肿瘤后肢模型的建立
- 从美国国家癌症研究所癌症治疗诊断与治疗肿瘤/细胞系库获取 VX2 肿瘤细胞系。
注意：目前，订购目录可通过以下链接访问：https://dtp.cancer.gov/repositories/。 - 为准备用于注射的细胞悬液，将冻存的 VX2 样本和甲基纤维素培养基置于温水中，直至完全解冻。
- 用 5 mL 注射器吸取 0.5‒1 mL 解冻后的细胞悬液以及等体积的解冻甲基纤维素培养基。
注意：建议使用 21 或 22 G 针头吸取细胞悬液，使用较大口径针头吸取甲基纤维素培养基。将注射器置于冰上备用。
- 用 5 mL 注射器吸取 0.5‒1 mL 解冻后的细胞悬液以及等体积的解冻甲基纤维素培养基。
- 准备后肢肿瘤供体兔以接种细胞悬液，首先通过肌肉注射给予每千克体重 1 mg 的乙酰丙嗪和每千克体重 0.02 mg 的丁丙诺啡进行镇静。使用电动剃毛器剃除接种部位（后肢）的毛发，并用酒精或碘制剂清洁剃毛区域。
注意：可皮下给予每千克体重 0.2 mg 的美洛昔康以提供镇痛。兔毛较难剃除，建议研究者进行多次操作，首次重点清除大部分毛发，随后将剃毛器紧贴皮肤逆毛发生长方向进行精细处理。 - 将 16 G 针头连接至含有细胞悬液的 5 mL 注射器，向供体兔后肢肌肉腹侧注射 1 mL 细胞悬液，进针深度约为 1 cm。操作时务必保护沿股骨可触及沟槽内走行的坐骨神经。
注意：新鲜 VX2 细胞接种成功率为 88%，而冻存解冻后的 VX2 接种成功率仅为 33%19。
警告：VX2 肿瘤生长迅速。随着肿瘤进展，可能出现的副作用包括：呼吸频率增加、嗜睡、警觉性下降和/或行为改变（例如，异常攻击性）。因此，建议密切监测动物状态，并计划在接种后两周内完成肿瘤组织收获。
2. VX2 荷瘤兔后肢肿瘤生长与收获
注意：假设接种成功，在注射部位两周内应能触及到一个明显的（3‒4 cm）肿瘤结节。通常情况下，该结节约在1周时即可触及；但最好让肿瘤继续生长，以确保获得足够的组织样本。该结节通常质地较硬、坚实，并高于肌肉平面。如果
- 接种后2周触诊接种区域。若2周时未检测到肿瘤生长，则再次执行步骤1。参见图1。
注意：也可通过超声评估肿瘤的存在。尽管目前尚无研究评估使用冷冻保存株与新鲜保存株接种后肿瘤生长指标的差异，但我们的经验表明，冷冻保存株的肿瘤生长略慢，其可检测时间会晚于新鲜保存株。但无论采用何种方法，均应在2周时获得可收获的肿瘤。 - 准备后肢肿瘤供体以进行肿瘤收获。使用45 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪对兔进行麻醉。通过静脉（IV）注射超过390 mg/kg的戊巴比妥钠实施安乐死。
- 兔安乐死后，使用手术刀（刀片尺寸由研究人员根据需要选择）切除覆盖于肿瘤结节上的皮肤及皮下组织，开始收获肿瘤。参见图2。
- 在后肢肌肉内识别出肿瘤结节后，采用广泛弧形切缘整块切除肿瘤（en bloc）。具体操作为：切断肌肉近端和远端的肌腱附着点，然后沿下方骨骼边缘划开。将取出的标本切开，暴露肿瘤包膜及坏死核心。参见图3。
注意：VX2肿瘤具有高度坏死的核心。收获肿瘤时务必佩戴适当的眼部防护装备及其他个人防护设备，因为肿瘤包膜一旦受损，可能导致坏死碎片在高压下喷射。 - 使用钝性器械（例如镊子、止血钳）轻轻刮除坏死核心，以清洁肿瘤组织。此操作有助于更清晰地观察肿瘤包膜以及包膜与周围肌肉之间的过渡区域。参见图4。
- 从此样本中切取数块大小约为1‒2 mm3的肿瘤组织，并立即置于盛有室温无菌生理盐水的容器中保存。
注意：这些肿瘤样本将用于后续的肝内植入。 - 将剩余肿瘤组织放入无菌培养皿中，并用杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）浸润。若将该标本置于冰上保持低温，可在2‒3小时内继续处理使用。
3. 经剖腹手术进行肝肿瘤移植
- 准备受体兔以进行剖腹手术。使用45 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪进行诱导麻醉，随后进行气管插管，并根据需要以1%–3%异氟烷维持麻醉。当兔子进入麻醉状态后，使用电推剪剃除手术区域的毛发。清洁切口部位 使用碘伏刷洗液、70%乙醇溶液和碘伏溶液各重复洗涤三次，以无菌外科方式铺巾腹部。
- 使用#15刀片，从剑突开始沿腹中线向下作一小段垂直切口，切开兔的皮肤，以开始剖腹手术。剑突易于触诊，大小通常约相当于一枚美国便士硬币。见 图5.
- 翻转皮肤并识别 白线。这应是一条沿中线向下延伸的白色反光组织带。使用钝性解剖技术沿其路径分离 白线 暴露腹膜。参见 图6.
注意：腹膜很容易辨认，因为它直接覆盖在肠管表面，而肠管可随呼吸运动而移动。
注意：由于表面张力，腹膜 tends to 与下方肠管粘连。应使用钝性创伤法进行分离 白线 有助于降低刺穿下方肠管的风险。 - 暴露腹膜后，小心地切开腹膜以进入腹膜腔。此时可辨认出肝脏。为了更便于探查腹腔空间，可通过皮肤、肌肉和腹膜将正中切口向下延长1‒2 cm。
注意：可通过将弯止血钳的弯曲尖端朝向腹膜表面，小心地插入腹膜腔，从而安全、简便地延长正中切口。随后略微打开止血钳，并用刀片切开止血钳两臂之间的组织。 - 识别肝脏左叶，以选择肿瘤植入部位。左叶位于中叶的外下方，中叶则处于中线位置。
- 在尝试将肝脏从腹膜腔拉出之前，于切口下缘放置一块干燥的纱布。
注意：纱布将提供一个粘附表面，用于放置肝脏，防止其回缩至腹腔内。 - 使用无创镊子或用手指包裹湿纱布，小心地将肝脏左叶通过切口从腹腔中拉出，并放置在先前放置的干纱布上。参见 图7.
注意：肝包膜较为脆弱且易破裂。操作该器官时务必轻柔，以防止包膜出血、肝组织挫伤和/或继发性血性腹水。
注意：通常情况下，进入腹膜腔后肝脏会自然显露于视野中；然而，若兔的胃部膨胀，肝脏可能被推向 cranially 而无法看见。若出现此情况，可使用钝性探针轻轻抬起腹壁。在此情形下，由于表面张力作用，肝脏常会粘附于膈肌的腹侧表面，需用钝性探针小心分离肝脏，即可使其脱离。随后使用无创镊子将肝脏牵出。 - 此时，准备肿瘤组织以进行移植，并用一块湿纱布覆盖肝脏以保护。
- 选择1‒2 mm3 用于植入肝脏的在步骤2.6中获取的肿瘤组织块。参见 图8.
- 使用11号刀片，以45°角刺入肝组织，形成一个深约0.5 cm的囊袋，注意不要穿透肝包膜的背侧。刺入后将刀片保留在原位。参见 图9.
- 轻轻将刀片向腹侧抬起，在肝床中创建一个小的囊袋。用镊子夹取肿瘤组织，将其放入该囊袋中，然后取出刀片。
注意：可在插入肿瘤组织前取下刀片，但肝脏会出血，这可能遮蔽穿刺部位，导致难以辨认。
注意：务必尽量减少肿瘤与任何其他结构的接触，以防止意外的肿瘤种植。此外，将用于辅助植入的器械在使用后单独放置，也可避免此类情况发生。 - 此时，在肿瘤创腔上放置一块止血剂（如明胶海绵），以促进止血并防止肿瘤组织块脱出。
- 确认止血后，将肝脏还纳至腹腔内。
- 使用带圆锥形针的3-0聚对二氧环己酮缝线行单纯连续缝合关闭腹壁，再使用带切割针的4-0聚乙醇酸910缝线行连续皮下缝合关闭皮肤。
注意：缝合腹壁时，应小心避免缝线损伤大网膜或其他肠管结构。
注意：尽管该肿瘤至少需要 2 周时间才能在影像学上明确识别，但在生长 3 周时其直径已可达 1.5‒2 cm。需注意避免肝脏肿瘤生长超过 3.5‒4 周，因为此时肿瘤将形成外生性肿块，并在局部迅速扩散。
4. VX2 肿瘤悬液的制备
- 将一个40 µm的细胞筛置于50 mL锥形聚丙烯管管口。取步骤2.7中的肿瘤组织，使用#15刀片刮取肿瘤表面以收集有活力的肿瘤组织，并将刮取物放入细胞筛中。
- 用DMEM冲洗有活力的肿瘤刮取物使其通过细胞筛，随后将聚丙烯管在1600 rpm条件下离心8分钟。
- 离心完成后，移除上清液并弃去。然后按1:1的体积比向剩余的细胞团块中加入甲基纤维素。
- 按照步骤1.3‒1.4，将此悬浮液注射至一只后肢供体兔体内。将剩余的悬浮液分装至冻存管中，每管1 mL，置于液氮中冷冻保存以备后续使用。
5. VX2 肝脏肿瘤的血管造影应用
- 按照步骤 3.1 所述准备家兔。
- 触诊腹股沟处的股沟。确定股沟位置后，沿股沟做一条 2‒3 cm 的直线切口。见图 10。
- 采用钝性分离法，找到并分离包含股静脉、股动脉和神经的股血管束。见图 11。
- 再次使用钝性分离法，将股动脉从血管束中的其他结构分离出来，并将其置于手术刀柄上方进行游离。见图 12。
- 使用 3-French 穿刺套件，采用 Seldinger 技术经针穿刺进入血管，插入导丝后撤出穿刺针，再将 3-French 导管鞘送入血管。见图 13。
警告：推进 3-French 导管鞘时避免使用过大力量，否则可能导致股动脉横断。 - 在荧光透视引导下，使用导管、导丝和碘海醇对比剂，选择腹腔干（通常位于 T12 水平），随后经肝总动脉和肝固有动脉将导管推进至左肝动脉。
- 此时，通过导管给予选定的试剂。试剂给药完成后，撤出导管。
- 使用 3-0 丝线，在导管鞘插入点的近端和远端结扎股动脉。撤出导管鞘时，务必先收紧近端结扎线，以防止出血。
- 使用带切割针的 4-0 聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polyglactin 910）缝线，采用皮下缝合法关闭腹股沟切口。
- 实施标准术后护理并监测动物恢复情况。根据需要，采用标准技术实施安乐死和尸体解剖。
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结果
观察图1可以明显看出，兔的股四头肌出现肿大。此外，可见多个细小且界限清楚的结节，通常与肿瘤穿过筋膜生长相关。触诊时，注射侧肢体应较未注射侧肢体肿胀。若研究者需要更明确地确认肿瘤的存在，可采用超声成像来识别肌肉内嵌入的肿瘤。若未检测到肿瘤，应使用肿瘤细胞悬液对后肢进行再次注射。
为确认血管通路建立成功，可通过抽吸观察鞘管内是否有回血，如图13D所示。若血管通路建立失败，抽吸时鞘管内将抽出空气，或在拉动注射器活塞时遇到明显阻力。
对于肝肿瘤的生长，可通过两种方式确认成功增殖：血管造影法和尸检法。在血管造影中，肿瘤的识别可能立即显现，例如图14A所示，肿瘤直接从...
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讨论
VX2肿瘤实验方法的第一步关键是在供体兔的后肢成功建立肿瘤。有关此步骤的更多信息，请参见"代表性结果"部分的第一段。
下一步关键步骤是确保正确识别出有活力的肿瘤包膜。这不仅对于制备肿瘤悬液至关重要，而且对于选择和制备用于肝内植入的肿瘤组织块也具有重要意义。图4中标注了有活力的肿瘤组织与周围肌肉组织之间的分界线。若在制备悬液过程中刮取了错误的组织样本，后续的后肢传代将失败；若在肝内植入过程中发生此类错误，则肝脏内不会出现肿瘤生长，这一问题直到血管造影时才会显现。
在进行肝脏植入操作时，应特别注意接近肝脏左叶。通常情况下，当进入腹膜腔时若肝脏清晰可见，操作者实际观察到的往往是肝脏的内侧叶。将肿瘤植入肝脏内侧叶会对血管造影的应用带来若干问题。首先，内侧叶在解剖位置上邻近脊柱，在透视成像时内侧叶的肿瘤常会被脊柱遮挡，从而难以确认肿瘤位置并实施治疗。此外，胃十二指肠动脉通常更多地为内侧叶的血供血管提供血液供应，这会增加非靶向性肠道栓塞的风险，可能导致肠道缺血/梗死，甚至...
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披露
本报告所述工作由Guerbet LLC提供的研究资助支持。
致谢
我们谨向伊利诺伊大学芝加哥分校生物资源实验室的兽医工作人员表示感谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 甲基纤维素（MethoCult） | Stemcell Technologies | M3134 | |
| VX2 细胞系 | NCI | VX-2 | |
| 5 mL 注射器 | BD | 309646 | |
| 16 G 针头 | BD | 305197 | |
| 22 G 针头 | BD | 305155 | |
| 毛发剪刀 | Wahl | 41870-0438 | |
| 泡沫保温箱 | Mr. Box Online | 10 x 10 x 4 | |
| 乙酰丙嗪（Acepromazine） | Henry Schein | 003845 | |
| 布托啡诺（Buprenorphine） | Par | 42023-179-05 | |
| 美洛昔康（Meloxicam） | Henry Schein | 049755 | |
| 酒精棉片 | Covidien | 5033 | |
| 氯胺酮（Ketamine） | Henry Schein | 056344 | |
| 赛拉嗪（Xylazine） | Akorn | 59399-110-20 | |
| 戊巴比妥钠（Fatal-Plus） | Vortech | 9373 | |
| 无菌培养皿 | Thermo Fisher | 172931 | |
| DMEM 培养基 | Gibco | 11965092 | |
| 生理盐水 | Baxter | 2F7124 | |
| 15 号刀片 | Steris | 02-050-015 | |
| 手术刀柄 × 2 | Steris | 22-2381 | |
| 弯止血钳 | WPI | 501288 | |
| 无创镊 | Sklar | 52-5077 | |
| 纱布 | Medline | NON21430LF | |
| 11 号刀片 | Steris | 02-050-011 | |
| 明胶海绵（Surgicel） | Ethicon | 1951 | |
| 3-0 PDS / 圆锥形针 | Ethicon | Z305H | |
| 4-0 Vicryl / 切割针 | Ethicon | J392H | |
| 40 μm 滤网 | BD | 352340 | |
| 50 mL 离心管 | Thermo Fisher | 339652 | |
| 塑料移液管 | Thomas Scientific | HS206371B | |
| 离心机 | Sorvall | 75004240 | |
| 1.40 mL 管（内螺纹） | Micronic | MP32131-Z20 | |
| 3-F VSI Micro-HV 介入套件 | Vascular Solutions | 定制订单 (P15180391) | |
| .018 45° 角导丝 | Terumo | RG*GA1818SA | |
| Direxion bern 形状微导管 | Boston Scientific | M001195230 | |
| 欧乃派克（Omnipaque） | GE | Y510 |
参考文献
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重印与许可
