测量与解读完整果蝇头部组织的耗氧率

摘要

测量代谢率的变化对于理解多种疾病及衰老进程至关重要。本文介绍了一种测量整个头部耗氧量的新技术，该技术更接近生理状态，可能有助于发现可调节线粒体活性的新型药物。

摘要

受调控的代谢活性对于活细胞的正常功能至关重要。事实上，代谢活性的改变与癌症、糖尿病、神经退行性疾病以及衰老等多种疾病的进展存在因果关联。例如，在许多此类疾病中已观察到作为细胞代谢中心的线粒体活性发生变化。通常，线粒体的耗氧速率被视为反映其活性的可靠指标，部分研究中的测量基于分离的线粒体或细胞进行。然而，这些条件可能无法真实反映完整组织的复杂性。近期，我们开发出一种新方法，可对完整分离的果蝇头部进行耗氧速率的动态测量。利用该方法，我们记录到年轻果蝇头部整体段落的耗氧速率较低 与 老年果蝇。其次，我们发现赖氨酸去乙酰化酶抑制剂能快速改变整个头部的耗氧量。因此，我们的新技术可能有助于揭示各种药物的新特性，这些特性可能影响代谢速率。此外，我们的方法可以在更接近生理状态的实验条件下，增进对代谢行为的理解。

引言

受调控的代谢活动对于细胞存活和组织的正常功能至关重要。已有大量研究表明，代谢活动失调与多种疾病的发病及进展密切相关¹。例如，先前已有报道指出，在阿尔茨海默病及与年龄相关的记忆障碍等神经退行性疾病中，代谢活性降低^2,3。此外，线粒体功能障碍被认为在衰老过程中具有因果性作用^4,5。另一方面，癌细胞中则表现出较高的线粒体活性和代谢速率⁶，而使用线粒体抑制剂可降低肿瘤发生⁷。

衡量代谢活性的一个指标是线粒体的氧消耗率（OCR）。有趣的是，这类指标主要来源于分离的线粒体或细胞，因此文献中描述的大部分内容主要基于一种并不接近生理状态的检测方法。然而，该技术存在若干缺点。首先，线粒体分离方案可能会破坏其完整性⁸，这在比较从年轻个体分离的线粒体时可能是一个相关的假象 与 较老的组织⁹此外，该分离过程耗时较长，可能导致调控线粒体功能的相关蛋白质翻译后修饰的丢失。^9,10,11此外，已有研究表明，分离的线粒体并不能始终代表整个组织的代谢速率^12,13这种细胞生物学上的复杂性可以被理解为“整体大于其各部分之和”。 即， 线粒体在复杂细胞内部的代谢速率可能与其被分离后的代谢速率不同。

尽管细胞可能比分离的线粒体提供更佳的耗氧率（OCR）读数，但在完整组织背景下，细胞间的通讯可能会丢失。例如，在大脑中，神经元的代谢活性高度依赖于邻近胶质细胞的代谢活性¹⁴。因此，建立新的技术来研究完整组织或整个生物体中的耗氧率（OCR），可能有助于更深入地理解多种疾病的发生与进展。

近年来，一些新技术相继出现，以解决上述问题，并实现对完整组织、组织片段或活体生物的耗氧率（OCR）进行测量。例如，最近一项研究采用透化纤维法结合呼吸仪，成功测定了甲虫飞行肌的氧气消耗情况¹⁵。新型的微呼吸测定仪现已可用于胰岛细胞的耗氧率检测^16,17。因此，已有报道表明该技术可实现对完整线虫¹⁸和斑马鱼¹⁹的耗氧率测量。然而，在研究药物对耗氧率的影响时，消化屏障的存在可能带来一定挑战。值得注意的是，Neville 及其同事近期报道了一种新技术，可通过微孔板对单个黑腹果蝇幼虫脑组织进行耗氧率测定^20,21。

在本研究中，我们采用了一种类似的方法，以实现对完整、活体且不移动的黑腹果蝇（Drosophila）整体耗氧率（OCR）的测量²²。该技术还具有另一优势，即能够在整个组织段中直接评估各种药物对代谢活性的影响，而无需经过消化系统的屏障^13,22。例如，先前已有研究证明，直接注射赖氨酸去乙酰化酶抑制剂（KDACi）——一种被认为可改变大脑表观遗传机制的药物——能够促进记忆形成²³。然而，通过使用我们这一创新技术，我们发现KDAC抑制会迅速提高OCR，而这一效应本身可能对神经元活动具有促进作用。本实验方案提供了一种简便且新颖的方法，用于评估不同药物、基因操作或生理状态（如疾病、衰老）对完整头部背景下OCR的影响。

方案

1. 仪器准备

注意：本实验使用 Seahorse XF24 仪器配合“胰岛板”进行。该技术的操作包含不同周期的混匀、等待和检测步骤，并可在检测过程中向检测腔室添加物质。

1. 在实验开始前足够早地开启仪器，以确保有充足的时间达到设定温度并保持稳定。
2. 在软件设置（管理员模式）中，选择色谱柱校准的时长（此处选择20 min）和所需的温度。
   注意：尽管线粒体或哺乳动物组织的测量通常在 37 °C 下进行, 果蝇头部环境温度为25 °C，但已有在31 °C下测量结果的文献报道。我们采用31 °C，因为这是设备在室温条件下可设置的最低温度。若需达到25 °C或更低温度，可将仪器置于更低温的房间内，或置于11 °C环境中，如近期文献所报道。²¹.
3. 在软件中使用以下程序：3 分钟混合 – 2 分钟等待 – 2 分钟测量。根据实验设计，在选定的测量步骤后，从 A-D 端口添加注射步骤。
   1. 为进行质量检查并确定基础耗氧率（OCR），在注入第一种药物前，需等待至少三个测量周期。 通过 端口 A。有关该实验方案的详细时间线，请参见参考文献 Becker 等¹³.

2. 试剂盒制备

1. 在测试前一日（或至少提前4小时）对微孔板进行预校准。向每个孔中加入1.0 mL校准液（pH 7.4），将传感器微孔板置于培养板上方，并在37 °C、无CO₂条件下孵育过夜或最长72小时。若水合时间超过24小时，需使用封口膜防止蒸发。
2. 实验开始前，确保实验药物已充分溶解于培养基（新鲜培养基 + 2.5%葡萄糖）中。
3. 在目标温度下，测量并调节药物溶液的pH值，使其与对照溶剂的pH值一致，以避免加药时产生pH差异。
4. 将药物溶液移取至指定的加样孔。例如，向A孔加入77 μL，以在770 μL溶液中实现1:10的稀释倍数，随后向B孔加入85 μL。
5. 将微孔板装入仪器，开始校准程序。

3. 培养板制备

注意：强烈建议由两人同时进行平板的制备。两人共同完成一个平板的制备过程可能需要约45至60分钟。

1. 用 1 N HCl 将新配制的培养基加 2.5% 葡萄糖调节至所需 pH。确保 pH 不受温度变化的影响。
2. 准备一个冰盒，并将金属板放在冰上。
3. 打开胰岛培养板（24孔板）包装，将网片浸入盛有培养基的培养皿（92 mm × 16 mm）中。
4. 使用植入器（一种可将网片牢固置入孔中的小型器械）取一个网片，并将带有网片的植入器竖直放置在显微镜旁。在连接于植入器的网片上加一滴培养基。
5. 将果蝇（此处使用一周或四周龄的canton雄性果蝇）置于冰冷的金属板上以麻醉。
6. 用镊子夹住果蝇的腹部，在显微镜下将其浸入培养皿中的培养液内。
7. 使用另一对镊子，轻轻移除果蝇的头部。将其置于固定在插入器上的网膜中央，并确认头部浸没在培养基中。
8. 当网中有16个头部时，将其居中放置。在将头部放入孔中之前，先去除多余的液体，以防止头部丢失。
   注：使用16只果蝇头部，因为在方法建立过程中，该数量可在合理的酶标板制备时间内提供充分且稳定的数据。
9. 使用插入器将网置于孔中，确保头部被网压住。缓慢加入 700 μL 培养基 + 2.5% 葡萄糖（图1对每个孔重复此步骤。
   注意：建议每块板使用20个果蝇头部样本孔和4个用于背景校准的空孔。确保空孔中也放置载网，并加入700 μL缓冲液 + 2.5%葡萄糖。
10. 检查网膜下方的孔中是否有气泡 通过 显微镜。使用1 mL移液器轻轻吹打，以去除任何气泡。保持样本头部居中，以确保OCR读取的可靠性。
11. 将酶标板放入仪器中并开始检测。

4. 氧耗率（OCR）测量结果的分析

1. 在方案结束时，取下 cartridge。
2. 作为质量检查，观察端口填充物中是否存在任何可见残留物。如果头部不用于蛋白质提取，则丢弃 cartridge 和 plate（选项 1）。 例如， （参见选项2）。
3. 提取电子表格文件，并对每个孔的氧气和pH水平进行质量检查。确保背景孔无氧消耗率（OCR）信号，且氧气水平稳定。
   1. 使用一种用于数据分析的算法，其中部分算法可在相应软件中选择。OCR 值分析请使用 AKOS 算法² 如果在整个测量过程中（即第一次和最后一次记录点（= 子测量）之间）两个生物学样本的氧浓度范围相似，且最后一次记录点的氧浓度不低于95（mmHg）（在此氧浓度下，头部的耗氧率显著降低），（图2).
   2. 某些条件会导致样品产生快速的OCR，并可能在1期间显示较低的氧气水平^st 蜱虫和/或最后一次取食（缺氧）图3A）。在此情况下，应使用其他测量方法，例如 FIXED 算法。在缺氧条件下，由于溶液中氧气水平极低，耗氧率（OCR）显著降低，因此 AKOS 算法会产生误导性读数。
      注意：新型仪器缺少 FIXED 算法。因此，建议提取总氧含量，并绘制前 3–5 个时间点的单位时间速率曲线图3).

5. （选项2）头部节段的生化分析

1. 以测量生化物质（代谢物、蛋白质组， 等等。）头部片段的特性调整运行时间以满足需求；然而，可在任意时刻中止程序并取出培养板。
2. 平板取出后，使用未 sharpened 的镊子在网膜上打孔，由此移除网膜，使头部释放并漂浮。
3. 使用去尖的1 mL移液器将头部转移至小瓶中。
4. 迅速弃去缓冲液，将头部置于液氮中快速冷冻。将头部样品于 -80 °C 保存，以备后续分析。

结果

高质量OCR测量的记录依赖于将果蝇头部置于网的中央（图1）。这一点对于XF24仪器尤为重要，因为与较新型的XFe24仪器相比，其氧传感器检测点较小，而XFe24的传感器面积更大。如先前研究所示，在年轻果蝇中，头部居中可使OCR在连续至少20次测量中保持稳定¹³。

使用这些仪器的一个关键方面是进行正确的分析。建议在实验过程中检测氧气水平。每次2分钟的测量分为10个子测量（时间点）。一个含有16个健康头部的孔通常会显示出氧分压（pO₂）₂）为140-170（mmHg）作为第一个刻度。在第一个示例中，我们比较了年轻果蝇与中年果蝇的头部（图 2A 和 2B）。尽管中年头部的氧气水平下降得更快，但观察到的差异较小（图2A）。此外，两种条件下的氧浓度范围相似，从第一个时间点的165降至最后一个时间点的120。在此情况下，建议使用AKOS算法自动计算OCR（pmol/min）²，可可靠地反映年轻个体之间氧水平的下降 与 中年期头部（图2B值得注意的是，该仪器的分析程序会自动选择 AKOS 算法。

然而，根据我们的观察，自动使用AKOS算法可能会导致错误的、甚至是相反的OCR结果。在样品耗氧量极高并达到缺氧状态的条件下，可能产生此类伪影^13,22。例如，添加丁酸钠（SB，一种KDAC抑制剂）会短暂改变氧浓度的动态变化（图3A）。在对照组中，第一和最后一个时间点的氧浓度保持稳定；而在加入SB后，这两个时间点的氧浓度出现显著且短暂的下降（图3A）。SB本身不会改变背景孔中的氧浓度，这些孔中未加入头部组织（数据未显示）。该数据支持SB可增加耗氧量的观点。由于第一个时间点的采集存在延迟（测量阶段开始后12秒才记录第一个时间点），因此在SB处理的孔中，第一个数据点的氧浓度已经较低。因此，很难捕捉到加入该HDAC抑制剂后早期耗氧量的变化。此外，SB处理样品中的氧浓度在最后一个时间点采集时已降至极低水平（缺氧状态）。在缺氧状态下，头部组织在最后几个时间点的耗氧速率减慢（图3A）。由于AKOS计算方法考虑了所有时间点的数据而忽略了缺氧状态，因此会产生误导性的OCR结果。事实上，基于非归一化AKOS计算的OCR水平在注射端口A（Veh/SB）后（虚线处）几乎没有变化（图3B）。

基于AKOS将OCR水平归一化至注射前测量值，结果显示加样孔A注射前后OCR水平非常接近，不支持氧浓度发生变化的观点（图3A）。在此情况下，推荐使用更贴近OCR和氧浓度变化情况的FIXED算法（图3C）。因此，基于FIXED算法的归一化测量结果显示，SB处理后OCR升高（图3C）。

新仪器的一个缺点是缺少 FIXED 算法。因此，在使用高消耗性样品/处理的实验中，建议手动计算 OCR 测量值，并针对每次测量的前 3-5 个时间点计算氧气水平随时间的下降值。

图1。一个含有16只一周龄雄性果蝇头部的培养孔示例。 果蝇头部位于网膜下方，并悬浮于培养基中。请点击此处查看该图的放大版本。

图2。一周龄果蝇头部（年轻）与四周龄果蝇头部（中年）之间OCR测量值比较的代表性示例。 （A）显示了三次独立测量的氧气水平；每次2分钟的测量被细分为十个子测量（刻度）。（B）对（A）的定量分析。第一个和最后一个刻度的水平相似，尽管中年样本的水平略低。通过计算氧气水平下降斜率的定量值来生成OCR水平。如先前所述²²，中年果蝇的OCR比年轻果蝇高10%-15%。请点击此处查看该图的放大版本。

图3．丁酸钠（SB）对年轻果蝇头部耗氧率（OCR）影响的示例。 （A）添加15 mM SB后，七次测量记录的氧浓度变化。虚线表示从A端口注入药物（或对照溶剂）。值得注意的是，在对照组（蓝色）中，第1和第10个时间点的氧浓度保持稳定，而在SB处理样本（橙色）中，这些时间点的氧浓度在注射后短暂下降（持续六个测量点）。此外，在SB处理样本的后期时间点，氧浓度的下降幅度显著减小。每组n=3。（B）[左] 由AKOS算法计算的未归一化OCR水平。该计算错误地显示在A端口注入SB前后OCR水平相似；[右] 将OCR归一化至A端口注射前的测量值。（C）[左] 对（A）图采用“修正”算法计算的未归一化OCR。此处，OCR较好地反映了SB处理后果蝇头部耗氧量的短暂升高；[右] 将OCR归一化至A端口注射前的测量值。所有图表中的误差线表示标准误（S.E.M.）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

我们的新技术提供了一种全新的方法，用于在完整果蝇头部组织的背景下研究衰老和疾病中的代谢变化²²。该方法也可用于研究KDAC抑制剂丁酸钠对耗氧量的影响。正如我们所证实的，赖氨酸去乙酰化酶抑制剂（HDACs/KDACs）会引起OCR的变化。本质上，由于这类抑制剂的作用靶点通常并不定位于线粒体内（这些抑制剂不影响III类去乙酰化酶——Sirtuins）²⁴，因此此类药物只能在至少组织水平上进行检测。事实上，多种药物被直接注射到脑部，从而绕过消化系统可能引起的代谢、修饰或失活过程。因此，我们的技术为这类药物如何直接影响头部组织提供了新的见解。

有几个关键步骤。首先，如方案中所述，我们强烈建议在1小时内完成微孔板的制备，并由两人协作操作。根据我们的经验，及时制备能够获得更高质量和更稳定的耗氧率（OCR）测量结果。若耗时过长，耗氧量偏低的孔位出现频率会增加，且稳定的OCR持续时间也会缩短。其次，进行质量检查至关重要，需确保不同样本之间的实验条件尽可能一致（如pH值、氧气水平）。最后，一个关键步骤是选择正确的算法来分析样本。正如我们所展示的，对于高耗氧速率的样本，系统默认的AKOS算法可能产生误导性甚至相反的计算结果¹³。因此，我们强调必须检查氧气水平的原始数据，并对所得的OCR结果进行比较验证。

目前，该技术存在一些局限性。在室温下，仪器温度会升至31 °C （这是仪器处于室温时的最低测量温度），这可能对果蝇头部造成热应激状态²⁵。然而，这一问题可通过将仪器置于低温房间内加以克服，从而实现在25 °C 条件下进行测量，避免果蝇头部可能遭受的热应激。最近有报道称，将仪器放置在11 °C环境中，即可实现果蝇在25 °C条件下的OCR记录²¹。尽管如此，果蝇头部的分离操作仍应在室温下进行。此外，温度波动会影响pH变化的控制，因此强烈建议采用相似的实验设置来检测生理条件或药物对OCR的影响。另外，非线粒体依赖性机制在耗氧中的贡献尚未明确²⁶。通过使用对果蝇头部有效的多种呼吸抑制剂，将有可能确定此类非线粒体耗氧速率。

值得注意的是，多种哺乳动物疾病均表现出能量代谢的改变。其中包括以代谢降低为特征的疾病（如阿尔茨海默病）和以代谢重编程为特征的疾病（如癌症）。有趣的是，赖氨酸去乙酰化酶（KDAC）抑制剂被用于阿尔茨海默病和癌症的治疗²⁷。尽管KDAC抑制剂发挥治疗作用的具体机制尚不明确，但本技术所得数据支持一种新观点，即此类抑制剂可能调节代谢过程。

总之，该方法可用于测量整体耗氧速率，具有重要价值 体内 更准确地显示药物对整体代谢的影响，而这些影响在分离线粒体的实验方案中可能被忽略¹²例如，利用该方法获得的结果，而非以往技术，揭示了KDAC处理后与年龄相关的代谢灵活性下降的新机制。尽管仍需进一步研究以优化果蝇头部的实验条件，但本技术与适当分析方法的结合，有望进一步阐明活体组织背景下线粒体活性的调控机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8644	D-(+)-葡萄糖溶液，100 g/L，溶于H2O，经无菌过滤
XF检测培养基	Agilent	103575-100	Seahorse XF DMEM培养基，pH 7.4
丁酸钠	Merck	817500	溶于XF检测缓冲液中
Seahorse XF24/e24分析仪	Agilent
XF24/e24细胞外代谢检测试剂盒	Agilent	100850-001	试剂盒
XF24/e24胰岛捕获微孔板	Agilent	101122-100	微孔板
Seahorse捕获筛插入工具	Agilent	101135-10	插入器
培养皿	Sarstedt	821,472	培养皿 92 x 16 mm