本文介绍了一种使用穿刺针和活检针工具进行牛乳腺组织活检的方法。所获取的组织可用于细胞培养，或用于评估乳腺的生理学和代谢状况，包括基因表达、蛋白质表达、蛋白质修饰、免疫组织化学以及代谢物浓度分析。
本文内容
摘要
摘要
牛乳腺组织活检使研究人员能够采集组织样本，用于研究细胞生物学，包括基因表达、组织学分析、信号通路以及蛋白质翻译。本文描述了两种牛乳腺（MG）活检技术。实验对象为三头健康的荷斯坦奶牛。在进行活检前，奶牛先被挤奶，随后固定于牛用保定架中。在活检前15至20分钟，通过颈静脉内注射（IV）给予镇痛药（氟尼辛葡甲胺，每公斤体重1.1至2.2 mg）。为实现站立镇静，在操作前5至10分钟通过尾椎血管注射盐酸赛拉嗪（每公斤体重0.01至0.05 mg）。待奶牛充分镇静后，对活检部位进行无菌准备，并通过皮下注射6 mL 2%盐酸利多卡因实施局部麻醉。采用无菌操作技术，使用10号手术刀做一2至3 cm的垂直切口。使用组织芯活检和针式活检工具。组织芯活检工具连接无绳电钻，通过顺时针钻动动作经切口插入乳腺组织。针式活检工具则手动插入切口部位。操作完成后，助手立即使用无菌毛巾对切口部位施加压力，持续20至25分钟，以实现止血。使用不锈钢外科缝合钉闭合皮肤切口，并于术后第10天拆除缝合钉。组织芯活检和针式活检的主要优势在于，这两种方法均为微创操作，可在健康奶牛中安全实施。活检后奶牛的产奶量未受影响。这些操作恢复时间短，并发症风险较低。可能存在的具体局限性包括活检后出血以及活检部位感染。这些技术的应用包括为临床诊断和研究目的采集组织样本，例如原代细胞培养。
引言
活检是一种从受试者体内获取组织核心样本的医疗或科研操作。该技术具有微创性，被广泛应用，可作为安乐死的替代方法1，用于分析组织对治疗或其他关注因素的反应。在奶牛研究中，获取乳腺组织样本至关重要，可用于研究基因和蛋白质表达、组织学、细胞器结构、信号通路以及代谢过程在管理或环境变化下的响应。此外，乳腺组织还用于诊断和研究某些传染性疾病，例如由细菌感染引起的牛乳腺炎2。
牛的乳房包含四个独立的腺体，每个腺体具有一个独立的泌乳系统， collectively 称为实质组织（parenchyma）。乳腺实质中含有腺泡、导管和结缔组织。腺泡是显微镜下可见的微小球形中空结构，其内表面（腔面）由上皮细胞构成，外表面（基底面）则由特化的肌上皮细胞组成。腺泡负责乳汁的合成与分泌。实质中的纤维性结缔组织可将一群腺泡与其他腺泡群分隔开来，每一组称为一个小叶（lobule）3。多种因素可影响乳腺（MG）的发育与功能，包括动物生理状态、营养、管理、遗传及环境因素4。乳房炎也是严重影响乳腺功能和乳品质量的关键因素5。乳房炎病原体释放的毒素可导致腺泡损伤并诱发坏死，从而引起乳腺组织的生物化学和组织学变化6。因此，乳腺中各个腺泡或小叶的组织学特征和代谢过程可能存在显著差异。因此，获取能够代表整个乳腺组织的活检样本尤为重要。过小的活检样本可能仅包含单个小叶或单个腺泡，从而限制所获得的科学或诊断信息。在科研工作中需认识到，乳腺活检仅能提供组织特征的“快照”式信息，若缺乏对整个乳腺组织质量的估算，则无法充分表征乳腺的整体功能。
在过去30年中，已开发出多种用于人类的活检工具。目前，这些器械的改良版本也可用于动物。对于奶牛，已采用多种技术获取乳腺组织样本，包括手术切除（钝性分离）7、活检针1,8以及穿刺活检器械9,10。因此，泌乳奶牛的乳腺活检技术已从1992年需要卧位镇静并采用电凝止血进行手术解剖的方法7，发展为目前在站立镇静状态下进行穿刺活检9,10,11,12。手术活检是一种侵入性方法，可能费用较高，并发症发生率也较高，如血肿、伤口问题和肿瘤扩散13。目前，穿刺活检和针吸活检（也称为tru-cut活检）已被广泛采用作为手术活检的替代方法。与手术活检相比，穿刺活检和针吸活检的优点包括：操作属于微创；严重并发症罕见；无需全身麻醉；操作相对快速；恢复时间短；对乳房健康影响极小，对产奶量和乳成分仅有短期影响8,9,10；且成本低于手术活检13。
1996年描述的一种核心活检方法采用无菌不锈钢套管，配有可拆卸的可回缩刀片，在未使用全身麻醉的情况下从牛乳腺中取出具有代表性的组织样本9,10,11,12在操作过程中，将仪器连接至无线钻机，以产生低速旋转运动，当工具推进至组织中时可整齐地切割出组织核心。其优势在于可获得较大的组织样本（70 mm × 4 mm 直径，约 0.75 至 1 g）。 9一项近期研究10 显示，V. C. Farr 描述的活检程序等9 可用于对泌乳奶牛进行多次乳腺组织采集，且不会对其生产性能和乳房健康产生不利影响。最近，一项研究14 在奶牛中进行了研究，以评估使用较大套管（长31 cm，外径9.5 mm，内径8 mm）对乳腺组织进行重复活检的效果，该方法通过向内部不锈钢套管施加负压来收集组织样本。该方法结合使用了镇静剂（赛拉嗪）和局部麻醉（2%盐酸利多卡因）。
穿刺活检是采集乳腺组织的另一种技术，已有若干研究采用该方法。其中一项研究1在操作过程中使用了镇静剂（地托咪定）和局部麻醉剂（1%利多卡因）。活检后，奶牛接受了预防性抗生素治疗。在挤奶前后均对手工按摩乳腺。活检后最多观察到乳汁中带血持续达84小时。乳汁的产量和成分在短时间内受到影响。最近，有研究使用活检针在奶牛中重复进行乳腺活检8。研究人员对动物施用了镇静剂（1%乙酰丙嗪，肌内注射）和局部麻醉（2%盐酸利多卡因，皮下注射）。动物在操作前后均未接受乳房内给药或抗生素治疗，术后期间活检部位未见感染迹象。该研究表明，使用穿刺针进行重复的牛乳腺活检对奶牛的产奶量和乳房健康仅有轻微的负面影响。总体而言，穿刺活检似乎比组织芯活检器械更具微创性。然而，如前所述，活检技术的关键在于必须获取具有代表性的乳腺组织样本。穿刺活检的局限性在于所获得的牛乳腺组织量较少（约20至25 mg）8,15。
几乎所有研究均采用α-2受体激动剂镇静联合局部麻醉的方法8,9,10，无论活检采用细针还是较大的穿刺针。在牛的乳腺组织中，大多数神经末梢分布于皮肤。实质组织的神经支配主要通过牵张感受器，仅有稀疏的A型神经纤维用于感知锐性手术疼痛。因此，乳腺组织手术操作引起的疼痛生理机制主要来自皮肤及皮下组织3，而非实质等深层组织。因此，在进行活检操作时，仅需对皮肤和皮下组织实施局部麻醉，因为将局部麻醉药浸润至深层组织并不能显著减轻手术疼痛。在完成适当的活检区域准备后，动物的不适感主要来源于保定。
采集较大的组织核心样本可能会增加血肿形成的风险，并提高乳腺实质内感染的可能性。因此，围手术期方案通常包括给予肠外抗生素7，尽管这一做法并非普遍适用8。实现止血也是降低奶牛发病率的重要因素。在前述使用大号组织核心活检器械的研究中14，活检部位接受了手动按压，并使用奶牛专用胸罩对伤口进行冰敷，持续至少2小时。尽管采集了大量组织，但仅观察到采食量和产奶量轻微下降，且该操作每三周重复一次，未对奶牛健康产生不良影响。
对奶牛进行乳腺活检的研究人员需要考虑所获得活检样本的诊断或分析质量、操作的简便性以及奶牛的发病率。准确且经过预先规划的外科技术对于实现这些目标至关重要。迄今为止，有关乳腺活检的研究主要集中于描述活检结果，而非活检技术本身，而针对泌乳期奶牛的描述往往缺乏足够的细节以供重复操作。因此，本研究的目的是详细描述针芯活检和较大组织核心活检的技术步骤，以便能够安全、人道地重复实施牛乳腺活检。
方案
所有所述方法均经弗吉尼亚理工学院动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 人员
- 至少配备两名具有外科手术和奶牛操作经验的助手。
- 在对活体动物实施本方案相关操作之前，应尽可能使用尸体材料对所有助手进行至少三次培训。
注意：培训应由先前已接受过培训并已掌握该技术的操作人员进行指导。 - 现场应配备大型动物兽医，负责药物给药，并在操作过程中出现紧急情况时提供应急治疗。可能出现的紧急情况包括但不限于：出血、α-2受体激动剂过量及肺水肿、食糜反流与误吸、疼痛以及动物抗拒而需进一步镇静。
2. 外科手术器械、耗材和设施的准备
- 清点并采购所有设备和耗材（参见材料表）。
- 清洗并高压灭菌手术巾、活检器械、手术刀柄、手术毛巾和镊子。
- 准备一个尺寸合适的固定架和头部限位装置，用于固定奶牛。
- 在固定架附近设置一个工作台，建立操作空间。
- 确保工作区域清洁，并尽量减少奶牛穿行。
- 在工作区域内合理摆放设备和耗材，以便于取用。
- 工作空间内应具备充足的照明。
3. 动物的准备
- 在预定进行活检的前一天，清洗并刷洗动物，特别是乳房部位，以清除粪便和污物。
- 遵循安全且人道的牛只保定操作规程。
- 在活检前预先并于活检时再次评估动物的健康状况、体况及行为表现。
注意：最低限度的检查应包括体温、脉搏和呼吸频率，并检查拟手术部位或其他区域是否存在皮炎或细菌感染迹象。从每个乳区采集乳样，检测是否存在乳腺炎。 - 仅使用健康的奶牛。
- 将奶牛完全挤净乳汁。
- 将动物移入固定保定栏，最好在挤奶后2小时内进行，以尽量减少腺体内的乳汁残留。
- 使用头部保定装置固定动物。
4. 镇痛与镇静
- 在牛的头部佩戴绳索鼻圈，以防止其前后移动。
- 将动物头部拉向一侧，并使用快速释放结将绳索系在保定架上，以固定头部位置。
- 用70%异丙醇棉片清洁注射部位，并在活检前15–20分钟通过颈静脉静脉注射氟尼辛葡甲胺（1.1至2.2 mg/kg体重）。
注意：在某些实验方案中，若非甾体抗炎药物不会影响研究结果，可在活检后给予此类药物。- 定位颈静脉。
- 在颈静脉沟基部施加压力，使颈静脉隆起。
- 检查注射器内是否含有气泡。
- 将针头插入隆起的颈静脉，抽取0.5 mL血液入注射器并混匀内容物，重复两次。若注射器中未见回血，需重新调整针头位置。若确认针头位于静脉内，则注入药液。
- 轻柔拔出针头。
- 在注射部位用纱布轻压，防止出血。
- 在活检前约5–10分钟通过尾静脉静脉注射盐酸赛拉嗪（0.01至0.05 mg/kg体重），以确保有足够时间达到镇静效果。
警告：检查动物是否出现肺水肿症状。肺水肿的临床表现包括呼吸困难、严重呼吸急促、呼吸费力、咳嗽、泡沫状痰液以及舌头发紫。若观察到肺水肿症状，建议使用托拉唑啉（2至4 mg/kg体重）逆转赛拉嗪的作用。- 抬起尾巴，用70%异丙醇棉片清洁注射部位。
- 检查注射器内是否含有气泡。
- 将针头插入尾部血管，抽取0.2 mL血液入注射器并混匀内容物，以确认针头位于血管内。若确认针头在血管内，则注入注射器内容物。
- 轻柔拔出针头。
- 在注射部位用纱布轻压。
5. 活检部位的准备
- 请助手在操作过程中将尾巴绑起。
- 在乳房上选择活检部位（通常选择上部区域，以尽量减少结缔组织的采集，并避免刺入腺囊，图1），并清除所选活检部位上的污物或粪便。
图1．牛乳房图像，显示活检部位。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 仔细观察并触诊皮肤，特别注意识别皮下较大的血管，以便在活检过程中避开这些血管。
- 剪除活检部位周围 15 cm × 15 cm 区域的毛发。
- 使用聚维酮碘（含有效碘 0.75%）或葡萄糖酸氯己定擦洗剂对活检区域进行准备。与 70% 异丙醇交替使用至少三次，以清除所有可见和不可见的碎屑。采用由内向外的环形方式涂抹无菌擦洗液和异丙醇。确保消毒擦洗液与皮肤接触时间不少于 5 分钟。
- 使用带有 18 G 针头的蝶形输液套件，在切口部位皮下注射 6 mL 2% 盐酸利多卡因，以形成阻滞线。切勿刺入深层组织。
注：利多卡因的剂量因人而异，通常为 3 至 8 mL。 - 让局部麻醉药扩散 3 至 5 分钟。在切开前再次重复擦洗液和酒精消毒步骤。等待期间，准备好活检器械。
6. 活检操作步骤
- 处理活检器械和进行切口时，应采用无菌技术。
- 洗手以去除所有可见污染物，并佩戴无菌外科手套。
- 按使用顺序将手术器械放置于无菌区域。准备10号手术刀、无菌纱布、组装好的活检器械以及用于止血的无菌毛巾。
注意：请遵循步骤1进行穿刺活检，或遵循步骤2进行针吸活检。
图 2。V. C. Farr 等人所述核心活检工具的组装与设置示意图9。比例尺为 1 cm。请点击此处查看该图的放大版本。
- 穿刺活检器械（Farr 等人9）
- 使用无菌手套组装穿刺活检器械（图 2）。
- 将 7 个无菌部件放置在无菌布巾上（图 2A）。
- 将刀片（部件 1）插入部件 2 的对接系统中（图 2B）。
注意：切勿将手指直接置于刀片运动路径中。 - 将部件 3 放置在部件 2 的上方（图 2C），确保对接站能够对齐。
注：观察部件 4 内壁中的对接系统（图 2D）。 - 将刀片（部件 1）的末端边缘卡入部件 4 的对接系统中（图 2D）。
- 向前推动部件 4，观察其是否紧邻部件 3（图 2E）。
- 将部件 5 插入装置（刀片 + 部件 2）中（图 2F）。
- 确保对接站已对齐（图 2G）。
- 将部件 6 插入部件 2 的顶部（刀片的对侧）（图 2H）
- 确保对接站已对齐（图 2H）。
- 将锁定螺钉（部件 7）插入对接站中（图 2I）。
- 向前推动部件 3（黑色）以覆盖锁定螺钉。
注意：切勿将手指置于刀片出口处。 - 向前推动部件 4 以激活工具，并观察刀片是否伸出工具外部。
- 向后拉回部件 4，使刀片缩回工具内（准备使用）。
注：仅当工具已穿透至目标组织深度时，才应激活刀片。
- 确保奶牛已充分镇静，且活检部位已充分麻醉。轻捏皮肤以确认无反应。
- 使用 10 号手术刀从近端向远端在皮肤及皮下组织上做一条 2 至 3 cm 的垂直切口。
- 使用无菌技术将活检器械连接至无绳电钻。
- 将电钻抵住活检工具，并检查工具是否牢固连接至电钻。
- 在整个操作过程中，由专人抬起尾巴以确保充分固定。
- 以顺时针方向和低速启动电钻。
注：电钻本身并非无菌，操作者在使用电钻时也不再保持无菌状态。 - 在电钻旋转的同时，将整个活检工具（约 7.5 cm）通过切口推进至乳房内。
- 关闭电钻，并手动推出工具的部件 4。
- 再次以顺时针方向和低速启动电钻。
- 将含有组织芯的器械从乳房中取出。
- 立即使用无菌毛巾对伤口施加强力压迫至少 20 分钟。
注：应由助手用拳头进行压迫，以确保压力足够。 - 使用镊子从活检工具中取出组织。
- 将样本保存于 1× 磷酸盐缓冲液中，并评估组织量。
- 活检后每 10 分钟测量一次奶牛的生命体征，持续至少 30 分钟。
- 在对活检部位压迫 20 分钟后检查是否出血。若仍有血液滴出，应继续压迫 5 至 10 分钟。
- 在所有出血停止后，以 5 mm 间隔使用不锈钢钉皮钉闭合切口。使用 5 至 8 枚钉皮钉。
- 在活检区域喷洒喷雾型敷料。
- 操作后观察动物 50 分钟。
- 使用无菌手套组装穿刺活检器械（图 2）。
- 针式活检器械
- 按照设备制造商的说明进行操作。
- 使用无菌技术从包装中取出活检针。
- 若发现针头有任何损坏，应立即丢弃。
- 将针头连接至设备。
- 关闭盖子并扣动装置。
- 确保奶牛已充分镇静，且活检部位已充分麻醉。轻捏皮肤以确认无反应。
- 使用 10 号手术刀从近端向远端在皮肤及皮下组织上做一条 1 至 2 cm 的垂直切口。
注：针式活检器械所需的切口可比穿刺活检器械更小（1–2 cm）。 - 将活检针插入切口部位（距皮肤约 10 至 13 cm）。
- 激活活检针装置以采集组织。
- 将针头从乳房中取出。
- 立即使用无菌毛巾对伤口施加强力压迫至少 20 分钟。
- 使用镊子从活检针中取出组织。
- 将样本保存于 1× 磷酸盐缓冲液中，并评估组织量。
- 活检后每 10 分钟测量一次生命体征，持续至少 30 分钟。
- 在对活检部位压迫 20 分钟后检查是否出血。
- 在所有出血停止后，使用不锈钢钉皮钉闭合切口。
- 在活检区域喷洒喷雾型敷料。
- 操作后观察动物 50 分钟。
7. 活检后动物护理
- 记录所有给予动物的药物。
注：在操作后 36 小时内所产的牛奶应予以丢弃；肉类的停药期为 4 天。牛奶和肉类的停药期可能因国家或司法管辖区以及所用药物的不同而有所差异。请查阅当地的法规和规定。 - 在活检后 7 至 10 天内检查牛奶中是否存在血液。
- 在后续挤奶过程中手动挤出活检乳区的血凝块，并确保完全排空乳汁。
注：操作后 1 至 3 次挤奶期间，活检乳区出现血凝块属于正常现象。活检后 1 至 6 天内可能观察到乳汁中带血。 - 观察产奶量，若条件允许，记录个体每日采食量，直至拆除外科缝钉。
- 在拆除外科缝钉前，每天两次监测动物的体温、呼吸频率、心率及精神状态。
- 在拆除外科缝钉前，每天两次检查活检部位是否出现肿胀、压痛或渗出迹象。若发现上述情况，应咨询兽医。
注：保持活检部位清洁，并根据需要每 1 至 3 天重新喷洒一次喷雾式敷料。 - 根据伤口愈合情况，在活检后 10 至 14 天拆除切口处的缝钉。
- 若观察到任何局部或全身感染的迹象，应咨询兽医。
结果
在本实验方案中，组织核心活检技术获得的组织样本量为200至600 mg，而穿刺针活检每次获得的样本量为10至30 mg。手术后对动物每日观察两次，持续10天。手术过程及术后均未出现并发症，奶牛的各项生命体征均保持在正常范围内（平均呼吸频率 = 31.4 ± 7.04（标准差）次/分钟，平均心率 = 75.9 ± 8.9 次/分钟，平均直肠温度 = 38.2 ± 0.68 °C，图3）。
在活检部位施加手动压力以实现止血（约25分钟）后，开放性伤口出血极少（图4）。术后期间，奶牛继续自由采食相同的饲料，并饲养于相同的圈舍环境中。动物活检部位未出现感染迹象；无疼痛、出血、肿胀、渗液或体温升高等表现（图5）。伤口在活检后8至10天内愈合（图5C）。
一例动物在术后第8天因伤口摩擦出现轻微皮肤刺激。对该奶牛的处理方法为使用聚维酮碘溶液和70%异丙醇清洁活检部位。移除不锈钢缝钉以促进引流，并在活检部位每天两次涂抹1%聚维酮碘软膏，持续2至3天。涂抹聚维酮碘软膏2天后，皮肤刺激症状消失，伤口愈合且未出现进一步并发症。
在机器挤奶前，通过手动挤奶的方式从被活检的乳区清除血凝块。在本实验方案中，观察了活检后最多三次挤奶（约36小时）期间牛奶中是否存在血凝块。活检后最多48小时内观察到牛奶中有血液污染。在核心活检与针芯活检之间，未观察到牛奶中血液量的明显差异。动物在操作后未出现乳产量显著下降（图6）。平均乳成分含量为4.37%脂肪、3.34%蛋白质和4.64%乳糖。平均乳体细胞计数（SCC）低于200,000个细胞/mL。
所获得的MG组织可用于不同的研究目的，例如原代细胞培养（图7）。
图3。 牛乳腺活检后动物健康指标的评估。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4。对活检区域施加手动压力以实现止血后，活检部位的外观。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5活检部位照片 (A) 活检部位术后3天. (B) 活检部位术后6天. (C) 操作后10天的活检部位，显示伤口已充分愈合。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6．奶牛乳腺活检前后每日产奶量（n = 3 头奶牛）。 线性模型估计，在活检前10天，动物每日产奶量为23.35 kg。从活检前10天到活检后10天，产奶量未发生显著变化（P > 0.05），尽管观察到轻微上升趋势（每过一天产奶量增加0.0005 kg/d，从活检前10天开始计算）。本实验共使用3头动物；其中1头动物接受了两次活检（动物1：左侧乳房进行穿刺芯活检，右侧乳房进行针吸活检），另外2头动物各接受一次活检（动物2和动物3：仅在右侧乳房进行穿刺芯活检或针吸活检）。请点击此处查看该图的放大版本。
图7．原代牛乳腺上皮细胞培养的代表性图像。 比例尺为100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本方案中描述了组织芯和穿刺活检方法9,16。在进行两种活检操作前，均需对动物健康状况及乳腺炎发生率进行详细评估14。出于研究目的，应避免在具有明显炎症或感染性疾病体征的动物身上实施该技术，以降低活检过程中及术后并发症的风险。所有活检器械和设备均应保持清洁、消毒并灭菌，以防止活检部位受到污染。在操作前，有必要尽量减少手术部位感染（SSI）。通常，SSI 与动物发病率升高、生产性能下降以及奶牛养殖成本增加相关。既往研究已报道了若干预防因活检导致 SSI 的方法，包括剪除切口周围毛发、清洗活检区域以去除污染物9,14，以及使用抗菌剂（70% 酒精、碘伏外科洗手液9、2% 醋酸氯己定溶液14、10% 聚维酮碘8）进行皮肤准备。在部分研究中，曾在活检期间7或活检后立即9给予抗生素；然而，本研究未采用抗生素预防措施，且未观察到活检部位出现感染。为防止活检伤口污染，应固定动物尾部，避免其接触活检部位，直至喷雾式敷料已完全覆盖。在本方案中，活检后约 10 至 14 天拆除缝合钉。
在进行核心活检之前，正确安装工具并将其连接到钻机至关重要；应选择较慢的旋转速度，设定为正向旋转，并且不要使用钻机的反转模式。操作过程中，重要的是在切口两侧施加指压，以保持皮肤边缘分开，并确保切口足够长，使工具进入时不会接触皮肤或结缔组织。如果未执行此操作，在核心活检器械旋转过程中可能会对切口边缘产生拖拽，导致额外的皮肤组织损伤，从而增加感染风险，并可能延迟伤口愈合。本方案中描述的活检操作均由经认证的大型动物外科医生完成，操作均取得成功（图5）。与手术切除方法相比，这两种技术相对简单且操作快速。
奶牛进行乳腺活检后，活检部位出血较为常见8,9,10,14。在本方案中，观察到的出血量极少（图4），这可能是由于在操作结束后立即对伤口施加了充分（较强）的压力所致。至少需要持续施加强压20分钟，在某些情况下可能需要超过30分钟。如果在对活检部位加压后仍观察到中度至重度出血，建议继续加压，并立即联系兽医。
由于止血是降低奶牛发病率的重要因素，一项研究将止血垫填塞至活检部位以控制出血9。然而，以这种方式使用止血垫在奶牛场环境中存在较高的微生物污染风险。另一项研究14在重复取样之间以及活检和皮肤缝合后，对手术部位施加手动压力，并在活检后对部位冰敷至少2小时。在本方案中，对活检部位施加强力压迫20至25分钟足以控制出血。
成功的活检技术应使乳汁中的血液最少，且术后血液持续时间较短。为避免泌乳反射期间泌乳中断以及乳房炎感染，应通过手挤的方式从活检乳区清除乳腺内的血凝块10,14。在本方案中，活检后乳汁中可见血液的现象持续至多48小时。然而，在一项使用较多动物的研究中，大多数奶牛乳汁中出现血液的时间少于6天，仅有少数动物在6天后仍可见乳汁中有血液8。因此，术后需每日观察乳汁外观至少6天。当获取较大组织样本时，动物未表现出任何乳房炎感染的迹象14。然而，既往研究采用针头对同一动物进行重复活检发现，术后乳房炎感染的发生率约为12%8。在本方案中，两例动物术后均未出现临床乳房炎的可视症状。此外，活检切口部位也存在轻微的感染风险。
盐酸妥拉唑林是一种可逆转镇静作用的药物，若发生赛拉嗪过量，应备有此药。赛拉嗪剂量过高可能引起肺水肿。肺水肿的临床症状包括呼吸困难、严重呼吸急促、呼吸费力、咳嗽以及泡沫样痰。若观察到肺水肿症状，建议使用妥拉唑林（2至4 mg/kg体重）以逆转赛拉嗪的作用。
本方案描述了进行针吸活检和穿刺活检的技术。通常，与针吸活检相比，穿刺活检的优点是可获得较大的组织样本（0.75至1克）9，且对乳房健康产生的负面影响最小。针吸活检比穿刺活检器械更具微创性。然而，使用针吸活检方法多次取样以获取更多组织，可能会增加术后大出血以及乳汁中出现血凝块的风险。这两种技术均仅引起轻微的奶牛发病率，且经手术人员接受最少培训后即可轻松完成。在穿刺活检和针吸活检后，分别预期会出现短期的日泌乳量变化（减少8%至10%）及其成分改变9，以及采食量下降14。针吸活检的局限性在于通过针头获取的组织体积较小。该器械仅在针头位于待取样组织内部时方可启动，通常需要多次操作才能获得足够的组织量，这会增加术后乳汁带血和乳腺炎的风险。穿刺活检的局限性包括：若获取的组织量较大（>200 mg），术后出血风险更高。此外，活检工具组装难度较高，使用前需经过充分培训。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家动物营养计划和弗吉尼亚理工大学资助。谨此感谢塔拉·皮洛内罗女士、朱莉·塞特拉奇博士和伊莎贝尔·特谢拉博士提供的技术支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70% 异丙醇 | 沃尔玛 | 565106257 | 1 L |
| 气溶胶喷雾用于杀灭和驱赶苍蝇 | MWI | 14339 | 1 瓶（如有必要） |
| 12 G 活检针 × 16 cm | C. R. Bard | MN1216 | 2 |
| 蝴蝶型输液器（18 G 针头） | Fisher | 22-258087 | 1 |
| 细胞培养皿 | Fisher | 08-772E | 4 |
| 无线电钻（低速） | 日立 | DS10DFL | 1 |
| 核心活检器械，Farr 等（1996） | 2，定制金属加工。如需获取该工具，请联系作者。 | ||
| 奶牛 | 牛健康 | ||
| 氟尼辛葡甲胺 | MWI/VetOne | 501018 | 1.1 至 2.2 mg/kg 体重 |
| 折叠桌 | 亚马逊 | 1 | |
| 镊子 | Fisher | 09-753-50 | 1 |
| 非无菌手套 | Fisher | 17-200-845 | 9，尺寸依赖性 |
| 硬毛刷 | Sullivan Supply | 18270 | 1. 清洗奶牛 |
| 头部固定装置 | 1，专为奶牛定制 | ||
| 盐酸利多卡因 2% 注射液 | MWI/VetOne | 510212 | 使用了6 mL， 3 到 8 mL |
| 家畜体表清洗 | eZall Technologies | 39384 | 1. 清洗奶牛 |
| 18 G 针头 （1 到 1/5）“) | Fisher | 14-821-15A | 6 |
| 20 G 针头（1 至 1/5）“) | Fisher | 14-815-526 | 6 |
| 磷酸盐缓冲盐水（0.9%） | Fisher | 20-012-043 | 1 L |
| 聚维酮碘软膏 | Jeffers | #VED1A | 500 g（如有必要） |
| 聚维酮碘擦洗液（0.75% 碘） | MWI/VetOne | 510094 | 1 L |
| 可重复使用的活检器械 | C. R. Bard | MG1522 | 1 |
| 绳索缰绳 | 纳尔科农场与牧场 | C10852 | 2，牛的体型 |
| 手术刀片（#10） | MWI | 033870 | 2 |
| 手术刀柄（#3） | MWI | 602008 | 1 |
| 自封式高压灭菌袋 10 x 5.5 英寸 | Fisher | 19-130-0038 | 800 件/箱 |
| 无菌棉纱布垫 | Fisher | 22-037-986 | 4 |
| 无菌纱布垫 | Fisher | 19-090-735 | 4 |
| 无菌外科手套 | 外科手套 | 19-166-679 | 3, 尺寸依赖性 |
| 无菌手术巾 | Fisher | 50-118-0339 | 6 |
| 听诊器 | Littmann Master Classic II | 1392 | 1 |
| 手术剪 | Oster A5 | 078005-010-003 | 1. 活体组织检查前的动物准备 |
| 外科剪毛刀片（#40） | 奥斯特 | 78919-016 | 1. 活体组织检查前的动物准备 |
| 外科缝合钉移除器 | MWI | 541 | 1 |
| 预装外科缝合器 | MWI | 17713 | 5 |
| 10 mL 注射器 | Fisher | 14-823-224 | 3 |
| 2 mL注射器 | Fisher | 22-028854 | 3 |
| 20 mL注射器 | Fisher | 22-034507 | 3 |
| 5 mL注射器 | Fisher | 22-028855 | 3 |
| 温度计 | Agri-Pro Enterprises Inc | 72000 | 1 |
| 盐酸妥拉嗪 | Akorn动物健康 | 61311-486-10 | 2至4 mg/kg体重（如有必要） |
| 镊子 | Fisher | 14-955-025 | 1，用于处理组织样本 |
| 水管 | 美乐棵，沃尔玛 | 554990501 | 1. 清洗奶牛 |
| 防水气溶胶创可贴（铝粉 40 mg） | MWI | 010728 | 1 瓶 |
| 盐酸赛拉嗪 | MWI/VetOne | 510650 | 0.01 至 0.05 mg/kg 体重 |
参考文献
- Khatun, M., Sorensen, P., Ingvartsen, K. L., Bjerring, M., Rontved, C. M. Effects of combined liver and udder biopsying on the acute phase response of dairy cows with experimentally induced E. coli mastitis. Animal. 7 (10), 1721-1730 (2013).
- Buitenhuis, B., Rontved, C. M., Edwards, S. M., Ingvartsen, K. L., Sorensen, P. In depth analysis of genes and pathways of the mammary gland involved in the pathogenesis of bovine Escherichia coli-mastitis. BMC Genomics. 12, 130(2011).
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- Ruegg, P. L. A 100-Year Review: Mastitis detection, management, and prevention1. Journal of Dairy Science. 100 (12), 10381-10397 (2017).
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- Baumgard, L. H., Matitashvili, E., Corl, B. A., Dwyer, D. A., Bauman, D. E. trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid decreases lipogenic rates and expression of genes involved in milk lipid synthesis in dairy cows. Journal of Dairy Science. 85 (9), 2155-2163 (2002).
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