本文介绍了一种通过光漂白降低蓝细菌自发荧光的方法。光漂白后，采用随机光学重建显微镜获取蓝细菌FtsZ环的三维超分辨率图像。
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摘要
摘要
超分辨率显微镜已广泛用于研究多种生物体中的蛋白质相互作用和亚细胞结构。然而，在光合生物中，超分辨率成像的横向分辨率仅为约100 nm。这种低分辨率主要源于超分辨率成像（如随机光学重建显微镜，STORM）所需高强度激光引发的光合细胞自身高背景自发荧光。本文介绍一种近期开发的光漂白辅助STORM方法，用于海洋聚球藻的成像 聚球藻属（Prochlorococcus）光漂白后，自体荧光的 聚球藻 被有效降低，从而能够以约10 nm的横向分辨率进行STORM成像。利用该方法，我们获得了 体内 FtsZ蛋白的三维（3-D）结构及其在细胞周期中四种不同FtsZ环形态的表征 聚球藻属（Prochlorococcus）本文所述方法或可适用于其他光合生物的超分辨率成像。
引言
超分辨率显微技术能够突破光的衍射极限，提供亚衍射极限分辨率（< 200 nm）的图像。该技术已广泛应用于多种生物体中，用于研究蛋白质定位和亚细胞结构。主要的超分辨率显微技术包括结构光照明显微镜（SIM）、受激辐射损耗显微镜（STED）、STORM以及光激活定位显微镜（PALM）。这些超分辨率显微技术的原理和应用已在其他文献中进行了综述1,2。
通过空间分离，STORM 可实现高达 10 nm 的分辨率3,4。在 STORM 中，仅激活衍射受限区域内的一种分子（"开启"），其余分子则保持非激活状态（"关闭"）。通过单个分子快速开关的累积，可生成一幅"突破衍射极限"的图像3。同时，多种有机染料和荧光蛋白均可用于 STORM，使得从常规荧光显微镜轻松升级至高分辨率显微镜成为可能5,6。
STORM 技术尚未在光合细胞（如蓝细菌、藻类以及含有叶绿体的植物细胞）中得到广泛应用7,8，其原因是 STORM 需要高强度激光来驱动分子的光开关行为。高强度激光会非特异性地激发光合细胞中强烈的自发荧光背景，从而干扰 STORM 成像中的单分子定位。为了利用 STORM 研究光合细胞中的亚细胞结构或蛋白质相互作用，我们开发了一种光漂白方案，用于淬灭背景自发荧光信号9。在常规的免疫荧光染色流程中，样品在封闭步骤期间暴露于高强度白光下，可有效降低光合细胞的自发荧光水平，使其满足 STORM 成像的要求。因此，该方案使得利用 STORM 研究有色生物成为可行。
此处，我们描述了利用STORM成像单细胞微型蓝细菌中FtsZ环结构的实验方案 聚球藻属（Prochlorococcus）FtsZ 是一种高度保守的类微管蛋白细胞骨架蛋白，可聚合形成环绕细胞周缘的环状结构（即 Z 环）10 对于细胞分裂至关重要11. 保存 聚球藻属（Prochlorococcus） 细胞首先进行光漂白以降低自发荧光背景，随后用抗FtsZ一抗进行免疫染色，再与荧光标记的二抗即抗兔IgG（H+L）抗体孵育例如，Alexa Fluor 750）。最终，利用STORM观察FtsZ环的精细组织结构 聚球藻属（Prochlorococcus） 在细胞周期的不同阶段。
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方案
1. 样品制备与固定
- 将1 mL无菌的Prochlorococcus MED4接种至5 mL基于海水的Pro99培养基12中，在光照强度为35 µmol photons/m2s、23 °C条件下培养Prochlorococcus。接种5天后，取1 mL培养物置于1.5 mL离心管中。
注意：Prochlorococcus MED4在接种5天后将进入对数生长后期，细胞密度约为108个/mL，适合进行STORM成像。 - 向1.5 mL离心管中加入100 µL由25%（w/v）多聚甲醛（PFA）新鲜配制的甲醛溶液以及2 µL 50%戊二醛，以固定细胞。将样品置于室温避光孵育20分钟。
注意：固定过程中需避光，因为戊二醛对光敏感。 - 在13,500 x g条件下离心1分钟，沉淀细胞后弃去上清液，将细胞重悬于100 µL Pro99培养基12中。将样品保存在4 °C，直至进行免疫染色。
2. 使用聚苯乙烯微珠预包被盖玻片
注意：聚苯乙烯微球被视为用于漂移校正的基准标记。
- 涡旋聚苯乙烯微球原液，并用50%乙醇配制1:20,000稀释液作为工作悬浮液。
- 打开加热板，将温度设定为120 °C，然后将盖玻片放置在加热板上。
- 在每张盖玻片上加载100 µL工作悬浮液。将盖玻片在加热板上孵育10分钟，然后小心地将盖玻片转移至培养皿中，在室温下保存。
注意：附着微球的一侧应朝上，细胞也应接种在同一侧。微球已固定在盖玻片上，用于在STORM成像过程中实时校正样品漂移。微球固定后，盖玻片不可再进行火焰处理。
3. 将多聚赖氨酸包被到珠子包被的盖玻片上
注意：此步骤用于固定蓝细菌细胞。
- 将100 µL聚-L-赖氨酸（1 mg/mL）加至盖玻片中心，确保珠子包被面朝上。室温下静置30分钟。
- 使用移液器小心吸去未结合的聚-L-赖氨酸，并转移至1.5 mL离心管中。将聚-L-赖氨酸保存于4 °C，以备重复使用。
- 在60 mm培养皿中用10 mL超滤水冲洗盖玻片，然后用纸巾短暂吸干。
- 将盖玻片存放于100 mm培养皿中以备后续使用。为防止盖玻片粘附于培养皿底部，可在培养皿内铺一层Parafilm。
注意：预先包被了珠子和聚-L-赖氨酸的盖玻片可在室温下保存至少半年。因此，建议预先批量制备盖玻片。
4. 细胞在盖玻片上的固定
- 将预先包被的盖玻片转移至底部铺有封口膜的新培养皿中，此后该培养皿称为染色皿。在盖玻片上加入100 µL固定后的样品，静置30分钟，以使细胞充分贴附。
- 将盖玻片转移至12孔板中的一个孔内，此后该孔称为洗涤皿。向孔中加入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）（10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、137 mM NaCl 和 2.7 mM KCl，pH 7.4），洗涤盖玻片。吸除PBS缓冲液，再加入新鲜PBS缓冲液重复洗涤一次。
5. 蓝细菌细胞的透化处理
- 使用移液器移除 PBS 缓冲液。向洗涤皿的孔中加入 1 mL 新鲜配制的通透缓冲液，其中含有 0.05% 非离子去垢剂-100（v/v）、10 mM EDTA、10 mM Tris（pH 8.0）和 0.2 mg/mL 溶菌酶。
- 将洗涤皿在 37 °C 下孵育 20 分钟，然后移除通透缓冲液。
- 加入 1 mL PBS 缓冲液，并将洗涤皿置于摇床上，轻轻振荡 5 分钟。移除 PBS 缓冲液。重复此步骤 3 次以洗涤盖玻片。
6. 封闭步骤中叶绿素色素的光漂白
- 将盖玻片转移至染色皿中，在盖玻片上加入50 µL封闭缓冲液，该缓冲液含有0.2%（v/v）非离子去垢剂Triton X-100和3%（v/v）山羊血清。
- 将整个染色板置于冰上，并移至氙灯光源下进行光漂白，至少持续60分钟，光照强度为1,800 µmol 光子/m2·s。
- 光漂白和封闭完成后，用纸巾边缘小心吸去封闭缓冲液。
注意：氙灯光源强度极高，需佩戴合适太阳镜以保护眼睛。同时，应用铝箔包裹光源和染色板，防止光线泄漏造成眼部损伤。每15分钟检查一次盖玻片，确保其保持湿润。若盖玻片变干，需添加50 µL封闭缓冲液。
7. 抗体结合
- 根据制造商说明，将抗Anabaena FtsZ 抗体溶解于 200 µL 水中。
- 取 1 µL 抗 FtsZ 抗体加入 99 µL 封闭缓冲液中稀释。将 50 µL 稀释后的一抗溶液加至盖玻片上，室温孵育 30 分钟。
- 将盖玻片转移至洗涤皿中，加入 1 mL PBS 缓冲液，并将洗涤皿置于摇床上。轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复此步骤 3 次以充分洗涤盖玻片。
- 将盖玻片转移至染色皿中，将 1 µL 二抗稀释于 500 µL 封闭缓冲液中。将 50 µL 稀释后的二抗溶液加至盖玻片上，室温避光孵育 30 分钟。
- 将盖玻片转移至洗涤皿中，用 1 mL PBS 缓冲液在摇床上洗涤。轻轻振荡 5 分钟，并用铝箔纸包裹洗涤皿以避光。重复此步骤 3 次。
- 向孔中加入 500 µL 新鲜配制的 4% 甲醛（PFA，w/v）溶液。将盖玻片室温避光孵育 15 分钟。
- 移除甲醛溶液，并重复洗涤步骤 3 次。
- 将盖玻片置于 PBS 缓冲液中，4 °C 避光保存，直至成像。
8. STORM 成像缓冲液的制备
- 在进行STORM成像前，立即根据表1配制1 mL成像缓冲液。
注意：成像缓冲液的有效期约为2小时，因此需在使用前新鲜配制。加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶后，避免涡旋振荡。
警告：甲基紫精为有毒物质，请务必小心操作。环辛四烯被归类为1类致癌化学物质，请避免吸入和皮肤接触，并在通风橱内配制环辛四烯储备液及成像缓冲液。
9. STORM 数据的图像采集
- 将盖玻片放入加样室中（图1）。将新配制的成像缓冲液轻轻加入加样室，避免冲走蓝细菌细胞。在成像缓冲液上方放置一块矩形盖玻片，以防止其与空气中的氧气发生反应。注意避免在盖玻片下方产生气泡。
- 打开相机、LED光源和激光器。启动STORM软件，用于图像采集、质心位置确定以及样品漂移校正13。
- 在物镜顶部加入半滴浸油。将加样室装入显微镜，并确保物镜镜头与盖玻片接触良好。
- 使用750 nm激光检查信号。
注意：务必设置一个不加二抗的阴性对照，以确保自发荧光已被有效抑制。 - 选择一个同时包含细胞和定位标记物的成像区域。启动样品漂移校正软件。
注意：通常理想的成像区域包含10–30个细胞，同时细胞之间应充分分离，避免重叠。 - 以相机电子倍增（EM）增益为300、曝光时间为30 ms的条件采集一幅宽场图像作为参考图像（图2A）。
- 将750 nm激发激光强度调至较高功率，约为4.5 kW/cm2。当荧光分子进入稀疏闪烁状态后，以33 Hz采集10,000帧图像，获得一幅超分辨率图像（图2B）。
注意：如果荧光分子未充分分离，需等待几分钟，直至更多荧光分子进入暗态，单个孤立分子依次闪烁。此处描述的帧数适用于本实验样品，针对其他目标结构需进行优化。
10. 从原始数据重建超分辨率图像
- 在 ImageJ 中使用名为 QuickPALM（材料表）14 的插件重建三维彩色超分辨率图像。
注意：将显示初步的色度图像（图 2C）以及带有颜色编码的比例尺（图 2C）。颜色代表 z 轴方向的深度。 - 为通过视频展示三维结构，使用 QuickPALM14 构建一系列每隔 10 nm 沿 z 轴切片的超分辨率图像堆栈。调节堆栈的亮度，并复制一个目标细胞的图像堆栈。在 ImageJ 中使用名为 3D Viewer（材料表）15 的插件生成细胞的三维图像。记录三维结构的旋转过程，用于演示。
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结果
STORM 通过随机激活单个光可切换荧光分子实现超分辨率成像。每个荧光分子的位置被记录下来，随后基于这些位置信息构建超分辨率图像4因此，荧光基团定位的精确性对于超分辨率图像重建至关重要。荧光基团的吸收光谱 聚球藻属 在 447 nm 和 680 nm 处出现峰值，以及聚球藻属（Prochlorococcus） 在波长超过700 nm时具有最小吸收值16。然而， 聚球藻 MED4细胞在暴露于极高强度的750-nm激光时仍表现出强烈的自发荧光图3A），这是STORM成像所必需的。因此，样品的自发荧光背景较高 聚球藻属 细胞密集会严重干扰超分辨率成像。
为了利用STORM技术研究Prochlorococcus中的蛋白...
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讨论
在本实验方案中，我们描述了一种显著降低聚球藻属蓝细菌Prochlorococcus（图3C）自发荧光的方法，随后对细胞内的蛋白质进行免疫染色，从而利用STORM技术研究Prochlorococcus中FtsZ环的三维形态（图4）。该方案也可适用于其他光合生物的超分辨率成像研究。
以往对光合生物的研究主要采用SIM实现超分辨率成像，因为SIM不需要高强度的激光。然而，SIM的空间分辨率仅为约100 nm1，远低于STORM。本研究中，STORM图像在xy平面的分辨率可达9.6 nm，在z轴方向可达41.6 nm9。通过光漂白和STORM成像所提升的分辨率，使研究人员能够以前所未有的细节水平研究光合生物。
在STORM成像之前进行光漂白是一个关键步骤，可使研究人员观察自荧光生物中蛋白...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢戴颖徐在技术协助和稿件审阅方面提供的帮助。本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号41476147）以及中国香港特别行政区研究资助局（项目编号689813和16103414）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚苯乙烯微粒 | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| 盖玻片 | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅，厚度1号 |
| 乙醇 | Scharlau | ET00021000 | |
| 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma-Aldrich | P9155 | 分子量 70,000-150,000 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 戊二醛溶液，50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| 吐温X-100 | Sigma | T8787 | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐，二水合物 | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma 碱 | Sigma | T1503 | |
| 溶菌酶 | Sigma | L6876 | |
| 山羊血清 | Sigma | G9023 | |
| 抗-Anabaena FtsZ 抗体 | Agrisera | AS07217 | |
| 山羊抗兔 IgG (H+L) 交叉吸附二抗 | Life Technologies | A-21039 | 与 Alexa Fluor 750 偶联 |
| 无水 D-葡萄糖 | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| 甲基紫精 | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| 环辛四烯 | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| 三(2-羧乙基)膦 (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| 葡萄糖氧化酶 | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| 过氧化氢酶 | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 氙灯光源 | 250 W | ||
| STORM 显微镜 | NBI | SRiS 显微镜 | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | 成像采集软件 |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | 漂移校正软件 |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
参考文献
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