本文介绍了在监测小鼠睡眠/觉醒状态期间，对特定类型神经元进行光遗传学操控的方法，并以我们近期关于终纹床核的研究为例进行说明。
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方法文章
在监测小鼠睡眠/觉醒状态期间对神经环路进行光遗传学操控
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
近年来，光遗传学已广泛应用于神经科学研究的多个领域。在许多情况下，通过病毒载体在多种Cre驱动小鼠的特定类型神经元细胞中表达视蛋白（如通道视紫红质2，ChR2）。这些视蛋白的激活由激光或LED通过光纤传递的光脉冲触发，其激活效应可实现极高时间分辨率的观测。实验人员能够在监测小鼠行为或其他生理结果的同时，对其进行急性神经元刺激。光遗传学技术可为评估神经环路在调控小鼠睡眠/觉醒状态中的功能提供有效的研究策略。本文介绍一种在进行脑电图（EEG）和肌电图（EMG）监测以评估小鼠睡眠阶段的同时，检测具有特定化学特性的神经元经光遗传学操控后效应的技术。作为示例，我们描述了对终纹床核（BNST）中GABA能神经元的操控。在非快速眼动睡眠（NREM睡眠）期间急性光遗传学激活这些神经元，可迅速诱导小鼠转入觉醒状态。结合EEG/EMG记录的光遗传学操控可用于解析调控睡眠/觉醒状态的神经环路。
引言
睡眠对最佳认知功能至关重要。最近的研究还表明，睡眠障碍与多种疾病相关1,2,3。尽管睡眠的功能在很大程度上仍未完全阐明，但近年来在理解调控睡眠/觉醒状态的神经回路和机制方面已取得显著进展4。在哺乳动物中，存在三种警觉状态：觉醒、非快速眼动（NREM）睡眠和快速眼动（REM）睡眠。觉醒的特征是低幅高频的脑电图振荡（5–12 Hz），并伴有有目的且持续的运动活动。NREM睡眠以高幅慢振荡（1–4 Hz，即δ波）为特征，意识丧失，且无目的性运动活动。REM睡眠的特征是低幅相对较快的振荡（6–12 Hz）以及几乎完全的双侧肌肉失张力5。
博尔贝利提出了一种关于睡眠-觉醒调节的理论，称为双过程模型6,7一种稳态过程，也称为S过程，代表在清醒期间累积并在睡眠期间消散的睡眠压力。另一种称为C过程的是昼夜节律过程，用以解释警觉水平为何在24小时周期中发生波动。除了这两个过程外，异稳态因素在睡眠/觉醒的调节中也具有重要作用。8,9稳态调节因素包括营养状态和情绪。恐惧和焦虑通常伴随着觉醒程度的升高，以及自主神经和神经内分泌反应的增强。10,11,12人们认为边缘系统在恐惧和焦虑的调节中发挥作用，其介导的自主神经和神经内分泌反应机制已被广泛研究，但边缘系统影响睡眠/觉醒状态的通路尚未阐明。近年来大量采用光遗传学和药理遗传学的研究表明，调节睡眠/觉醒状态的神经元和神经环路广泛分布于大脑多个区域，包括大脑皮层、基底前脑、丘脑、下丘脑和脑干。特别是光遗传学技术的最新进展使我们能够特异性地激活或抑制特定的神经环路 i在体内实现高空间和时间分辨率的观测。该技术将推动我们对睡眠与觉醒神经基础的理解，并揭示昼夜节律过程、睡眠压力以及包括情绪在内的稳态外调节因素如何共同调控睡眠/觉醒状态。本文旨在介绍如何将光遗传学操控与睡眠/觉醒记录相结合，这一方法有望更新我们对大脑中参与调控非快速眼动（NREM）睡眠、快速眼动（REM）睡眠及觉醒状态的连接组及其机制的认识。阐明边缘系统调控睡眠/觉醒状态的机制对健康至关重要，因为失眠通常与焦虑或对无法入睡的恐惧（睡眠恐惧症，somniphobia）密切相关。
终纹床核（BNST）被认为在焦虑和恐惧中发挥关键作用。GAD 67表达的GABA能神经元是BNST中的主要神经元群体12,13。我们研究了对这些神经元（GABABNST）进行光遗传学操控对睡眠/觉醒状态的影响。近年来神经科学领域最重要的进展之一，是能够在体内以高空间和时间分辨率操控具有特定化学特性的神经元的方法。光遗传学在揭示神经活动与特定行为反应之间的因果关系方面具有重要价值14。我们将光遗传学描述为一种用于研究特定神经环路在调节睡眠/觉醒状态中功能连接性的方法。通过利用该技术，人们在理解调控睡眠/觉醒状态的神经环路方面已取得重大进展15,16,17,18,19。在许多情况下，通过使用Cre驱动小鼠与Cre诱导型AAV介导的基因转移相结合的方法，可将视蛋白特异性地导入特定脑区中具有特定化学特性的神经元 。 此外，通过在局部表达光敏感视蛋白（如通道视紫红质2（ChR2）20或古细菌视紫红质（ArchT）21），并结合Cre-loxP或Flp-FRT系统，可实现对特定神经元群体及特定神经通路的精确操控22。
本文以终纹床核（BNST）中的GABA能神经元实验为例进行说明。为了在特定神经元群体中表达视蛋白，最常用的方法是使用合适的Cre驱动小鼠和Cre依赖性病毒载体。此外，视蛋白在特定神经元群体中表达的转基因或基因敲入小鼠品系也同样有效。在以下实验中，我们使用了GAD67-Cre基因敲入小鼠23，该小鼠品系具有C57BL/6J遗传背景，仅在GABA能神经元中表达Cre重组酶；同时使用了一种AAV病毒载体，该载体包含与EYFP融合的ChR2（hChR2 H134R），或仅以EYFP作为对照，并带有"FLEx（Flip-excision）开关"24。该实验流程具体描述了在监测睡眠/觉醒状态期间，对BNST中GABA能神经元进行光遗传学激活的操作方法25。
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方案
本研究所涉及的所有实验均经筑波大学动物实验与使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）指南。
1. 动物手术、病毒注射、脑电图/肌电图电极及光纤植入
注意：应根据所用病毒的生物安全等级选择适当的防护和操作技术。腺相关病毒（AAV）的注射应在独立的P1A级洁净室中进行，且在用尽全部病毒液后，盛装AAV的管子必须经高压灭菌处理。手术部位及所有植入材料在使用过程中应保持清洁和无菌。
注：参见图1。
- 使用高压灭菌器对手术器械进行消毒。
- 使用异氟烷麻醉机对小鼠进行麻醉。观察直至小鼠达到所需的麻醉深度，判断标准为用镊子夹尾无反应。在眼睛上涂抹眼膏以防止角膜干燥。
- 用碘溶液或70%乙醇对手术区域进行消毒（3次），并充分干燥。手术过程中将病毒置于冰上解冻。用吸水实验台纸覆盖手术区域。
- 将小鼠头部固定在立体定位仪上，使用耳杆和鼻夹固定。确认头部稳定后，沿矢状方向切开头皮，确保前囟（bregma）和后囟（lambda）位于同一水平线上。
- 为避免定位偏差，适当上下调节鼻夹和耳杆的高度。前囟和后囟分别指矢状缝与冠状缝或人字缝的交点（图2）。
- 使用Serafin钳夹住皮肤以充分暴露颅骨。暴露颅骨后，用碘液或5% H2O2对颅骨表面进行消毒，以便更清晰地观察包括前囟和后囟在内的颅骨缝。
- 准备AAV载体注射：
- 用70%乙醇、100%乙醇和无菌水依次清洗10 mL注射器内部（见材料表），每种溶液各清洗5次。将注射器固定在微量注射泵臂的夹具上，并确保注射器内所有液体排尽。
- 小心吸取2 µL矿物油，避免产生气泡，然后吸取指定体积的病毒溶液。吸取完成后，推动推杆按钮，确认病毒溶液从针尖处渗出。
注意：病毒溶液的注射体积已在使用相同小鼠品系和相同病毒产品的预实验中确定。应预先评估病毒溶液体积与感染区域范围之间的关系。
- 注射AAV载体：
- 将微量注射针尖对准前囟，记录坐标作为原点。将针尖移至指定注射位点（对于终纹床核BNST：前后方向+0.2 mm，内外侧±1.0 mm，背腹方向-4.2 mm），并将针尖置于该位置。在颅骨上做标记，使用配有0.7 mm碳化钨钻头的牙科钻头钻出直径约2 mm的孔。注意不要损伤硬脑膜或脑组织。
- 用棉签清除孔周围血液后，缓慢将针插入BNST位置。使用机械微量注射器以0.07 µl/min的速度缓慢注射指定量的病毒溶液。注射完成后，将针留置5分钟，使溶液充分渗透BNST组织，然后小心拔出针头。
- 如需双侧注射，重复步骤1.8.1–1.8.2操作另一侧。整个过程中，持续用无菌生理盐水保持颅骨湿润。
注意：我们使用定制的EEG/EMG植入物（宽5 mm，深7 mm，高1 mm），包含四个EEG电极（4 mm）、两个EMG电极（2 mm；用镊子将4 mm电极剪至2 mm）和6个电极（4.5 mm）（图2A）。
- 将两根不锈钢丝（见材料表）的两端各剥去1 mm绝缘层，焊接到EMG电极上。将电极中心对准前囟，并标记每个EEG电极的位置（前后方向±1.5 mm，内外侧±1.0 mm），确定植入物的位置（图2B）。
- 植入光纤：
- 将光纤插针固定在操纵器上，并旋转操纵臂，使其与水平线成±30°角（此步骤仅用于避免电极与光纤之间的干扰，例如在BNST刺激时）。将光纤尖端置于前囟处，记录坐标。
- 将光纤尖端移至目标插入线，在颅骨上标记位置。同时在插入点附近标记用于固定螺钉的位置。使用牙科钻头在各标记处钻孔，用于插入光纤和固定螺钉。将螺钉固定在颅骨上。注意不要因螺钉损伤硬脑膜或周围组织。
- 使用操纵器轻柔插入光纤，直至到达BNST上方。插针应稳固地放置在残留的颅骨上（图1B）。
- 涂抹光固化牙科水泥（见材料表）以覆盖光纤和螺钉。胶水固化所需反应时间应参照制造商说明书（我们的材料需使用特定波长的光源照射至少10秒；无需在光照后额外干燥）。
- 此步骤中需确保无任何材料（螺钉或胶水）占据电极的安装空间。同时避免在连接光纤与光纤插针的牙科水泥中出现断裂。如需双侧刺激，重复步骤1.10.1–1.10.4操作对侧。
- 为EEG/EMG电极钻孔。将电极尖端插入孔中。手持植入物，并在颅骨与电极之间的空隙涂抹氰基丙烯酸酯胶水。再次插入，注意避免与其他材料发生干扰。
- 在电极和光纤周围涂抹氰基丙烯酸酯胶水，随后在其表面喷洒氰基丙烯酸酯加速剂。此步骤可避免光纤插针与光纤电缆、以及电极与导线连接处出现松动（图1C）。
注意：氰基丙烯酸酯胶水及其加速剂对小鼠眼睛有害。操作时注意防止化学物质溢出。同时，避免在胶水固化后立即用力触碰电极或光纤，以防发生意外偏移。 - 暴露小鼠颈部肌肉，将EMG电极导线插入肌肉下方。调整EMG电极长度，使其刚好位于项部肌肉下方。电极尖端与肌筋膜之间轻微接触即可有效采集EMG信号。
- 使用氰基丙烯酸酯胶水填充植入区域，并用加速液固化胶水。随后将小鼠置于加热垫上恢复，直至出现姿势反射。调节加热垫温度至动物静息体温（对于C57BL6小鼠，在ZT 0–12期间为36.0 °C；温度不得超过38.0 °C）。
注意：无菌手术无需使用抗生素。 - 根据所在机构的术后镇痛指南进行处理。术后将小鼠饲养于普通笼具中，恢复期至少7天。
2. 在特定睡眠状态下对靶向神经元进行光激发的同时进行脑电图/肌电图监测
警告：本方案涉及使用3B类激光设备或LED装置。实验人员应了解相关安全信息，并佩戴防护护目镜。
- 在将激光光纤连接至植入的光纤前，使用功率计调节激光强度。将激光光纤的末端与一个未使用的带插芯的光纤进行连接，确保光纤与光纤之间连接处无间隙。
- 打开激光器的主开关，等待20分钟使其预热。
- 将激光发射至光强检测仪，并调节激光强度至 10 mW/mm2将激光模式改为晶体管逻辑模式，并确认光纤在模式调节器控制下发出光脉冲，参数设置为持续时间10 ms、间歇时间40 ms、每周期20次、重复20次（即20 Hz的10 ms光脉冲持续20 s）。
- 恢复期结束后，将小鼠转移至实验记录舱内进行脑电图（EEG）/肌电图（EMG）记录。将小鼠饲养在恒定23 °C，12小时光照/12小时黑暗循环，自由获取食物和水 随意.
- 将植入的电极与连接在滑环上的电缆适配器相连，以避免缠绕。 建议使用铝箔等不透光材料包裹连接处，以防止激光泄漏。如果需要进行双侧实验，请使用带有分叉连接装置的滑环连接线缆。
- 在本实验方案中，我们评估小鼠从非快速眼动（NREM）睡眠或快速眼动（REM）睡眠觉醒的潜伏期，因此记录时间应限制在优化的授时因子时间（ZT）内（ZT0定义为开灯时间）。本方案在ZT4至ZT10期间进行。让小鼠在实验箱内自由活动至少1小时以适应环境。
- 在实验期间，于同一显示器上监测脑电图（EEG）和肌电图（EMG）信号，并评估小鼠所处状态为清醒、非快速眼动睡眠（NREM）或快速眼动睡眠（REM）。通过调节各波形的增益控制，以更清晰地区分不同状态。
- 测量非快速眼动睡眠（NREM）向觉醒转换的潜伏期时，需观察持续40秒的稳定NREM睡眠或持续30秒的稳定快速眼动睡眠（REM），随后打开模式发生器的开关以进行光刺激（该程序产生频率为20 Hz、脉宽为10 ms、持续20 s的光脉冲）。确认激光已通过植入的光纤输出。
- 记录脑电图（EEG）/肌电图（EMG）信号，直至睡眠状态转变为清醒状态。若需要进行两次或以上实验，每天仅限进行一次光遗传学操作，因为光刺激是一种人工干预，可能影响睡眠/清醒结构。
- 实验结束后，对动物进行深度麻醉，用无菌生理盐水和多聚甲醛（PFA）灌流，以取全脑用于免疫组织化学分析26.
3. 分析从NREM睡眠到清醒状态的潜伏时间
- 记录脑电图（EEG）/肌电图（EMG）信号后，将信号数据 transferred 到计算机中，用于对睡眠/觉醒状态进行分期评分。本方案描述了使用记录软件进行 EEG 分析的方法（参见材料表）。
- 启动睡眠分析软件，点击文件选项卡，选择打开以载入已记录的数据（.kcd 文件）。点击睡眠选项卡，选择分段时长以调整每个时段的时间窗口（我们使用每 4 秒为一个时段）。
- 根据以下标准，基于 EEG/EMG 信号手动对睡眠/觉醒状态进行分期评分：觉醒状态表现为高 EMG 信号和低电压、高频率的 EEG 信号；非快速眼动睡眠（NREM）表现为低 EMG 张力和高电压、高 δ 波（0.5–4 Hz）频率的 EEG 信号；快速眼动睡眠（REM）表现为 EMG 显示肌肉失张力，以及低电压、高 θ 波（6–9 Hz）频率的 EEG 信号。若某一状态未持续至少 16 秒（即连续 4 个时段），则不定义为状态转变，因其不属于稳定状态。
- 用鼠标左键点击第一个时段并按住，拖动光标直至超过 16 秒（4 个时段）的特定趋势结束，然后松开鼠标左键，在弹出窗口中选择相应状态（觉醒、NREM 睡眠或 REM 睡眠）。重复此操作，对文件中记录的所有 EEG/EMG 信号完成评分。
- 在 EEG 显示为 NREM 或 REM 睡眠的时段中，确定刺激发生的准确时间点，以及刺激后发生状态转变的时段。统计刺激后立即开始的时段与状态转变前最后一个时段之间的时段数量。
- 将统计得到的时段数乘以 4 秒（A）。在刺激发生的时段，截取屏幕图像，测量从刺激点到该时段结束之间的时间宽度。然后将测得长度除以整个时段长度，再乘以 4 秒（B）。同理，计算状态转变时段中 NREM 睡眠的持续时间，即从该时段开始到状态转变点之间的时间（C）。
- 将 A、B 和 C 相加，得到从 NREM 睡眠到觉醒的潜伏期。分析从 REM 睡眠到觉醒的状态转变时，采用相同步骤。
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结果
本研究展示了光遗传学激活BNST中GABABNST神经元对睡眠状态转换的影响。ChR2-EYFP在BNST的GABA神经元中实现局灶性表达。原位杂交组织化学实验显示，ChR2-EYFP与表达GAD 67 mRNA信号的神经元共定位，表明这些神经元属于GABA能神经元。免疫组织化学脑片样本证实了光纤的位置，其尖端恰好位于BNST上方25。
图3A 显示了非快速眼动（NREM）睡眠期间光刺激前后具有代表性的脑电图（EEG）/肌电图（EMG）记录。高电压、低频率的脑电图信号且无肌电图信号代表处于NREM睡眠状态。在NREM睡眠稳定后，施加光刺激（20 Hz、10 ms脉冲，持续20秒）。在表达ChR2的小鼠中，刺激后约2秒即引发急性觉醒反应（低电压、高频率脑电图信号伴随活跃的肌电图信号）。对照小鼠（EYFP）在刺激后未出现觉醒转换...
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讨论
本文介绍了一种评估特定化学类型神经元光遗传学刺激对睡眠/觉醒状态转换影响的方法，并以操控GABA能神经元为例进行了演示BNST 神经元。我们的数据显示，对GABA进行光遗传学兴奋BNST 神经元导致从非快速眼动睡眠立即转变为觉醒状态。
由于多种光遗传学工具的开发，现已可采用多种实验设计。利用不同类型的视蛋白（如 ChR2、SSFO、halorhodopsin、ArchT 和 iChloC27），可以激活或抑制特定神经元的神经活动。ChR2 在光刺激后数毫秒内即可激活神经元，可通过脉冲发生器以锁相方式诱发动作电位，从而研究其在特定睡眠阶段的急性效应。而诸如稳定阶跃函数视蛋白（stable step function opsin, SSFO）等可持续激活的视蛋白，在刺激后可使神经元去极化持续 15 至 30 分钟，适用于观察半慢性效应的某些实验设计28。经 SSFO 去极化的细胞可能对多种生理性神经输入更为敏感，并可通过施加长波长光加以抑制。此外，...
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披露
该项目部分获得了默克公司（Merck & Co.）的财务支持。
致谢
本研究由默克研究者研究项目（#54843）以及创新科学领域前沿研究KAKENHI专项基金资助， "WillDynamics" （16H06401）（T.S.），以及前沿创新领域探索性研究的KAKENHI科研补助金（T.S.）（18H02595）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1x1 光纤旋转接头 | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | 用于光遗传学 |
| 6 针插头 | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6 针插座 | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D 转换器 | Nippon koden | N/A | 模拟信号转数字信号转换器 |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013（基因组拷贝数/mL） | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013（基因组拷贝数/mL） | ||
| 氨苄青霉素 | Fuji film | 014-23302 | |
| 放大器 | Nippon koden | N/A | 用于脑电图/肌电图记录 |
| 麻醉气体蒸发器 | Muromachi | MK-AT-210D | |
| 自动注射器 | KD scientific | 780311 | |
| 碳化钨切割钻头 | Minitor | B1055 | φ0.7 mm。又称牙科钻头，与高速旋转微型电机配合使用 |
| 氰基丙烯酸酯粘合剂 （Aron alpha A）及加速剂 | Konishi | #30533 | |
| 牙科光固化灯 | 3M | Elipar S10 | |
| 环氧树脂粘合剂 | Konishi | #04888 | 用于6针插头与屏蔽电缆焊接处的绝缘 |
| 光纤跳线（分路型） | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre 小鼠 | 由坂村健二博士提供 | Cre 重组酶基因被敲入 Gad67 等位基因中 | |
| 哈密尔顿注射器 | Hamilton | 65461-01 | |
| 高速旋转微型电机套件 | FOREDOM | K.1070 | 与碳化钨切割钻头配合使用 |
| 连接套管 | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm 陶瓷材质 |
| 异氟烷 | Pfizer | 871119 | |
| 激光器 | Rapp OptoElectronic | N/A | 波长 473 nm |
| 激光强度检测仪 | COHERENT | 1098293 | |
| 激光刺激器 | 生物研究中心 | STO2 | 文中称为脉冲发生器 |
| 带插芯的光纤 | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | 由 PennVector Core 提供 | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | 质粒 # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | 由 Karl Deisseroth 博士提供 | ||
| 跳线 | Doric | D202-9089-0.4 | 长度 0.4 m，用于激光器与旋转接头之间的激光传导 |
| pHelper | Stratagene | ||
| 光固化牙科水泥 | 3M | 56846 | |
| Serafin 夹具 | Stoelting | 52120-43P | |
| 屏蔽电缆 | mogami | W2780 | 用于与6针插座焊接，以记录脑电图/肌电图 |
| 睡眠记录室 | N/A | N/A | 定制（21 cm× 29 cm × 19 cm），带水箱支架 |
| Sleep Sign 软件 | KISSEI COMTEC | N/A | 用于脑电图/肌电图分析 |
| 滑环 | neuroscience,inc | N/A | 用于脑电图/肌电图分析 |
| 不锈钢螺钉 | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| 不锈钢导线 | Cooner wire | AS633 | 直径 0.0130 英寸 |
| 带数字控制台的立体定位仪 | Koph | N/A | 型号 940 |
| 注射器针头 | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital Recorder 软件 | KISSEI COMTEC | N/A | 用于脑电图/肌电图记录 |
参考文献
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