吸收性微活检取样与RNA提取用于微创同步血液和皮肤分析

摘要

本文展示了如何进行吸收性微活检技术，以及如何利用所获取的样本进行RNA提取，从而以微创的方式实现皮肤和血液的简单且同步采样。

摘要

传统皮肤活检由于具有侵入性，限制了其在美容敏感区域或儿科应用中的临床研究。本文介绍了使用 一种基于吸水性微针的装置——吸水性微穿刺活检（absorbent microbiopsy），用于微创采集皮肤与血液混合样本。我们的目标是促进临床研究的快速进展，建立皮肤疾病的生物标志物，并降低临床研究参与者的风险。与传统的皮肤活检技术相比，吸水性微穿刺活检操作可在数秒内完成，且因其结构简单，无需接受 intensive 培训即可实施。本报告中，我们描述了吸水性微穿刺活检的使用方法，包括装载与应用步骤，应用于一个 志愿者。然后，我们展示如何从吸收的样本中分离RNA。最后，我们演示使用定量逆转录PCR（RT-qPCR）来定量血液中mRNA的表达水平CD3E 和 CD19）和皮肤（KRT14 和 TYR）。我们所描述的方法使用市售试剂盒和试剂。本方案提供了一种微创方法，可利用同一吸收性微活检基质同步采集皮肤和血液样本。我们发现，人类伦理委员会、临床医生和志愿者均支持将此方法用于皮肤病学研究。

引言

皮肤活检是皮肤病学中最基本的技术之一，用于皮肤取样并通过组织病理学评估对皮肤疾病进行后续诊断。该活检技术涉及医务人员使用刀片或环钻活检工具，切除患者皮肤上的可疑病灶以供检查¹。尽管该技术有效，但侵入性较高，且通常以分子生物学技术作为终点，限制了其在临床研究中的应用^2,3。皮肤疾病的分子分析有望提供组织病理学分析无法获得的高度特异性的生物学信息，从而促进 药物发现和疾病诊断^4,5。此外，大多数分子技术所需的样本量相对较小，可能减少动物使用量，并允许进行更多重复实验。因此，迫切需要一种替代技术，能够在临床研究中实现分子分析，同时降低对受试者的风险。

为满足该领域的需求，我们团队开发了一种基于微针的新型诊断平台——吸收性微活检，可简单且微创地采集少量与血液混合的皮肤组织⁶。本文旨在介绍吸收性微活检作为一种取样工具，以促进临床研究中通过RNA提取进行分子分析。

此前，我们已描述了微型活检的第一代技术——皮肤微型活检，该技术由一种采用三层钢板设计的微针构成，可用于提取微小的皮肤组织⁷。该装置的创新之处在于微针具有多个接触点，可实现高效的组织提取³。相比之下，环形皮肤钻孔活检仅有一个接触点，在某些情况下仅能撕裂皮肤而无法获取任何样本。基于皮肤微型活检技术，我们近期开发了具有血液和皮肤取样双重功能的吸水式微型活检装置。最近一项流行病学研究已证实，该设备在资源匮乏地区具有实际应用可行性⁶。

由于其结构简单，吸收式微活检可在数秒内完成，且无需 extensive 培训。此外，无需使用局部麻醉，采样部位也不会留下疤痕。本方案使缺乏相关采样经验的研究人员或医疗专业人员也能获取用于分子分析的靶向皮肤数据。我们预计微采样装置未来将在皮肤研究中成为常规工具。

尽管微活检已见于其他涉及分子诊断技术^6,8,9,10（如人乳头瘤病毒DNA检测）的皮肤疾病研究中，但本方案首次详细阐述了用于吸收性微活检的样本提取与处理技术。此外，这也是首篇报道描述微活检样本中皮肤和血细胞相对基因表达谱的研究。

方案

该研究已获得昆士兰 Metro South 人类研究伦理委员会和昆士兰大学人类研究 伦理委员会（HREC-13-QPAH-551 和 UQ2013001551）以及南澳大利亚大学人类伦理委员会（200607）的批准。

1. 吸水性微活检织物的制备

1. 分别使用50 µm医用级不锈钢片和吸水层（滤纸）激光切割微针部件（图1）。
   注：装置的其他部件，包括推杆和外壳，采用快速成型技术（如3D打印）制备。
2. 除吸水层外，将所有部件浸泡于70%乙醇（EtOH）中5分钟，随后在空气中干燥30分钟。
3. 组装三层结构的微针，将吸水层置于中间（图1a）。
4. 将组装好的微针插入推杆的狭缝中。
5. 装上弹簧，并将推杆插入外壳中（图1c）。在组装过程中避免微针接触任何物体，以确保针体质量。
6. 使用前，将组装好的吸水性微组织活检装置密封包装，进行γ射线灭菌。

2. 使用吸收性微活检进行取样

1. 佩戴一次性手套，并用 70% 乙醇喷洒双手及工具（如镊子）。
2. 使用酒精棉片对施用部位进行消毒。
3. 从经 γ 射线灭菌的包装中取出微采样针，过程中避免触碰微针部分。
4. 通过拉动活塞压缩弹簧，直至听到“咔哒”声且活塞锁定到位，完成装置加载。
5. 将装置对准待采样的皮肤区域，确保采样区域位置固定。
6. 确保装置与皮肤大致呈垂直状态，然后向装置施加 ≥1 kg 的压力作用于皮肤。
   注意：必须向下施加压力，以确保微针充分穿透皮肤。
7. 按下触发器，并保持装置位置至少 10 秒，以便吸收血液样本。
   注意：若在 10 秒前释放装置，采集到的样本量将减少。

3. RNA 提取

注意：RNA 提取步骤根据生产商的说明书进行了修改，以优化从微生物活检样本中分离 RNA 的效果。RNA 提取过程中使用的所有试剂和离心柱均包含在试剂盒中，除非另有说明。

1. 用手轻轻将活塞和吸水微针从外壳中取出。确保微针尖端在取出过程中不接触任何物体。
2. 将吸水微针从活塞上取下。用无菌镊子夹住微针上的两个孔，将其拉出。
3. 将完整的微针放入预装有 50 µL 提取缓冲液的 2 mL 微量离心管中（非 RNA 提取试剂盒提供；见材料表），针头朝下指向管底。为尽量减少样品损失，在处理样品前将管子置于干冰上 5 分钟。
4. 短暂涡旋（3 - 5 秒），以从针尖去除部分采集的样品材料。
5. 将微针置于管中，在摇床上 42 °C 孵育 30 分钟。
   注意：缓冲液会立即被吸水层吸收。
6. 用无菌镊子将微针的顶部（与针头相反的一侧）对齐至 2 mL 微量离心管的管口边缘。
7. 盖紧管盖，使微针顶部被固定在盖子与管体之间。
8. 以 16,000 × g 或最大转速离心 30 秒，以将采集的样品材料从装置的吸水层中分离出来。
9. 用镊子小心取出微针，避免重新浸入缓冲液中。保留离心管并丢弃微针。
10. 将样品以 3,000 × g 离心 2 分钟。小心吸取含有提取 RNA 的上清液至新的微量离心管中。
11. 向纯化柱滤膜中加入 250 µL 条件缓冲液，并在室温下孵育 5 分钟。
12. 将纯化柱放入收集管中，以 16,000 × g 或最大转速离心 1 分钟。
13. 向第 3.9 步收集的样品中加入 50 µL 70% EtOH。通过轻轻吹打充分混匀。
14. 将混合液（约 100 µL）转移至预处理过的纯化柱中。
15. 立即以 100 × g 离心 2 分钟，随后以 16,000 × g 离心 30 秒，以去除穿流液。
16. 向纯化柱中加入 100 µL 洗涤缓冲液 1（W1），以 8,000 × g 离心 1 分钟。
17. 为每个样品在单独的微量离心管中将 5 µL DNase I 储存液加入 35 µL Buffer RDD 中，配制 DNase 溶液。通过轻轻颠倒混匀。
    注意：由于样品量较少，DNase 处理应在纯化柱上进行，而不是后续在 PCR 板中进行。
18. 将 40 µL DNase 孵育混合液直接加入纯化柱滤膜中。室温孵育 15 分钟。
19. 向纯化柱滤膜中加入 40 µL W1。以 8,000 × g 离心 15 秒。
20. DNase 处理后，向纯化柱中加入 100 µL 洗涤缓冲液 2（W2），以 8,000 × g 离心 1 分钟。
21. 再向纯化柱中加入 100 µL W2，以 16,000 × g 离心 2 分钟。检查纯化柱中是否有残留洗涤缓冲液。如有残留，以 16,000 × g 再次离心 1 分钟。
22. 将纯化柱转移至试剂盒提供的新的 0.5 mL 微量离心管中。
23. 用移液器将 11 µL 无 RNase 水（RNA 提取试剂盒未提供）直接加入纯化柱膜上，代替洗脱缓冲液（EB）。加样时轻轻触碰移液器尖端至膜表面，以确保无 RNase 水最大程度地被膜吸收。室温孵育 2 分钟。
24. 以 1,000 × g 离心 1 分钟，使无 RNase 水在柱内分布均匀，然后以 16,000 × g 离心 1 分钟以洗脱 RNA。
    注意：由于样品量极小，不建议进行 RNA 定量。
25. 暂停点 #1：若不立即进行 cDNA 合成，可将总 RNA 样品储存于 -80 °C。
    注意：鉴于 RNA 样品浓度较低，若非必要，应避免反复冻融。

4. cDNA 合成

1. 将冻存的样品（来自步骤 3.25）置于冰上解冻。
2. 使用 cDNA 合成试剂盒，按照以下步骤从总 RNA 合成 cDNA。
3. 配制反应体系：11 µL 总 RNA、4 µL 5x TransAmp 缓冲液、1 µL 逆转录酶、4 µL 无 DNase/RNase 的水。用移液器轻轻混匀。
4. 在热循环仪上进行逆转录反应：25 °C 反应 10 分钟，42 °C 反应 15 分钟，最后在 85 °C 灭活逆转录酶 5 分钟。
5. 暂停点 #2：将逆转录后的样品于 -80 °C 保存，直至使用。

5. qPCR 反应与数据分析

注意：使用 NCBI Primer BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计用于 qPCR 反应的引物时，使其跨越内含子边界，以避免扩增基因组 DNA。本研究中使用的参考基因为 RPLP0（更多信息请参见讨论部分）。

1. 将冻存样品（来自步骤 4.5）置于冰上解冻。
2. 根据以下步骤，使用 qPCR 预混试剂盒进行 qPCR。
3. 每反应配制如下主混合液：5 µL 2x qPCR 反应混合液、0.4 µL 10 µM 正向引物、0.4 µL 10 µM 反向引物、2.2 µL 无 DNase 水。用移液器轻轻混匀。每个样本设置三个技术重复。
4. 先向 384 孔 PCR 板的每个孔中加入 8 µL 主混合液，然后加入 2 µL 各样本的 cDNA（每孔总体积为 10 µL）。
   注意：以无模板对照（NTC）和无逆转录酶对照（-RT）作为阴性对照。
5. 用粘性封板膜密封反应板，并短暂离心。
6. 在实时荧光定量 PCR 仪上运行扩增程序：95 °C 预变性 2 分钟（激活聚合酶），随后进行 40 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 5 秒、60 °C 退火 10 秒、72 °C 延伸 10 秒。
7. 通过已知浓度模板绘制的标准曲线，对样本的 RNA 浓度进行插值计算。
   1. 在软件中创建 新实验。
   2. 点击 定义并设置标准品，以配置板上的系列稀释标准品。
   3. 选择并安排标准品和样本所在的孔位，点击 应用。
   4. 在结果标签页中点击 分析，评估标准曲线，确认其斜率、R² 值、扩增效率和误差符合实验标准。
   5. 根据未知样本的 Ct 值，在标准曲线上直观地读取其定量结果。
      注意：标准曲线的构建，包括稀释倍数的选择，应依据已发表的实验方案^11,12,13进行。
8. 采用 ΔCt 法分析 mRNA 的基因表达水平（将目标基因的 Ct 值相对于参照基因进行归一化）。
   1. 用参照基因的 Ct 值减去目标基因的 Ct 值，得到 ΔCt 值。
   2. 对技术重复的 ΔCt 值取平均值。
   3. 使用统计分析软件^11,14（见 材料表）进行基因表达的绘图与分析。
      注意：也可依据已发表的实验方案¹³进行基因表达分析。

结果

我们此前曾报道，皮肤微活检的微针可穿透皮肤约 500 µm 深度⁷。皮肤微活检的微针设计与吸收型微活检的微针设计高度相似（图 2a）。吸收型微活检在中间含有一层吸收材料用于吸收血液，而皮肤微活检则包含一个用于机械捕获皮肤组织的通道。吸收层的使用也导致微针尺寸存在轻微差异（吸收型：1.50 × 0.50 × 0.21 mm，皮肤型：1.50 × 0.50 × 0.15 mm）。

图2b 显示了在男性志愿者左前臂内侧应用吸收垫和皮肤微活检5分钟后的施用部位情况。由于两种微针设计相似，两种装置的施用部位表现相当，仅伴有轻微红斑。两种施用部位在48小时后均不再明显，且未留下任何疤痕。这支持了该微创装置具有潜力用于多次筛查不同施用部位或可定期使用的假设。

图2c 显示了将吸收型微活检装置应用于一名男性志愿者前臂掌侧后，其吸收层的代表性图像。如图所示，在微针尖端附近捕获到少量微小的皮肤组织，同时滤纸吸收了部分血液。这表明该装置穿透了皮肤，并在同一吸收型微活检基质中同时采集到了皮肤和血液样本。图2d 展示了采样后的皮肤微活检（前一代微活检技术）作为对照。皮肤微活检的通道捕获了一小块皮肤组织，但微针上的血液量相较于吸收型微活检明显较少。两种采样部位在48小时内均无明显痕迹。在实验中，吸收型微活检在应用后保持10秒的按压时间，而由于设计差异，皮肤微活检在施加后立即释放。

如图3a所示，根据操作方案，本实验涉及两组吸收型微活检：分别为“立即释放”组和“保持10秒”组。在“立即释放”组中，采用原始皮肤微活检方案进行操作，设备在应用后立即从施用部位移除。在“保持10秒”组中，设备在施用后保持原位10秒，以提高样本采集量。设置这两组吸收型微活检旨在展示不同的施用方式对样本采集量的影响。选择10秒的保持时间是基于临床合理性的考虑，用以证明施用时间会影响可回收样本的量。

两种吸收性微活检组回收的RNA量分别为：“立即释放”组0.33 ± 0.39 ng，“10秒持留”组1.43 ± 0.88 ng（图3a，n = 20），表明延长持留时间可使RNA量增加约4倍。这说明采用10秒持留时间的吸收装置可提取更多的RNA。该差异可能源于吸收层中血液样本量的增加（图3c）。事实上，“立即释放”组（图3b）的吸收层所收集的血液量明显少于“10秒持留”组（图3c）。还应注意的是，大多数立即释放的微活检样本接近于x轴，提示其为阴性事件或RNA含量极低。因此，该结果验证了假设：持留时间会影响装置性能，因为血液被吸收层吸收可能需要一定时间。

由于该装置设计用于血液和皮肤取样，因此采用qPCR检测两种装置的皮肤和血液生物标志物的表达水平以进行比较。我们使用酪氨酸酶基因TYR作为黑素细胞的生物标志物，KRT14作为活性表皮中角质形成细胞的生物标志物。实验中同时纳入了皮肤微活检样本作为对照。如图4所示，尽管由于设计差异，皮肤微活检与吸水式微活检的应用方式不同，但两种装置在皮肤生物标志物TYR和KRT14的表达水平上具有可比性。白细胞生物标志物（CD3E，T细胞；CD19，B细胞）在吸水式微活检样本中的检出率高于皮肤微活检样本。该结果表明，吸水式微活检在血液采集方面表现更优，同时仍具备与皮肤微活检相当的皮肤组织捕获能力（n = 5）。

图1. 吸收性微活检装置的制备。 （a）三层微针结构。（b）装置的全部组件。（c）组装完成的吸收性微活检装置。请点击此处查看该图的放大版本。

图2. 吸水性微采样器能够在男性志愿者前臂掌侧同时采集皮肤和血液样本，且不会留下疤痕。 （a）吸水性微采样器与皮肤微采样器的微针结构对比。（b）吸水性微采样器与皮肤微采样器在给药后5分钟的施用部位情况。（c,d）吸水性微采样器与皮肤微采样器在使用后的微针形态。请点击此处查看该图的高清版本。

图3. 吸收型微活检在施加10秒后采集到更多的血液和RNA样本。 (a) 与立即释放装置相比，施加后保持10秒可获得更高量的RNA（n = 20）。误差线表示均值的标准差（****p<0.0001）。(b,c) 采用“立即释放”和“保持10秒”两种方法应用后的吸收型微活检代表性图像。请点击此处查看该图的放大版本。

图4. 皮肤与吸收性微活检之间mRNA表达水平的比较（n = 5）。基因表达以参考基因RPLP0进行标准化。误差线表示均值的标准差（*p<0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

这些结果表明，吸收式微活检可用于简单且微创地采集皮肤与血液混合样本，以进行分子表征。按照本方案使用该装置对于获得可靠结果至关重要，不同使用方案所回收的RNA量差异即证明了这一点（图3）。样本提取后，后续用于RNA提取的样本处理步骤与现有成熟方案高度相似^15,16。除针对吸收式微活检对RNA提取的初始步骤进行了调整外，另一项关键改进是使用无RNase水以提升下游应用的实验结果。此外，值得指出的是，本研究中所使用的参考基因为RPLP0。RPLP0在多种细胞和组织类型中的功能已被广泛认知¹⁷，并已被报道适用于非黑色素瘤性皮肤癌及癌前病变的参考基因选择¹⁸。

该设备的主要局限之一是将微活检样本从装置中取出的过程，这一操作耗时较长，并可能增加样本丢失的风险，特别是对于RNA等敏感样本。然而，通过预先将所有无菌处理工具（如2 mL 微量离心管）在干冰上预冷，可以克服这一问题。

吸收性微活检的使用方法简单，无需进行 intensive 培训。由于微活检可借助已建立的分子诊断技术（如 RT-qPCR）实现分子表征，因此无需进行常规活检。为进一步量化并验证吸收性微活检的取样能力，本文回顾了既往涉及从人皮肤组织中提取 RNA 的文献。根据三项针对典型 3.0 或 4.0 mm 皮肤钻孔活检的研究，每毫克皮肤组织中提取的 RNA 量为 50 至 200 ng^19,20,21与平均从吸收性微活检中回收的1.43 ng RNA相比（图3)，根据皮肤钻孔活检研究中相同的RNA与组织比例，预计所采皮肤组织的重量范围为0.29–115 µg。

尽管该方案存在一些潜在的缺陷，但其中部分问题可以轻松克服。例如，RNA提取数据显示，即使采用10秒的停留时间，仍存在显著的 变异（图3）。为解决这一问题，一种可能的方案是优化施用程序。应测试并优化施加于皮肤的力度和停留时间等参数，以减少样本提取过程中的变异。另一个潜在问题是将微活检样本从装置中取出，这可能会影响样本的完整性和回收率。尽管将微活检样本取出用于RNA提取是一种有效的方法，但整个操作过程繁琐，且样本在操作过程中可能受到污染。因此，迫切需要改进样本处理方案，以确保样本完整性并防止样本损失。

一旦解决上述两个问题，该设备有望成为临床研究的标准工具。需要注意的是，该设备可同时采集皮肤和血液样本，在分析基因表达数据时应考虑这一特点。总之，本方案详细描述了采用吸收性微活检技术进行皮肤和血液联合采样的操作步骤，该方法简便且具有最小侵入性，以及后续用于相对基因表达谱分析的样本处理流程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>吸收性微活检制备与取样
吸收性微活检	特拉扬科学与医疗	N/A	https://www.trajanscimed.com/
Whatman 滤纸，1号规格	Sigma Aldrich	WHA1001325	N/A
<强>RNA提取
PicoPure RNA提取试剂盒	ThermoFisher	KIT0214	包括方案中描述的所有缓冲液溶液
UltraPure 无 DNase/RNase 灭菌蒸馏水	ThermoFisher	10977015	提高RNA洗脱步骤中的RNA质量
2.0 mL 微量离心管，无菌	Thomas Scientific	1226S74	N/A
Microcentrifuge 5415R	Eppendorf	Z605212	N/A
<强>cDNA合成
SensiFAST cDNA合成试剂盒	Bioline	BIO-65053	N/A
CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统	Bio-Rad	1855196	N/A
<强>qPCR 反应与数据分析
SensiFAST SYBR Lo-ROX 试剂盒	Bioline	BIO-94005	包括qPCR反应步骤中描述的试剂
MicroAmp 光学粘性膜	赛默飞世尔科技	4311971	N/A
MicroAmp 光学 384 孔反应板	赛默飞世尔科技	4343370	N/A
QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量 PCR 系统	赛默飞世尔科技	4485694	N/A
GraphPad Prism（v6.04）	GraphPad	N/A；Windows 版本	qPCR数据分析步骤中的绘图与统计分析
<强>PCR 引物
RPLP0 F	Sigma Aldrich	N/A	ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC
RPLP0 R	Sigma Aldrich	N/A	CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG
TYR F	Sigma Aldrich	N/A	TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA
TYR R	Sigma Aldrich	N/A	AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC
KRT14 F	Sigma Aldrich	N/A	CCT CCT CCC AGT TCT CCT
KRT14 R	Sigma Aldrich	N/A	ACA CCA CCT TGC CAT CG
CD3E F	Sigma Aldrich	N/A	CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG
CD3E R	Sigma Aldrich	N/A	GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG
CD19 F	Sigma Aldrich	N/A	TTC TGC CTG TGT TCC CTT G
CD19 R	Sigma Aldrich	N/A	GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T