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方法文章

高频超声用于体内胎儿和胎盘发育的分析 In Vivo

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DOI：

10.3791/58616

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2018年11月8日

 ,  , 
1Experimental Obstetrics and Gynecology, Medical Faculty, Otto-von-Guericke University, 2Institute of Molecular and Clinical Immunology, Medical Faculty, Otto-von-Guericke University

本文内容

摘要

本文介绍了利用高频超声对小鼠胎鼠进行活体分析的技术。该方法可在整个妊娠过程中对胎鼠进行追踪，并分析胎盘参数以及母体和胎儿的血流情况。

摘要

超声成像是一种广泛用于检测人体和动物组织中器官异常及肿瘤的方法。该方法具有无创、无害、无痛的特点，操作简便、快速，且可在任何地点进行，甚至可使用移动设备完成。在妊娠期间，超声成像被常规用于密切监测胎儿发育情况。该技术对于评估宫内生长受限（IUGR）至关重要，IUGR是一种对母亲和胎儿均可能造成短期和长期健康影响的妊娠并发症。深入了解IUGR的发生机制，对于制定有效的治疗策略不可或缺。

本研究中使用的超声系统是一种专为小型动物分析而设计的超声设备，可应用于包括妊娠研究在内的多个研究领域。本文描述了该系统用于对自然杀伤（NK）细胞/肥大细胞（MC）缺陷型母鼠所孕育的宫内生长受限胎鼠进行in vivo（活体）分析的操作方法。该实验方案包括系统的准备、小鼠在测量前及测量过程中的处理，以及B模式、彩色多普勒模式和脉冲波多普勒模式的使用。检测指标包括胎儿大小、胎盘大小以及胎儿血供情况。我们发现，从妊娠中期开始，NK/MC缺陷型小鼠的着床部位尺寸减小，胎盘体积更小。此外，MC/NK缺陷与胎儿脐动脉（Arteria umbilicalis, UmA）舒张末期血流缺失或反向以及阻力指数升高相关。本方案所述方法可便捷地应用于相关或非相关的研究课题中。

引言

超声波是指频率高于人耳可听范围的声波，通常高于约20 kHz1。蝙蝠、鲸类、海豚2，3、小鼠4、大鼠5以及鼠狐猴6等动物均利用超声波进行定位或交流。人类则将超声波应用于多种技术和医学领域。超声设备能够产生声波，并对信号进行发射和显示。当超声波遇到障碍物时，声波会被反射、吸收或穿透该物体。将超声波作为成像手段的应用称为超声成像（sonography），广泛用于人医或兽医领域中对有机组织的分析，例如心脏（超声心动图）7，8、肺部9、甲状腺10、肾脏11以及泌尿和生殖道12，13；用于检测胆结石14和肿瘤15；以及评估血管或器官的灌注情况16，17。超声检查是孕期产前护理的标准方法，可早期发现胎儿发育异常或缺陷。特别是通过定期监测胎儿生长情况，以识别可能存在的宫内生长受限（IUGR）。此外，还可监测胎儿血流，因为血流变化可提示生长受限情况18，19，20，21。

与放射成像等其他方法相比，超声成像的一个主要优势在于其声波对被分析组织无害。该方法简便、快速，具有非侵入性、无痛性，可多次重复使用。超声设备的初期投入成本较高，但所需耗材价格低廉。本论文所使用的超声系统适用于多种动物模型。 即， 小鼠和鱼类）对于人类，超声设备所需的频率为3-15 MHz，而对于小鼠，则需要15-70 MHz的频率。

本文描述了一种使用B型、彩色多普勒及脉冲波多普勒模式的实验方案。内容包括小鼠的准备、操作步骤、数据采集与存储。该方法已成功应用于不同品系小鼠的各个妊娠阶段，可用于研究胎儿和胎盘发育以及母体与胎儿的血液参数。本文基于我们对妊娠期MC/NK缺陷型小鼠及对照小鼠的研究，详细说明了所有应用方法。

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方案

本文所述所有方法均已获得“萨克森-安哈尔特州行政管理局：42502-2-1296UniMD”的批准。

1. 实验步骤

  1. 将6至8周龄的雌性肥大细胞缺乏型C57BL/6J-Cpa3Cre/+ (Cpa3Cre/+)小鼠与肥大细胞正常型C57BL/6J-Cpa3+/+（品系对照；Cpa3+/+）小鼠分别与BALB/c雄性小鼠交配。
  2. 在确认阴道栓后定义妊娠第0天（gd 0），并在确认阴道栓后立即对雌鼠进行处理。
    注：阴道栓是雄鼠精子在雌鼠阴道口形成的栓状物。
    1. 对对照组Cpa3+/+ 雌鼠腹腔注射250 µL PBS。
    2. 对肥大细胞缺乏型Cpa3Cre/+ 雌鼠腹腔注射250 µL抗CD122抗体（0.25 mg）。
      注：如先前研究所述22，注射0.25 mg抗CD122抗体可耗竭肥大细胞缺乏型Cpa3Cre/+ 雌鼠外周及子宫自然杀伤细胞（NKs和uNKs）。
  3. 等待至妊娠第5天（gd5）。
    注：在gd5时，最早可进行着床分析。
    1. 按照步骤2-5进行超声分析。
  4. 在妊娠第5、8、10、12和14天（gd5、8、10、12、14）进行超声成像。

2. 超声系统的准备

  1. 打开系统（图1A；后部主电源和左侧计算机待机按钮）、加热平台（图1B；控制面板上）和凝胶加热器（图1C）。
    注意：超声耦合剂需预热约 0.5 h。
  2. 确保异氟烷装置已充分填充（图1D）。
  3. 在浏览器中打开一个新研究或在现有研究中创建新序列。在研究信息窗口中填写所有必要信息（负责人、研究名称、序列名称、动物数据）。点击确定。
  4. 点击确定后，确认B模式成像窗口已出现，并且B模式成像自动开始。

3. 小鼠操作

  1. 小鼠麻醉
    1. 将小鼠放入击倒箱中（图1E），关闭箱盖，打开异氟烷管路至击倒箱，并开启异氟烷（浓度为3.5%）。
    2. 当小鼠进入麻醉状态后，降低异氟烷浓度至1.5%，并通过打开通向加热平台方向的管路，将气流重定向至加热平台，同时关闭通往击倒箱的气流。
      注意：为达到充分麻醉，应在小鼠不再活动后继续等待10秒。
    3. 迅速将小鼠从击倒箱转移至加热平台（图1F），保持其处于仰卧位，并轻轻将其鼻部置于平台顶部的麻醉鼻管中。
  2. 固定、脱毛及测量前准备
    1. 在小鼠双眼各滴涂一层眼用保护膏，以防止角膜干燥。
    2. 在加热平台上的四个铜电极区域（图1F）各滴加一滴导电胶。
    3. 使用手术胶带将小鼠四肢的足掌固定在加热平台涂有导电胶的电极区域。
    4. 持续监测心电图[理想值 = 450–550 次/分钟（BPM）]和呼吸生理状态。
      注意：可通过直肠探头测量体温，但此步骤非必需。
    5. 将脱毛膏涂抹于小鼠腹部，用棉签轻轻擦拭，并静置约1分钟。使用浸水纱布擦除脱毛膏。若毛发未完全去除，可重复此步骤。
    6. 在脱毛后的皮肤上涂抹预热的超声耦合剂。

4. 图像与视频的测量与采集

  1. 握住换能器（图1G）用手握住或将样本固定在固定装置中（图1H建议使用固定装置。
  2. 使用探头识别膀胱，并以其作为参考点。将探头移至腹部左右区域，追踪种植部位。
  3. B型超声用于二维灰阶图像中解剖结构的可视化
    1. 移动换能器或固定小鼠的加热平台，直至屏幕上显示的第一个植入位置达到最大尺寸且清晰可见。
      1. 选择 图像标签 并输入名称，或 帧存储 （无名称存储）用于存储单帧图像，或 Cine Store 用于存储整个植入过程的动态影像序列以进行测量。
    2. 移动探头或检查床，使胎盘处于可观察到脐动脉（UmA）血流的位置。存储单帧图像或动态影像循环（见步骤 4.3.1.1），用于胎盘测量。
      注意：胎盘测量可从妊娠第10天（gd10）开始进行。
    3. 使用相同方法继续完成所有植入操作。
  4. 彩色多普勒模式用于观察和确定血流方向
    1. 按压 颜色 按钮。
    2. 使用轨迹球将彩色框（此区域内的信号可见）移动至所需位置。如有必要，通过按压来调整框的大小 更新 向右/向上移动轨迹球可放大，向左/向下移动轨迹球可缩小。当方框大小合适时，按下 选择.
    3. 按照4.3.1.1步骤所述，保存单帧图像或动态图像序列。
  5. 脉冲波（PW）多普勒模式用于定量分析血流通过血管的情况 子宫动脉 （子宫动脉，UA）和UmA
    1. 在彩色多普勒采集图像中定位感兴趣区域。
      注意：脐动脉（UA）位于膀胱尾侧，而脐膜动脉（UmA）位于胎儿与胎盘之间。
    2. 按压 PW，将出现一条虚线。移动该线至目标血管，并使用“Doppler Angle”旋钮调整线的角度，使其与血流方向一致。按下 更新.
      注意：在所有动物中，血流方向与换能器之间的角度必须保持一致，尤其是在使用大于60°的角度时（本实验中，脐动脉采用70°，脐中动脉采用45°）。
    3. 在脉冲多普勒（PW Doppler）采集窗口中存储多普勒频谱线出现的动态图像序列（cineloop）。

5. 审核并完成数据采集以及保存序列

  1. 要查看数据，请点击 研究管理。滚动至感兴趣的缩略图，然后双击 更新。
  2. 首先点击 研究管理，然后在浏览器窗口中点击 关闭，以完成数据采集并保存已记录的序列。
    注意：关闭序列后，将无法再向该序列中存储帧或动态图像。

6. 数据采集后的小鼠处理

  1. 使用干燥的纱布从麻醉动物身上移除凝胶。
  2. 小心地从动物足部去除手术胶带。
  3. 关闭异氟烷气管（浓度为0%）。
  4. 在妊娠第5、8、10和12天进行以下超声分析。
    1. 将动物单独放置于笼中至少5分钟，使其有时间苏醒并恢复方向感。
    2. 将小鼠放回原始笼中。
      注意：在移除凝胶和手术胶带之前，切勿关闭异氟烷气源，因为小鼠在关闭异氟烷后约20秒内会迅速苏醒。
  5. 在妊娠第14天进行以下超声分析。
    1. 在雌鼠尚未苏醒前，通过颈椎脱位法将其处死。打开动物体腔，取出子宫，分离胚胎和胎盘，并测量胎儿和胎盘的重量。

7. 复制并导入数据

  1. 通过点击导出至并选择存储空间，将数据复制到硬盘上，以标记一个或多个序列。
  2. 在计算机上打开软件，点击从…复制，然后从硬盘中选择要导入软件的研究/序列。
  3. 使用软件分析数据。

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结果

本论文所用超声系统的各个组成部分如图1所示。图2展示了在妊娠第5、8、10和12天（gd5、8、10和12）以B模式获取的代表性超声图像(B)以及相应的着床区域测量结果(A)，显示从gd10开始，经抗CD122处理的Cpa3Cre/+ 小鼠的着床区域显著减小。

图3展示了在B模式下获取的植入部位各组成部分（底蜕膜、胎盘、胚胎）图像（图3A），以及进行的胎盘测量（面积、厚度、直径）（图3B）。与对照组WT小鼠相比，抗CD122处理的Cpa3Cre/+

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讨论

利用我们的超声系统，我们证实了从妊娠第10天（gd10）开始，MC/NK缺陷型母鼠出现胎儿生长受限。此外，在gd10和gd12时，我们观察到胎盘尺寸减小；在gd14时，部分uMC/uNK缺陷型小鼠胎儿的脐动脉（UmAs）出现舒张末期血流缺失或反向。这一血管化不良的征象与动脉显著增高的阻力指数相关，提示存在宫内生长受限（IUGR）。结果证实了uMCs和uNKs在妊娠维持、胎儿健康以及理解IUGR发展过程中的重要作用。

该方案适用于妊娠第5天（gd5）及之后的每一天（着床后）。方案中有一些关键步骤必须加以考虑。首先，脱毛操作必须谨慎进行。例如，脱毛膏与皮肤接触过度可能引起皮肤刺激；然而，脱毛不彻底会导致信号干扰，在屏幕上表现为阴影。信号不足（如出现阴影或图像颗粒感）的另一个原因可能是小鼠与超声波束之间使用的耦合胶用量过少。根据我们的经验，为获得足够的信号可见性，需要使用相对大量的耦合胶（约10 mL）。其次，二维测量在某种程度上容易产生误差。为了尽量减少不同着床部位之间的测量差异，建议在环绕着床部位测量时采用可达到的最大尺寸。为精确测量胎盘，所有着床部位均应调整至能够观察到脐动脉（Um...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们非常感谢成像仪器公司（特别是 Magdalena Steiner、Katrin Suppelt 和 Sandra Meyer）提供的愉快而迅速的支持，以及他们对我们关于成像系统及其使用方面所有问题的及时且全面的解答。我们感谢德国海德堡 DKFZ 的 Hans-Reimer Rodewald 教授和 Thorsten Feyerabend 博士提供了 Cpa3 品系。此外，我们感谢 Stefanie Langwisch 负责小鼠品系的管理，并生成了图 1 中的图片。

本工作及成像系统由德国研究基金会（DFG）向 A.C.Z. 提供的资助（ZE526/6-1 和 AZ526/6-2）支持，这些项目隶属于 DFG 优先计划 1394 "健康与疾病中的肥大细胞"。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LEAF 抗小鼠 CD122（IL-2Rb）BioLegend123204克隆 TM-β1；500 µg
Vevo 2100 系统 FujiFilm VisualSonics Inc.换能器 MS550D-0421
Vevo LAB 软件 FujiFilm VisualSonics Inc.
异氟烷BaxterPZN: 6497131
电极凝胶Parker12_8
手术胶带3M Transpore1527-1
眼药膏BayerPZN: 1578675
棉签Raucotupf11969100 支
脱毛膏Reckitt Benckiser2077626
敷料Nobamed Paul Danz AG85611010 x 10 cm
超声耦合剂Gello GmbH246000

参考文献

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