方法文章

一种用于识别与应激暴露相关表观遗传变化的大鼠甲基化测序平台

10K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58617

⸱

2018年10月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Psychiatry and Behavioral Sciences, Johns Hopkins School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins School of Medicine, 3Department of Mental Health, Johns Hopkins School of Public Health

本文内容

摘要

本文描述了使用大鼠模型的Methyl-Seq（一种表观基因组学平台）的实验方案及实施方法，旨在鉴定与慢性应激暴露相关的表观遗传学改变。结果表明，大鼠Methyl-Seq平台能够检测出应激暴露引起的大鼠DNA甲基化差异。

摘要

随着越来越多动物的基因组被测序完成，人们迫切需要能够捕捉这些动物模型中动态表观遗传变化的工具。大鼠是一种特别重要的模式动物，引入表观遗传学工具可为大量药理学和行为学研究提供深入的机制性信息。为此，我们针对大鼠优化了SureSelect靶向捕获系统（称为Methyl-Seq），该系统可用于评估大鼠基因组范围内的DNA甲基化水平。该大鼠设计覆盖了所有RefSeq基因的启动子区域、CpG岛、CpG岛岸区以及GC富集区域。

为了在大鼠实验中实施该平台，雄性Sprague Dawley大鼠接受了为期3周的慢性可变应激处理，随后采集血液样本用于基因组DNA提取。通过片段化、接头连接、靶向富集、亚硫酸氢盐转化和多重化等步骤，从大鼠DNA样本构建甲基化测序文库。文库在下一代测序平台上进行测序，对测序得到的读段进行分析，以鉴定应激大鼠与非应激大鼠之间DNA的差异甲基化区域（DMRs）。通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序对排名靠前的候选DMRs进行独立验证，以确认该平台的可靠性。

结果表明，大鼠甲基化测序平台是一种有效的表观遗传学工具，能够捕获由应激暴露所诱导的甲基化变化。

引言

高通量测序技术的进步已为模式生物和非模式生物提供了大量基因组序列。这些序列的可获取性极大地推动了遗传学、比较基因组学和转录组学的研究。例如，现有的基因组序列对于比对染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）实验中的测序数据非常有用，该实验通过富集与组蛋白修饰相关的DNA片段来进行分析1；此外，也可用于亚硫酸氢盐测序，后者通过检测由未甲基化胞嘧啶经亚硫酸氢盐转化形成的尿嘧啶来测定DNA甲基化水平2。然而，由于缺乏对物种特异性调控序列的功能注释数据，这些调控序列可能影响基因功能，因此在设计中整合现有基因组测序数据的表观基因组研究平台的发展受到了延迟。

特别是，DNA甲基化是DNA上研究最广泛的表观遗传修饰之一，可利用现有的基因组数据构建甲基化组学平台。一个典型的例子是基于芯片的人类甲基化组平台3，该平台已广泛应用于从肿瘤学到精神病学等多个研究领域4,5。然而，针对非人类动物模型的类似平台却十分匮乏，因为在这些平台的初始设计中，几乎没有任何广泛使用的平台充分利用了基因组序列信息。

评估非人类动物模型甲基化组景观的常用方法是简化基因组重亚硫酸盐测序（reduced representation bisulfite sequencing, RRBS）6。该方法克服了全基因组重亚硫酸盐测序的成本问题；尽管后者可提供全面的甲基化组图谱，但由于成本高昂以及基因组中大片基因贫乏区域的功能信息有限，其测序读长深度较低2。RRBS 通过限制性酶切和基因组 DNA 的片段大小筛选，富集高 GC 含量序列（例如通常位于基因启动子附近且被认为参与基因调控的 CpG 岛）7。尽管 RRBS 方法已在多项重要研究中得到应用，但其对限制性内切酶的依赖也存在显著的挑战和局限性。例如，RRBS 中对 GC 富集序列的富集完全依赖于限制性内切酶识别的特定序列的存在，以及后续通过电泳进行的片段大小筛选。这意味着在基因组中不含这些限制性酶切位点的区域将在大小筛选过程中被排除。此外，除非不同物种在相同基因座上具有相同的限制性酶切位点，否则跨物种比较将十分困难。

克服RRBS局限性的一种方法是采用富集技术，该技术在平台设计中利用已发表的基因组序列。基于芯片的人类研究平台使用针对特定CpG位点设计的引物探针，实现等位基因特异性（亚硫酸氢盐转化后CG与TG）靶向杂交和引物延伸。其设计不仅基于已知的人类基因组序列，还整合了来自ENCODE和ENSEMBL等多条研究途径实验验证的调控区域信息8。尽管该平台已广泛应用于人类甲基化组研究，但目前尚无适用于模式动物的类似平台。此外，基于芯片的格式对探针排布可用的表面积有显著限制。近年来，研究人员致力于结合捕获探针设计带来的靶向特异性与新一代测序的高通量优势。这一努力促成了针对小鼠基因组的基于测序的靶向富集系统（mouse Methyl-Seq）的开发，并已被用于鉴定脑特异性或糖皮质激素诱导的甲基化差异9,10。为了推动这些动物中的表观基因组学研究，尚需开发适用于其他模式及非模式动物的类似平台。

本文展示了利用这一新型平台对大鼠进行甲基化组分析的方法。大鼠在药理学、代谢、神经内分泌学和行为学研究中一直作为重要的动物模型。例如，目前迫切需要深入了解导致药物毒性、肥胖、应激反应或药物成瘾的潜在机制。若能建立一个可高效捕获与这些病理状态相关甲基化组变化的高通量平台，将有助于加深我们对相关机制的理解。由于大鼠基因组中仍缺乏对调控区域的注释，我们在大鼠Methyl-Seq平台中整合了非冗余启动子、CpG岛、CpG岛岸11以及先前鉴定的富含GC序列12。

为了评估SureSelect靶向富集（通常称为Methyl-Seq）平台在大鼠基因组中的成功设计与实施，我们采用了一种慢性可变应激（CVS）的大鼠模型13，以鉴定未应激与应激动物之间的差异甲基化区域。我们的平台设计、实验方案及实施方法可能对希望在基因组序列已知但注释尚不完善的大鼠中开展全面且无偏倚的表观遗传学研究的研究人员具有参考价值。

方案

所有实验均按照并遵守所有相关的监管和机构指南进行，包括约翰斯·霍普金斯医学院机构动物护理和使用委员会的规定。

1. 动物

  1. 在4周龄时获取雄性青春期Sprague-Dawley大鼠。将动物饲养在聚碳酸酯大鼠笼中，置于温度和湿度受控的环境中，光照周期为12小时光照、12小时黑暗，光照开始时间为0600时。为动物提供 随意摄取 饮水供应
  2. 让大鼠适应环境1周，以减少与运输相关的应激。将动物成对饲养（N=16），以避免隔离应激；在5周龄时开始进行为期3周的慢性可变应激（CVS）处理方案。

2. 慢性可变应激

  1. 每天上午（9–11 点）和下午（1–3 点）各进行一次 CVS 处理，时间安排应不规律，以保持不可预测性。需加入夜间轻度应激因素。CVS 处理包括：1）束缚于固定圆筒中 3 小时；2）游泳 10 分钟；3）笼具倾斜 3 小时；4）缓慢摇动平台 1 小时；以及 5）置于 4 °C 冷室中 1 小时。
    注意：夜间应激因素包括社会拥挤（每笼 5 只）、社会隔离、潮湿垫料、食物限制和光照开启。典型的每周应激处理时间表见表 1。

3. 内分泌检测

  1. 通过尾部采血（约 50 μL）测定皮质酮（CORT）水平，实验期间每周两次在相同时间（上午 9 点）采集血液样本，分别在慢性应激（CVS）方案开始前测定基础激素水平（第 0 天）、每周 CVS 中期（第 4、11 和 18 天）、每 7 天 CVS 结束后（第 7 和 14 天）以及 CVS 结束时（第 21 天）。每日应激处理前采集血液样本。
    1. 在安乐死期间（第 25 天）采集最后一次躯干血液样本，用于放射免疫分析（RIA）和基因组 DNA 提取。
  2. 将所有血液样本离心（600 × g，4 °C，10 分钟），以分离血浆与血细胞。用移液器吸取血浆（上清液），并将样本储存在 -80 °C。
  3. 解冻血浆后，采用放射免疫分析法（RIA）测定 CORT 水平。确保应激动物在 3 周内的血浆 CORT 水平升高，以验证应激方案的有效性。

4. 行为

  1. 在CVS处理方案后（第23–24天），利用高架十字迷宫（EPM）评估每只动物的焦虑样行为14。
  2. 使用视频摄像机记录动物在EPM装置上的行为300秒，并分析其在中心区、闭臂和开臂区域所花费的时间。

5. 大鼠甲基化测序实验设计

  1. 利用 UCSC 基因组浏览器，获取 CpG 岛及其岛岸（CpG 岛上下游 ±1 kb 区域）、每个 RefSeq 基因的启动子区（每个转录起始位点 TSS 上下游 ±1 kb 区域）以及其他可能来自相关文献的序列的非冗余基因组坐标（大鼠 2004 年 11 月 rn4 组装版本）。
    注意：对于大鼠 Methyl-Seq，还额外加入了先前基于芯片的甲基化平台中的其他 GC 富集序列12。对于长度大于 5 kbp 的区域，采用交替取样方式，即每 500 bp 取一段，随后跳过 1 kbp。最终的大鼠 Methyl-Seq 设计覆盖 111 Mbp，包含 230 万个 CpG 位点，平均区域大小为 594 bp，靶向 228,800 个独特基因座。
  2. 将整合后的基因组坐标列表输入商业化的靶向捕获设计软件，以进行适当的探针设计。

6. 从基因组DNA构建大鼠甲基化测序文库

注意：为消除批次效应，应同时处理多个样本，并相应扩大主混合液的配制量。使用市售的DNA提取试剂盒提取DNA。基于离心柱或沉淀的方法均可获得高质量的基因组DNA（260/280比值约为1.8）。不推荐使用含苯酚的方法。用低TE缓冲液（10 mM TE，0.1 mM EDTA，pH 8.0）洗脱或重悬DNA。

  1. 样品制备
    注意：使用DNA结合磁珠的每一步操作中，务必确保磁珠已在室温下平衡至少30分钟，并在使用前充分混匀。
    1. 剪切DNA
      1. 使用荧光计测定每个样本的初始双链DNA浓度。稀释 >在低DNA结合力的微量离心管中，用低TE缓冲液（10 mM TE，0.1 mM EDTA，pH 8.0）将1 µg基因组DNA定容至50 µL。
      2. 使用等温超声波破碎仪剪切样品（10% 占空比，5 强度，每脉冲 200 个周期，6 次循环，每次 60 秒，频率扫描，4 °C）。
      3. 使用基于电泳的系统评估DNA质量，该系统可测量DNA片段大小和数量。
        注意：建议的DNA用量为1 µg或3 µg。若起始材料有限，应采用最低输入量 >500 ng，因为较低的量会影响所构建文库的数量和质量。
    2. 修复DNA末端。
      1. 使用大鼠Methyl-Seq试剂盒在冰上配制末端修复主混合液。向每个样本中加入52 µL混合液，在无加热盖的热循环仪中孵育（20 °C孵育30分钟，然后4 °C保存）。
        末端修复主混合液（每份样品）：
        35.2 µL 水
        10 µL 末端修复缓冲液（10x）
        1.6 µL dNTP混合液
        1 µL T4 DNA聚合酶
        2 µL Klenow DNA聚合酶
        2.2 µL T4 多核苷酸激酶
      2. 使用180 µL DNA结合磁珠和每份样本400 µL新配制的70%乙醇纯化样本。向每份样本中加入180 µL磁珠，室温孵育5分钟。磁力分离磁珠，弃上清液，将磁珠沉淀重悬于200 µL 70%乙醇中。去除乙醇，重复洗涤一次。
      3. 使用磁力架沉淀磁珠，并尽可能去除乙醇。在37 °C金属浴中干燥3–5分钟，直至磁珠完全干燥。加入44 µL无核酸酶水重悬，收集约42 µL上清液。
        停止点：DNA末端修复完成后，样品可密封并保存于-20 °C。
    3. 对3’末端进行腺苷酸化。
      1. 在冰上配制腺苷酰化主混合液。向每个样本中加入9 µL混合液，在无加热盖的热循环仪中孵育（37 °C孵育30分钟，然后4 °C保存）。
        腺苷酰化主混合液（每份样品）：
        5 µL Klenow缓冲液
        1 µL dATP
        3 µL Klenow DNA聚合酶
      2. 使用90 µL DNA结合磁珠和400 µL新鲜配制的70%乙醇对样品进行纯化。向每个样品中加入90 µL磁珠，室温孵育5分钟。磁力富集磁珠，弃上清液，将沉淀重悬于200 µL 70%乙醇中。去除乙醇并重复洗涤一次。
      3. 使用磁力架沉淀磁珠，并尽可能去除乙醇。在37 °C金属浴中干燥3–5分钟，直至磁珠完全干燥。加入35 µL无核酸酶水重悬磁珠，收集约33.5 µL上清液。
    4. 连接甲基化接头。
      1. 在冰上配制连接反应主混合液，每份样品中加入16.5 µL混合液。在无加热盖的热循环仪中孵育（20 °C 反应15分钟，然后4 °C 保存）。
        连接反应主混合液（每份样品）：
        2.5 µL 水
        2.5 µL 甲基化测序甲基化接头
        10 µL T4 DNA连接酶缓冲液（5x）
        1.5 µL T4 DNA连接酶
      2. 使用90 µL DNA结合磁珠和400 µL新鲜配制的70%乙醇对样品进行纯化。向每个样品中加入90 µL磁珠，在室温下孵育5分钟。离心收集磁珠，弃去上清液，将沉淀重悬于200 µL 70%乙醇中。去除乙醇并重复洗涤一次。
      3. 使用磁力架沉淀磁珠，并尽可能吸除乙醇。在37 °C金属浴中干燥3–5分钟，直至磁珠完全干燥。加入22 µL无核酸酶水重悬磁珠，收集约22 µL上清液。使用生物分析仪评估质量。
        注意：如果DNA总量少于500 ng，在进行后续步骤前需剪切并处理额外的DNA。如果DNA平均片段大小未增加超过30 bp，请检查试剂是否为新配制，因为T4 DNA聚合酶、Klenow片段和/或T4连接酶可能已失活。
        停止点：连接甲基化接头后，样品可密封并保存于 -20 °C。
  2. 杂交
    1. 将样品转移至低吸附型微量离心管中，使用加热真空浓缩仪将样品体积浓缩至小于3.4 µL，随后将样品重新定容至3.4 µL。
      注意：将样品浓缩至约 3 µL，以确保在所有液体完全蒸发前能从真空浓缩仪中取出样品。
    2. 在室温下配制杂交缓冲液，冰上配制甲基化测序阻断混合液。向每个样本中加入5.6 µL甲基化测序阻断混合液，置于热循环仪中孵育（95 °C 5分钟，65 °C 2分钟，然后保持65 °C）。
      杂交缓冲液（每份样品）：
      6.63 µL Methyl-Seq Hyb 1
      0.27 µL Methyl-Seq Hyb 2
      2.65 µL Methyl-Seq Hyb 3
      3.45 µL Methyl-Seq Hyb 4
      甲基化测序阻断液（每份样本）：
      2.5 µL Methyl-Seq Indexing Block 1
      2.5 µL Methyl-Seq Block 2
      0.6 µL Methyl-Seq Block 3
    3. 配制RNase阻断混合液和捕获文库杂交混合液。向每个样本中加入20 µL捕获文库杂交混合液，于65 °C孵育至少16小时。
      RNase抑制剂混合液（每样本）：
      0.5 µL RNase Block
      1.5 µL 水
      捕获文库杂交混合液（每样本）：
      13 µL 杂交缓冲液
      2 µL RNase Block Mix
      5 µL 大鼠甲基化测序捕获文库
      注意： 保持反应在 65 °C 加入杂交混合液时，以防止非特异性结合。
    4. 将每份样品50 µL链霉亲和素磁珠分装至新的8孔联管中。用200 µL甲基化测序结合缓冲液洗涤磁珠。每次洗涤后，使用磁力架沉降磁珠并弃去上清液，共洗涤3次。最后一次洗涤后，将链霉亲和素磁珠重悬于200 µL甲基化测序结合缓冲液中。
    5. 将样品加入200 µL经洗涤的链霉亲和素磁珠中，使用旋转混合器在室温下孵育30分钟。孵育期间，每份样品向96孔板中三个复孔分别加入200 µL Methyl-Seq Wash Buffer 2，并放入热循环仪中预热至65 °C。
    6. 孵育后，使用磁力板沉淀链霉亲和素磁珠，并将磁珠重悬于200 µL Methyl-Seq洗涤缓冲液1中。室温孵育15分钟。用磁力板沉淀磁珠并弃去上清液。
    7. 用Methyl-Seq洗涤缓冲液2洗涤磁珠3次：将磁珠沉淀重悬于200 µL洗涤缓冲液2中（于步骤6.2.5预热），在热循环仪中孵育磁珠（65 °C，10分钟），然后收集磁珠。每次洗涤后使用磁力架弃去上清液。
      注意：加入洗涤缓冲液2时，应保持杂交反应温度为65 °C，以防止非特异性结合。
    8. 向洗涤后的磁珠中加入20 µL Methyl-Seq洗脱缓冲液，室温孵育20分钟。使用磁力架收集磁珠，将上清液转移至新的PCR条管中。弃去磁珠。
      注意：孵育期间，请准备亚硫酸氢盐转化试剂。
  3. 亚硫酸氢盐转化
    注意： 使用市售的亚硫酸氢盐转化试剂盒及其配套试剂和说明书，对洗脱的单链DNA进行亚硫酸氢盐转化。
    1. 将130 µL已配制的亚硫酸氢盐转化试剂加入上一步的上清液中。将每份150 µL反应液均分至两个孔中。在PCR仪中孵育（64 °C孵育2.5小时，然后4 °C保存）。
      注意：将150 µL反应液均分至两个独立的孔中，以确保温度均匀。孵育2.5小时后，立即进行下一步操作。
    2. 将样本与600 µL结合缓冲液加入旋转柱中结合，并用100 µL洗涤缓冲液洗涤一次。离心柱子（15,000 x g所有亚硫酸氢盐转化步骤之间（1 分钟）暂停，并弃去流穿液。
    3. 向柱中加入 200 µL 脱磺酸化缓冲液以脱磺酸化样品。室温孵育 15–20 分钟。重复离心，弃去穿流液。
    4. 用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤柱两次。向每根柱中加入 10 µL 洗脱缓冲液，室温孵育 3 分钟，然后离心（15,000 x g，1 分钟）。重复洗脱步骤，共 20 µL。
    5. 在冰上配制PCR反应主混合液1。向每个样本中加入82 µL混合液。在PCR仪中按照以下程序进行孵育。
      PCR反应主混合液1（每份样品）：
      30 µL 水
      50 µL Methyl-Seq PCR预混液
      1 µL Methyl-Seq PCR1 引物 F
      1 µL Methyl-Seq PCR1 引物 R
      热循环仪程序：
      第1阶段，1个循环：95 °C 2分钟
      第二阶段，8个循环：95 °C 30秒，60 °C 30秒，72 °C 30秒
      第3阶段，1个循环：72 °C 7分钟
      第4阶段，1个循环：4 °C 保持
    6. 使用180 µL DNA结合磁珠和400 µL新鲜配制的70%乙醇对样品进行纯化。向每个样品中加入180 µL磁珠，室温孵育5分钟。离心收集磁珠，弃上清液，将磁珠沉淀重悬于200 µL 70%乙醇中。去除乙醇，重复洗涤一次。
    7. 使用磁力架沉淀磁珠，并尽可能去除乙醇。在37 °C金属浴中干燥3–5分钟，直至磁珠完全干燥。加入21 µL无核酸酶水重悬磁珠，收集约19.5 µL上清液。
  4. 索引
    1. 在冰上配制PCR反应主混合液2。向每个样本中加入25.5 µL主混合液2。向各个样本中加入5 µL商业索引引物，并在热循环仪中孵育。
      PCR反应主混合液2（每份样品）：
      25 µL Methyl-Seq PCR主混合液
      0.5 µL Methyl-Seq通用索引引物
      热循环仪程序：
      第1阶段，1个循环：95 °C 2分钟
      第二阶段，6个循环：95 °C 30秒，60 °C 30秒，72 °C 30秒
      第3阶段，1个循环：72 °C 7分钟
      第4阶段，1个循环：4 °C 保持
      注意：如果起始 DNA 浓度低于推荐值，可能需要增加 2 - 3 个循环。
    2. 使用90 µL DNA结合磁珠和400 µL新鲜配制的70%乙醇对样品进行纯化。向每个样品中加入90 µL磁珠，在室温下孵育5分钟。离心收集磁珠，弃去上清液，将沉淀重悬于200 µL 70%乙醇中。去除乙醇并重复洗涤一次。
    3. 使用磁力架沉淀磁珠，并尽可能去除乙醇。在37 °C金属浴中干燥3–5分钟，直至磁珠完全干燥。加入24 µL无核酸酶水重悬磁珠，收集约24 µL上清液。
    4. 使用生物分析仪上的高灵敏度DNA检测试剂评估浓度和碱基对大小。
      注意：如果生物分析仪未能检测到文库DNA的存在，则需使用额外的DNA重复制备步骤。
      暂停点：纯化后，带有索引的样本可密封并保存于 -20 °C。
    5. 根据所使用的适当下一代测序平台合并样本。
      1. 根据生物分析仪提供的浓度数据（该数据基于特定体积内文库的大小和数量来确定DNA摩尔浓度），用低TE缓冲液（6.1.1.1）稀释各样本，并将所有样本混合至终浓度为15 pM。
        注意：使用靶向连接接头的引物进行定量实时 PCR，是定量文库的一种更灵敏的方法。
      2. 在下一代测序仪上，将混合样本上样至足够容纳每泳道4个样本的泳道数量进行测序。
        注意：例如，若16个文库样本已使用唯一索引进行标记并混合，则可将文库分至4个泳道运行，相当于每个泳道4个样本。

7. 在下一代测序仪上进行测序

  1. 将样本送至机构测序中心，进行甲基化测序文库的簇生成，随后在下一代测序仪上进行测序。

8. 分析以鉴定差异甲基化区域（DMRs）

  1. 使用Bismark15（其调用Bowtie 2.0作为内部序列比对工具16,17）将原始测序读段比对至经亚硫酸氢盐转化的正链基因组。比对完成后，利用Bismark_methylation_extractor进行质量控制，并为每个CpG位点分配估计的甲基化值。
  2. 在Bioconductor中使用BS-Seq软件包18生成差异甲基化区域（DMR）列表。根据包含超过3个连续CpG位点且P值<0.05的条件对DMR进行筛选。
    注意：生成的DMR列表应包括基因组坐标、到最近RefSeq基因的距离、每个DMR内的CpG数量、两个比较组（例如，应激组与非应激组）在该DMR区域的平均CpG甲基化百分比、P值以及FDR（错误发现率）值。利用该DMR列表（即基因组坐标）设计焦磷酸测序引物以进行验证。

9. 亚硫酸氢盐焦磷酸测序验证

  1. 引物设计
    1. 设计用于亚硫酸氢盐PCR和焦磷酸测序的引物。设计两组PCR引物（外侧引物和巢式引物），使巢式PCR扩增DMR区域中150–400 bp的片段。
      注意：通常设计的引物至少为24个碱基长，并包含至少4–5个非连续的G（对于反向引物为C），以补偿因序列复杂性降低而导致的退火温度下降。其中一条巢式引物需进行生物素标记并经HPLC纯化。然而，应首先订购标准引物，通过琼脂糖凝胶电泳分析反应结果来优化PCR步骤。
      1. 设计焦磷酸测序引物时，应使其靶向互补的生物素化链，位置位于待检测CpG位点上游1–2个碱基处。根据需要设计多个焦磷酸测序引物，因为每个焦磷酸测序引物可稳定检测下游约30 bp的序列。
    2. 对于Rt1-m4，使用以下引物序列：
      rRT1M4 外侧 – F TGTAYGATTTTGGTTATYGTAAAT
      rRT1M4 外侧 – R AACTTACAAATTTCACCAACTCA
      rRT1M4 巢式 – F GTGGGTTAYGTGGATAATATATAG
      rRT1M4 巢式 – R AATCACTTACCATTCTCTCTCTAACTA
      rRT1M4 Pyro1 TAYGTGGATAATATATAGAT
      rRT1M4 Pyro2 GATAGTTATTTGGYGAGTTAG
      rRT1M4 Pyro3 GAGTATTTGGAGGAGTTGAT
      rRT1M4 Pyro4 GGATTTTAATATTTGGT
  2. 使用市售试剂盒对大鼠血液基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化。
    注意：亚硫酸氢盐转化步骤基于市售试剂盒的方案，并进行了如下修改：在第1步中，加入50–100 ng血液基因组DNA，并用水稀释至20 µL。在第9步中，每样本洗脱20 µL。
    1. 根据制造商说明书配制亚硫酸氢盐转化试剂，并与稀释后的基因组DNA混合。在热循环仪中孵育（64 °C孵育2.5小时，4 °C保存）。
    2. 将结合缓冲液加入转化后的基因组DNA中，转移至离心柱中并离心（15,000 x g，1分钟）。洗涤一次后，向离心柱中加入脱磺酸缓冲液，在室温下孵育15分钟。再次离心（15,000 x g，1分钟）。
    3. 用洗涤缓冲液洗涤离心柱并离心（15,000 x g，1分钟）。重复洗涤步骤并离心（15,000 x g，2分钟）。加入20 µL洗脱缓冲液，离心（15,000 x g，1分钟）以完成洗脱。
  3. PCR扩增
    1. 配制外侧PCR主混合液。将21.5 µL主混合液加入3.5 µL亚硫酸氢盐转化后的基因组DNA中，并运行热循环程序。
      外侧PCR主混合液：
      16.25 µL 水
      2.5 µL 聚合酶缓冲液 [10x]
      0.5 µL dNTP [10 mM]
      1 µL 正向引物 [0.1 µM]
      1 µL 反向引物 [0.1 µM]
      0.25 µL Taq DNA聚合酶 [5000 U/mL]。
      热循环程序：
      第一阶段，1个循环：94 °C 4分钟
      第二阶段，47个循环：94 °C 1分钟，53 °C 30秒，72 °C 1分钟
      第三阶段，1个循环：72 °C 8分钟，4 °C 保存
    2. 配制巢式PCR主混合液。将23 µL主混合液加入2 µL外侧PCR产物中，并重复使用外侧PCR的热循环程序。通过凝胶电泳（1x TAE缓冲液，1%琼脂糖凝胶）评估PCR产物质量。
      巢式PCR主混合液：
      17.75 µL 水
      2.5 µL 聚合酶缓冲液 [10x]
      0.5 µL dNTP [10 mM]
      1 µL 正向引物 [0.1 µM]
      1 µL 反向引物 [0.1 µM]
      0.25 µL Taq DNA聚合酶 [5000 U/mL]
      注意：在巢式PCR中，正向或反向引物之一必须进行生物素标记。
  4. 焦磷酸测序
    1. 为每个样本配制主混合液，包含38 µL结合缓冲液、35 µL水和2 µL链霉亲和素包被的Sepharose珠。在96孔板中，每孔加入75 µL主混合液和5 µL巢式PCR产物。在板式振荡器上振荡15–60分钟。
    2. 振荡过程中，将12 µL引物（0.5 µM，用退火缓冲液稀释）加入焦磷酸测序分析板的各孔中。
    3. 振荡结束后，使用结合反应洗涤缓冲液进行洗涤步骤。将真空工具置于盛有水的槽中，然后从板中收集样本。将真空工具依次浸入盛有70%乙醇、NaOH（0.2 M）和醋酸盐-Tris缓冲液（10 mM，pH 7.4）的半满槽中。断开真空后，将真空工具置于HS分析板上以转移磁珠。
    4. 将板置于加热块上，在80 °C孵育2分钟。孵育后让板冷却5分钟，然后开始焦磷酸测序程序。

结果

大鼠甲基化测序平台的成功实施依赖于多个标准。图1展示了本研究的整体工作流程，并强调了在进入下一步之前所需的关键质量控制（QC）步骤。首先需要考虑的因素之一是动物模型和应激方案的可靠性，这些因素决定了甲基化组范围内表观遗传变化的程度。由于我们的动物实验基于先前的观察结果，即皮质酮（CORT）暴露可导致DNA甲基化发生变化19,20，因此我们所采用的慢性可变应激（CVS）方案必须具有足够的强度，以产生血浆CORT水平升高的应激大鼠。典型的每周CVS方案见表1，包括每天上午、下午和夜间持续变换的应激刺激，以防止动物产生适应性并减弱应激反应。在为期3周的应激过程中，应激组动物的平均血浆CORT水平显著高于未应激的对照组动物[第4–21天，对照组：32.7 ± 3.7 ng/mL，应激组：103.0 ± 11.9 ng/mL（均值±标准误），P = 2.2 × 10-4，图2A]。一致地，这些动物在高架十字迷宫（EPM）测试中也表现出更强的焦虑样行为，表现为在闭臂中停留的时间显著更长，而在开臂中停留的时间更短（图2B）。这些结果表明，CVS暴露引起了显著的内分泌和行为改变，促使我们进一步探究这些变化是否与特定的DNA甲基化特征相关。

我们强调几个对于成功构建 Methyl-Seq 文库至关重要的关键步骤。起始 DNA 量必须充足，因为超声处理、多次洗涤/纯化、靶标富集以及亚硫酸氢盐转化等步骤会逐步减少最终文库中的 DNA 量。尽管多个 PCR 扩增步骤可缓解 DNA 模板的损失，但过多的 PCR 循环次数可能导致重复序列读数增加。在本项大鼠 Methyl-Seq 研究中，每只大鼠使用了 2 μg 血液基因组 DNA。需要注意的是，Methyl-Seq 文库的起始 DNA 量可低至 500 ng。使用较少起始材料可使研究人员利用 FACS（荧光激活细胞分选）或穿刺针获取的 DNA 制备文库，但存在产生文库量不足以进行后续测序的风险。通过在生物分析仪上对 1 μL 样品进行电泳来执行质量控制（QC），以获得 DNA 分子量、浓度和摩尔浓度。使用生物分析仪进行检测的三个关键步骤包括：1）超声处理后，确认 DNA 被充分打断（约 170 bp，红色，图 3）；2）接头连接后，观察到打断 DNA 的平均片段大小发生偏移（约 200 bp，蓝色，图 3），以确保其后续可通过 PCR 有效扩增；3）最终文库纯化后，确认文库的产量和片段大小是否满足测序要求。

使用 Bioconductor 中的 R 软件包 BSSeq 和 BSmooth 分析亚硫酸氢盐测序数据18。这些软件包包含用于序列比对、质量控制以及识别差异甲基化区域（DMRs）的工具和方法。BSmooth 软件调用 Bowtie 2.016,17 作为内部序列比对工具，通过将原始测序读段比对至经亚硫酸氢盐转化的基因组序列，获得 CpG 位点水平的测量汇总结果。比对后的读段需经过严格的质量控制流程进行过滤，以识别可能影响下游分析的系统性测序错误和碱基识别错误。该过程会生成一系列图表，用于辅助可视化过滤。同时还会生成测序指标，记录相关参数信息，如比对读段数量、目标区域百分比（% target）以及每个 CpG 位点的覆盖度等（表 2）。数据过滤完成后，将执行平滑/标准化算法，基于每个样本的所有质控后读段以及邻近 CpG 位点的估计值，为每个 CpG 位点分配一个估计的甲基化值，从而在测序覆盖度较低的情况下也能更准确地判断甲基化状态。该值提供了每个 CpG 位点甲基化概率的平滑估计。通过比较两组处理样本间平滑甲基化估计值的均值，并将基因组区域按差异显著性从高到低排序，即可生成差异甲基化区域列表（表 3）。

在应激组与非应激组之间，最显著的差异甲基化区域（DMR）位于大鼠主要组织相容性基因 Rt1-m4 的启动子区，所有CpG位点的甲基化水平在应激动物中均高于非应激动物（图4A）。为验证Methyl-Seq平台及其数据分析的成功实施，针对该DMR设计了引物，并通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序法检测了全部应激与非应激动物队列（8只经Methyl-Seq测序，8只未测序）的血液DNA甲基化水平。结果显示，在检测的12个CpG位点中的10个位点上，DNA甲基化水平显著升高（甲基化百分比变化为5.1–10.4，P <0.037，图4B）。对所有名义上显著的DMR进行了KEGG通路分析，以鉴定与应激相关的通路。结果一致显示，与DMR相关的通路涉及长期应激暴露相关疾病，如糖尿病、心血管疾病和癌症（表4）。21,22,23 为证明表观遗传数据与应激暴露程度之间的关联，将CpG-10的甲基化水平与每只动物平均3周的皮质酮（CORT）水平进行比较。结果表明内分泌数据与甲基化数据之间存在适度相关性（R2=0.54，P=0.001，图5）。

大鼠应激DNA分析流程图；甲基化测序、亚硫酸氢盐转化、测序、验证步骤。
图1：大鼠甲基化测序平台的整体示意图工作流程。 从应激组和对照组大鼠血液中提取的1 μg基因组DNA首先用于构建甲基化测序文库，以进行测序、分析和靶点鉴定。另外100 ng DNA用于通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序对鉴定出的表观遗传靶点进行独立验证。 请点击此处查看该图的放大版本。

对照组与应激组大鼠的血浆皮质酮水平、高架十字迷宫结果、图表、CVS 研究。
图 2：慢性可变应激（CVS）导致大鼠出现内分泌和行为改变。（A）多次检测皮质酮（CORT）水平表明为期 3 周的 CVS 方案具有显著效应。血液样本于每日应激处理前的早晨采集。（B）应激组动物在高架十字迷宫（EPM）的闭臂中停留时间更长，在开臂中停留时间更短。图中显示包含每只动物数据点的箱形图。采用 Student t 检验进行统计学分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。请点击此处查看该图的高清版本。

DNA荧光分析图，DNA片段大小分布，荧光单位与碱基对示意图。
图3：利用生物分析仪对剪切后并连接接头的鼠源DNA进行定量分析。 红色和蓝色曲线分别显示基因组DNA在等温超声破碎后以及连接接头后的数量和片段大小。每条曲线代表一个样本，红蓝曲线的变化反映了在末端修复、3'端腺苷化及样本纯化等多个步骤中DNA的损失，以及由于接头连接导致的碱基对长度增加。在25 bp和1500 bp处的尖锐峰为加入上样缓冲液中的标准标记物。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA甲基化分析；A) 趋势图，B) 柱状图；对照组与应激组中的CpG位点。
图4：通过大鼠Methyl-Seq检测到由CVS诱导的表观遗传改变。（A）大鼠Methyl-Seq数据分析表明，Rt1m4基因的启动子区在应激组（红色）与对照组（蓝色）大鼠之间为差异甲基化区域（DMR）。Rt1m4 DMR的图形输出（粉红色阴影区域）显示了每个CpG位点（垂直灰色线）、每组中的四个样本（红色或蓝色线）以及每只动物的甲基化百分比水平（红色或蓝色点）。（B）通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序验证了DMR内的12个CpG位点。柱状图以均值±标准误（SEM）表示，并采用Student's T检验进行统计学显著性分析。*P<0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。

DNA甲基化与血浆CORT散点图；线性相关性，R²=0.54，P=0.001。
图5：线性回归分析显示，应激组和对照组动物（N=16）在Rt1m4基因CpG-10位点的DNA甲基化百分比与3周平均血浆CORT水平之间存在适度相关性。应激组动物的数据以红色圆圈表示。 请点击此处查看该图的放大版本。

周第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天
上午束缚游泳低温室游泳束缚摇床游泳
下午摇床笼具倾斜束缚摇床低温室束缚低温室
过夜食物限制潮湿垫料隔离光照开启拥挤光照开启潮湿垫料

表1：慢性可变应激方案（CVS）的典型每周时间表。

测序指标应激1对照1
 (n = 4)(n = 4)
成对末端读段 (PER)89,290,39780,165,674
唯一比对的成对末端读段 (UMPER)39,200,25535,013,406
比对率/比对效率 (UMPER/PER)44%44%
重复读段 (% of UMPER)73%65%
去重后的UMPER10,481,03112,306,018
平均读段深度覆盖度 (x) (ARDC)6x6x
CpG位点数量 (N)12,056,87812,056,878
CpG位点的平均读段深度覆盖度 (x) (ARDC)2x2x
至少10条读段覆盖的CpG位点 (N)481,383595,850
至少10条读段覆盖的CpG位点的平均读段深度覆盖度 (x)1919
靶上CpG位点（与探针靶区完全重叠）1,923,8722,007,638
靶上CpG位点的平均读段深度覆盖度 (x)7x8x
至少10条读段覆盖的靶上CpG位点 (N)428,249531,419
至少10条读段覆盖的靶上CpG位点的平均读段深度覆盖度 (x)18x18x
靶上读段（与探针靶区至少1个碱基对重叠的PER）(UMPER)8,277,7159,369,523
靶上比例（占去重后UMPER的比例）78%77%
靶上（比对的总碱基数）Mb125 Mb128 Mb
靶上平均读段深度覆盖度 (x) (ARDC)9x10x
1测序指标基于每组内个体的平均值计算

表2：从大鼠甲基化测序平台获得的测序指标。

染色体起始位置终止位置基因距离区域统计值平均差异胁迫组对照组方向
chr201,644,2461,644,390RT1-M4in_gene93.030.220.330.11获得
chr5160,361,352160,361,564LOC690911in_gene-70.75-0.190.720.91丢失
chr361,138,28161,138,330RGD156431926556961.790.210.940.72获得
chr2143,064,811143,065,010Ufm18569-59.48-0.110.130.24丢失
chr730,764,11130,764,284Ntn4in_gene57.040.210.940.73获得
chr1712,469,11212,469,218Idnk41996-50.91-0.130.740.88丢失
chr747,101,72547,101,930Pawrin_gene-50.54-0.120.640.76丢失
chr576,111,24876,111,822Txndc8151703-50.38-0.110.850.96丢失
chr1180,640,13280,640,356Dgkgin_gene-50.07-0.160.730.89丢失
chr871,759,24871,759,411Mir190210226-47.84-0.170.580.75丢失

表3：前10个差异甲基化区域。 对于每个DMR，输出表格从左到右依次显示：染色体位置（chr）、坐标（起始/终止）、基因名称、与转录起始位点的距离、应激组与对照组之间的差异区域统计值（areaStat）、平均差异甲基化水平（meanDiff）、每个DMR在应激组和对照组中的平均甲基化水平（应激组/对照组），以及相对于对照组的甲基化变化方向。

KEGG 通路术语基因数%P 值Benjamini
糖尿病
2 型糖尿病120.13.6 x 10-49.8 x 10-3
心血管疾病
血管平滑肌收缩180.11.6 x 10-33.6 x 10-2
致心律失常性右室心肌病（ARVC）130.14.0 x 10-37.1 x 10-2
扩张型心肌病140.17.6 x 10-31.2 x 10-1
神经元功能
长时程增强作用110.11.5 x 10-21.4 x 10-1
信号通路
MAPK 信号通路350.22.4 x 10-49.9 x 10-3
钙信号通路220.11.2 x 10-21.4 x 10-1
趋化因子信号通路210.11.2 x 10-21.3 x 10-1
癌症
癌症中的通路420.34.1 x 10-53.4 x 10-3
胶质瘤150.14.4 x 10-52.4 x 10-3
非小细胞肺癌100.17.9 x 10-31.1 x 10-1
结直肠癌130.18.4 x 10-31.1 x 10-1
慢性髓性白血病120.11.2 x 10-21.3 x 10-1

表4：基于大鼠甲基化测序鉴定出的差异甲基化区域的KEGG通路分析。

讨论

在本研究中，我们设计并实现了针对大鼠基因组的Methyl-Seq平台。通过在应激大鼠模型中验证其应用价值，我们证明该实验与分析流程能够鉴定出两个比较组之间的差异甲基化区域。

为确保该平台的成功实施，需遵循若干关键步骤。首先，初始DNA的质量和数量对最终Methyl-Seq文库的质量和数量具有显著影响。我们采用荧光计而非分光光度计进行测量，以确保所测得的DNA量能准确反映双链DNA的实际含量。在DNA片段化后以及接头连接后，使用生物分析仪（Bioanalyzer）检测DNA的分子大小和数量。验证这两个步骤之间分子大小的"偏移"至关重要，以确认每个DNA片段末端均成功连接了接头，从而保证后续步骤中可进行接头介导的PCR扩增。接头连接步骤结束时剩余DNA的量同样重要，因为此阶段至少需要100 ng的文库产物，以确保在靶向富集和亚硫酸氢盐转化步骤后仍有足够量的DNA可供使用。对构建完成的Methyl-Seq文库进行最终的高灵敏度检测，以便将其准确稀释至适合在下一代测序仪上进行簇生成的浓度。最后，采用亚硫酸氢盐焦磷酸测序法作为高定量性的独立方法，评估分析流程的准确性。使用原始样本进行最终验证，并利用额外动物样本进行重复实验，是确保本实验能够检测到DNA甲基化中具有生物学意义变化的关键步骤。

若在实验过程中出现偏离方案或遇到问题，我们还提供了一些应对建议。首先，在末端修复、接头连接或磁珠纯化步骤中，可能会损失过多的 DNA。此外，由于组织或 DNA 量有限，或采用了如荧光激活细胞分选等富集方法，起始 DNA 量可能较少（<200 ng）。在此情况下，可适当增加文库扩增步骤中的循环次数，以弥补 DNA 损失过多或起始量偏低的问题。但建议额外增加的循环数不超过 2–3 个，因为过度扩增模板可能导致测序中重复序列读段（duplicate reads）数量上升。这些重复读段在比对步骤中会被剔除，以避免对甲基化百分比计算造成偏差。其次，若 DNA 平均片段长度增加未超过 30 bp，应检查所用试剂是否新鲜，因为 T4 DNA 聚合酶、Klenow 酶和/或 T4 连接酶可能已失活。此时可使用商业化的替代试剂。

此外，预测的差异甲基化区域（DMRs）可能在焦磷酸测序验证中无法成立，即DNA甲基化差异实际上并不存在，或显著小于分析所预测的差异。候选区域验证率低是许多全基因组分析中常见的问题，例如焦磷酸测序结果未能证实存在差异甲基化，或效应量远小于分析预测值。BSmooth 是一种分析工具包， "平滑" 多个CpG位点窗口内的甲基化水平。在本实验中，BSmooth鉴定出一个差异甲基化区域（DMR），其甲基化水平通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序得到验证。然而，BSmooth预测的甲基化水平与焦磷酸测序验证结果之间可能存在差异。这些差异源于BSmooth的平滑函数，该函数对DMR内所有CpG位点的甲基化值进行平均估计，包括那些DNA甲基化差异可能超过50%的连续CpG位点，或因测序深度低于阈值而被排除的CpG位点。类似MethylKit的R软件包24 可用于鉴定较小的CpG区域，甚至单个CpG位点，其甲基化水平与焦磷酸测序验证的结果高度相关。通过采用不同的分析软件包，并利用焦磷酸测序检测其预测的差异甲基化区域或CpG位点，可确保数据的稳健性。 alternatively，原始的Methyl-Seq文库可重新测序，并将新增的测序数据合并至原有的reads文件中，以提高测序深度。由于甲基化水平的测定属于半定量性质，其数值由reads数量决定［即（CpG数量）/（TpG数量 + CpG数量）］，因此增加特定CpG位点的测序深度将提高其甲基化百分比值的准确性。在本研究中，我们仅纳入那些甲基化水平由至少10条reads确定的CpG位点，并实现了每个CpG位点平均19倍的测序覆盖深度。

大鼠 Methyl-Seq 平台并非没有局限性。虽然它比全基因组重亚硫酸盐测序更具成本效益，但其成本明显高于其他方法。然而，大部分费用来自测序仪的测序通道租用，而非捕获系统本身。根据所需的测序深度，由于不同组织间的DNA甲基化差异较大（25–70%）12，在进行跨组织比较时所需深度较低，因此可通过每通道多重化更多样本并使用更高通量的测序平台来降低成本。此外，样本制备过程比其他方法更耗时。尽管该方法与其他结合了下一代测序的下拉（pulldown）技术类似，但额外的重亚硫酸盐转化和纯化步骤增加了工作量。总体而言，Methyl-Seq 平台是一种相较于全基因组测序更具成本效益的替代方案，能够以单碱基对分辨率检测超过230万个CpG位点，远多于基于微阵列平台所能检测的数量。迄今为止，商业化的人和小鼠 Methyl-Seq 平台已被用于记录酒精依赖对猕猴脑部的影响25,26、小鼠脑中神经发育相关基因的变化9，以及糖皮质激素在血液与脑部作用靶点的研究10。此外，该平台能够靶向特定区域，而不受限制性内切酶序列识别的限制，因此非常适合跨物种比较研究。在本研究中，我们针对大鼠设计了 Methyl-Seq 平台，因为目前大量药理学、代谢和行为学实验均在大鼠中开展，却缺乏全基因组甲基化组学工具的支持。我们的数据表明，该平台可用于检测应激大鼠模型中的差异甲基化区域（DMRs），并可将这些区域与血浆皮质酮（CORT）水平等其他生理参数相关联。

Methyl-Seq 平台非常适合对已测序基因组但缺乏足够实验证据来记录调控区域的动物进行表观遗传学研究。当这些调控区域的信息可获得时，可针对当前版本自定义设计并添加额外的区域。此外，该平台也适用于比较基因组学研究，因为目标富集不受限制性内切酶识别位点的限制。例如，无论某个感兴趣基因的启动子区域是否含有特定的限制性位点，均可对其进行捕获。同样，任何在目标基因组中保守的调控区域（例如在小鼠或人类中已鉴定出的调控区域）也可以被成功捕获。

披露

该手稿是安捷伦科技公司竞赛奖项的一部分。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 MH101392（RSL）以及以下奖项和基金会的支持：NARSAD 青年研究者奖、Margaret Ann Price 研究员基金、通过 Charles T. Bauer 基金会设立的 James Wah 情绪障碍学者基金、Baker 基金会和 Project Match 基金会（RSL）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
放射免疫分析法（RIA）MP Biomedicals7120126皮质酮，125I 标记
Master Pure DNA 纯化试剂盒Epicentre/IlluminaMC85200
Thermal-LOK 2-位干式恒温加热器USA Scientific2510-1102适用于 1.5 mL 离心管
Vortex Genie 2Fisher12-812涡旋混合器
乙醇，纯级Sigma-AldrichE7023100% 乙醇，分子生物学级
Centrifuge 5424 REppendorf-必须能够达到 20,000 x g
Qubit 2.0ThermoFisher ScientificQ32866荧光计
Qubit dsDNA BR 检测试剂盒ThermoFisher ScientificQ32850
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒ThermoFisher ScientificQ32851高灵敏度 DNA 检测试剂
Qubit 检测管ThermoFisher ScientificQ32856
SureSelectXT 大鼠 Methyl-Seq 试剂盒Agilent TechnologiesG9651A用于构建 Methyl-Seq 文库的试剂
SureSelect 大鼠 Methyl-Seq 捕获文库Agilent Technologies931143用于富集大鼠靶序列的 RNA 探针
IDTE，pH 8.0IDT DNA11-05-01-0910 mM TE，0.1 mM EDTA
DNA LoBind 1.5 mL 管Eppendorf22431021
Covaris E 系列或 S 系列Covaris-等温超声破碎仪
microTUBE AFA 纤维预切带卡口盖 6x16mm (25)Covaris520045
超纯水（分子生物学级）Quality Biological351-029-721
Veriti 96 孔热循环仪Applied Biosystems4375786
AMPure XP 磁珠Beckman CoulterA63880DNA 结合磁珠
96S 超强磁板ALPAQUAA001322用于纯化步骤的磁力板
2200 TapeStationAgilent TechnologiesG2965AA基于电泳的生物分析仪
D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5582
D1000 ScreenTape 高灵敏度Agilent Technologies5067-5584
D1000 试剂Agilent Technologies5067-5583
D1000 高灵敏度试剂Agilent Technologies5067-5585
DNA110 SpeedVacThermoFisher Scientific-真空浓缩仪
Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1 磁珠Invitrogen65601链霉亲和素磁珠
Labquake 试管旋转仪ThermoFisher Scientific415110Q也可使用摇摆式混合器
EZ DNA Methylation-Gold 试剂盒Zymo ResearchD5006亚硫酸氢盐转化试剂盒，包含结合缓冲液、洗涤缓冲液、脱磺酸缓冲液和洗脱缓冲液
Illumina Hi-Seq 2500Illumina-下一代测序仪
PCR 和焦磷酸测序引物IDT DNAVariable
Taq DNA 聚合酶（含 ThermoPol 缓冲液）- 2,000 单位New England BioLabsM0267L
脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液套装New England BioLabsN0446S
Pyromark MD96QIAGEN-焦磷酸测序仪
200 证明乙醇Pharmco-Aaper11100020070% 乙醇溶液
氢氧化钠颗粒Sigma-Aldrich2214650.2 M NaOH 变性缓冲液
J.T. Baker 的 Tris（碱基）Fisher Scientific02-004-50810 mM 醋酸三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤液
PyroMark Gold Q96 试剂（50×96）QIAGEN972807焦磷酸测序所需试剂
PyroMark 退火缓冲液QIAGEN979009
PyroMark 结合缓冲液（200 mL）QIAGEN979006
链霉亲和素 Sepharose 高性能磁珠GE Healthcare17-5113-01包被链霉亲和素的 Sepharose 磁珠
PyroMark Q96 HS 板QIAGEN979101焦磷酸测序分析板
Eppendorf Thermomixer RFisher Scientific05-400-205板式混合器，96 孔模块需单独购买（货号 05-400-207）
SureDesign 网站Agilent Technologies-靶标捕获设计软件（https://earray.chem.agilent.com/suredesign/）
UCSC 基因组浏览器加州大学圣克鲁兹分校-大鼠 Nov 2004 rn4 基因组组装版本
Agilent Methyl-Seq 实验方案Agilent Technologies-https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf

参考文献

  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Meissner, A., et al. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).
  3. Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
  4. Naumov, V. A., et al. Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips. Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).
  5. Wockner, L. F., et al. Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients. Translational Psychiatry. 4, e339(2014).
  6. Meissner, A., et al. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).
  7. Smith, Z. D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., Meissner, A. High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes. Methods. 48 (3), 226-232 (2009).
  8. Slieker, R. C., et al. Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array. Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26(2013).
  9. Hing, B., et al. Adaptation of the targeted capture Methyl-Seq platform for the mouse genome identifies novel tissue-specific DNA methylation patterns of genes involved in neurodevelopment. Epigenetics. 10 (7), 581-596 (2015).
  10. Seifuddin, F., et al. Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure. Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).
  11. Irizarry, R. A., et al. The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores. Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).
  12. Lee, R. S., et al. Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences. Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).
  13. Jankord, R., et al. Stress vulnerability during adolescent development in rats. Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).
  14. Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
  15. Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
  16. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  17. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), R25(2009).
  18. Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions. Genome Biology. 13 (10), R83(2012).
  19. Lee, R. S., et al. Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice. Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).
  20. Lee, R. S., et al. A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice. Psychopharmacology. , (2011).
  21. Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).
  22. Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. Platelets, coronary heart disease, and stress. Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).
  23. McKlveen, J. M., et al. Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction. Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).
  24. Akalin, A., et al. methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles. Genome Biology. 13 (10), R87(2012).
  25. Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Alcohol-dose-dependent DNA methylation and expression in the nucleus accumbens identifies coordinated regulation of synaptic genes. Translational Psychiatry. 7 (1), e994(2017).
  26. Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking. Alcohol. 60, 103-113 (2017).

重印与许可

标签

DNA甲基化靶向捕获亚硫酸氢盐转化下一代测序差异甲基化区域Sprague Dawley大鼠慢性可变应激焦磷酸测序验证
一种用于识别与应激暴露相关表观遗传变化的大鼠甲基化测序平台
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。