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方法文章

利用笼锁型分子胶作为光激活标签在活细胞中实现客体蛋白的时空可控核转位

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DOI：

10.3791/58631

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2019年1月17日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, University of Tokyo, 2Riken Center for Emergent Matter Science

本文内容

摘要

本方案描述了利用笼锁型分子胶标签在活细胞中实现光触发客体分子核转位的方法。该方法在位点选择性核靶向药物递送方面具有广阔前景。

摘要

细胞核作为亚细胞药物递送的重要靶点之一，因其基因复制与表达的调控在治疗多种疾病中具有显著效果。本文展示了利用笼锁型分子胶实现光触发的客体分子向细胞核转位笼锁型Glue-R) 标签，其含有多个胍基离子（Gu+) 由阴离子光解基团（丁酸取代的硝基愈创木氧羰基）保护； BANVOC)。标记有 笼锁型Glue-R 被活细胞摄取 通过 内吞作用并保留在内体中。然而，在光照后， 笼锁型Glue-R 被转化为去笼化分子胶（uncaged molecular glue）去封闭携带多个Gu的Glue-R）+ 悬挂基团，有助于客体分子的内体逃逸及其后续向细胞核的转运。该方法在位点选择性靶向细胞核的药物递送方面具有潜力，因为只有在光照条件下，带标记的客体分子才能依次迁移进入细胞质和细胞核。 笼锁型Glue-R 标签可递送大分子客体（如量子点（QDs））以及小分子客体。 笼锁型Glue-R标签不仅可被紫外光解笼，还可被双光子近红外（NIR）光解笼，后者可深入穿透组织。

引言

细胞核携带遗传信息，是重要的细胞器之一，也是亚细胞药物递送的关键靶点，因为调控基因的复制和表达对于治疗包括癌症和遗传性疾病在内的多种疾病具有显著效果1,2,3。为了实现药物向细胞核的递送，研究人员已广泛探索将肽类标签（如核定位信号，NLS）4,5,6与药物偶联的策略。然而，为了减少不必要的副作用，对核转位过程进行时空控制十分必要。

此前，已有研究通过使用笼锁型核定位信号（caged NLS）实现光触发蛋白向细胞核的转位7,8,9。核定位信号（NLS）通过与细胞质转运蛋白结合而进入细胞核6。在已报道的方法中，携带笼锁型NLS的客体蛋白通常通过显微注射直接导入细胞质8，或利用遗传密码子扩展技术在靶细胞内表达9。因此，能够同时实现细胞摄取和光诱导核转位的方法在实际应用中更具优势。

本文中，我们描述利用树状笼状分子胶实现活细胞中客体分子光触发核转位的方法笼锁型Glue-R 图1）标签。水溶性分子胶10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23 含有多个胍基+ 已开发出可紧密附着于蛋白质的悬挂物11,12,13,14,15,16,17核酸18,19,20磷脂膜21和黏土纳米片22,23 通过其胍基之间形成多个盐桥+ 靶标上的悬挂基团和含氧阴离子基团。Gu+ 吊坠 笼锁型Glue-R 由一种阴离子型光裂解基团保护，即丁酸取代的硝基愈创木氧羰基（BANVOC）。用标记的客体分子 笼锁型Glue-R 被活细胞摄取 通过 内吞作用并在内体中停留（图2）。在光照下， BANVOC基团 笼锁型Glue-R 解笼释放出未结合的分子胶（解笼含多个 Gu 的 Glue-R）+ 悬挂基团，从而促进标记的客体分子迁移至细胞质，随后进入细胞核（图2）。该 笼锁型Glue-R 标签可通过暴露于紫外光或双光子近红外（NIR）光进行解笼，且无明显光毒性。我们展示了大分子客体以及小分子客体的时空可控核递送， 笼锁型以量子点（QDs）和荧光染料（硝基苯并噁二唑；NBD）分别作为Glue-R标签的示例。

笼锁型Glue-R化学反应示意图，紫外光或近红外光解笼，有机合成过程。
图1：CagedGlue-R的结构示意图。 CagedGlue-R的9个胍基阳离子（Gu+）侧链被丁酸取代的硝基愈创木氧羰基（BANVOC）基团保护。BANVOC基团可通过紫外光或双光子近红外光照射裂解。CagedGlue-R的核心部分可修饰硝基苯并二唑（NBD）或二苯并环辛炔（DBCO）。经参考文献20许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

分子标记的内吞作用示意图；包括光触发去笼和核转位。
图2：与CagedGlue-R标签偶联的客体分子光触发核转位的示意图。 客体分子与CagedGlue-R的偶联物通过内吞作用被活细胞摄取。via 光照后，CagedGlue-R标签发生去笼反应，生成UncagedGlue-R标签，从而促进标记客体分子从内体中逃逸。随后，该标记的客体分子迁移进入细胞核。经参考文献20许可重印。 请点击此处查看此图的放大版本。

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方案

1. 准备带有笼锁型Glue-R标签的客体分子

  1. 配制光笼型Glue-NBD 溶液。
    1. 按照先前描述的方法合成光笼型Glue-NBD（图1）20。
    2. 用无水二甲基亚砜（DMSO）配制光笼型Glue-NBD 的储备液（10 mM）。
      注意：将储备液避光保存。使用时可用水性缓冲液或细胞培养基稀释。
  2. 配制光笼型Glue-QD 溶液。
    1. 按照先前描述的方法合成光笼型Glue-二苯并环辛炔（光笼型Glue-DBCO）（图1）20。
    2. 用无水DMSO配制光笼型Glue-DBCO的储备液（10 mM）。
    3. 为配制光笼型Glue-QD，首先制备叠氮功能化的量子点（叠氮-QD；图3）。将100 µL叠氮-PEG4-NHS酯的二甲基甲酰胺（DMF，125 µM）溶液（图3）加入400 µL胺基功能化聚乙二醇包覆的量子点（Amine-QD；图3）的DMF溶液（500 nM）中。室温下搅拌混合物1小时。
    4. 将所得溶液使用截留分子量为3,500的再生纤维素透析膜，在800 mL DMF中透析24小时。
    5. 用DMF将光笼型Glue-DBCO储备液稀释至50 µM。取200 µL该溶液加入透析后的溶液中（图3），室温下搅拌3小时。
    6. 将所得溶液使用截留分子量为25,000的再生纤维素透析膜，在800 mL DMF中透析24小时。
    7. 用DMF将所得溶液稀释至200 nM。

量子点修饰过程；化学反应图示；胺基到叠氮基的修饰；键合。
图3：CagedGlue-QD 制备过程的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 显微观察用 Hep3B 细胞样品的制备

  1. 在 37 °C、5% CO2 条件下，将人肝细胞癌 Hep3B 细胞培养于含 10% 胎牛血清 (FBS) 的 Eagle 最低必需培养基 (EMEM) 中。
  2. 实验前一天接种细胞。每孔加入 5.0 × 103 个 Hep3B 细胞至 8 孔玻璃底培养板中，每孔培养体积为 200 µL EMEM（含 10% FBS），于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时。
  3. 吸除培养基，用 100 µL Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (D-PBS) 洗涤细胞样本两次。

3. 紫外光诱导小分子客体核转位的观察

  1. 将细胞样品（步骤 2.3 中制备）供给 200 µL 不含FBS的EMEM 笼锁型Glue-NBD (10 µM）并将所得细胞样品孵育于 37 °C 5% CO₂条件下2 3小时。
    注意：在无FBS的EMEM中孵育细胞样品超过4 h会导致严重的细胞损伤。
  2. 移除培养基，并用缓冲液冲洗细胞样本 100 µL 用 D-PBS 洗涤两次。
  3. 为了可视化内体，向细胞样品中加入 200 µL 含红色荧光染料的 EMEM（10% FBS）例如，LysoTracker Red，100 nM），将所得细胞样品于 37 °C 5% CO₂条件下2 20分钟。移除培养基，并用缓冲液冲洗细胞样本 100 µL 用 D-PBS 洗涤两次。向细胞样品中加入 200 µL 含10% FBS的EMEM
  4. 核转位 笼锁型Glue-NBD，将细胞样本暴露于紫外光下 2 分钟 通过 使用配备365 nm带通滤光片的100 W氙灯光源通过光纤照射。对于无需紫外照射的对照细胞样品，将其置于避光条件下保存。
    注意：可取下玻璃基板的盖子以实现高效的紫外光照射。长时间暴露于紫外光下可能对细胞产生细胞毒性。
  5. 为可视化细胞核，添加 1 µL 加入Hoechst 33342（1 mg/mL）至培养基中，并将所得细胞样品于 37 °C 5% CO₂条件下2 10分钟。
  6. 将细胞样品进行共聚焦激光扫描显微镜观察，并在488 nm激发光下记录显微图像（λ观察 = 500-530 nm），543 nm（λ观察 = 565-620 nm）和 710 nm（双光子； λ观察 分别为NBD、红色荧光染料和Hoechst 33342提供390–465 nm的激发光。

4. 双光子近红外光触发的小分子客体核转位观察

  1. 向细胞样品（步骤 2.3 中制备）中加入 200 µL 含有 CagedGlue-NBD（10 µM）的无 FBS EMEM 培养基，并将细胞样品在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3 小时。
  2. 移除培养基，用 100 µL D-PBS 洗涤细胞样品两次。向细胞样品中加入 200 µL 含 10% FBS 的 EMEM 培养基。
  3. 对细胞样品进行共聚焦激光扫描显微观察，在 488 nm 激发下记录显微图像（λobs = 500–530 nm）。
  4. 为实现 CagedGlue-NBD 的核转位，使用安装在显微镜上的双光子激发激光（710 nm）照射包含目标细胞的区域，持续 2 分钟（30 秒 × 4 次）。按照步骤 4.3 所述方法观察转位过程。

5. 紫外光触发的大分子客体核转位观察

  1. 将细胞样品（步骤 2.3 中制备）供给 200 µL 不含FBS的EMEM 笼锁型Glue-QD（10 nM）避光孵育细胞样本 37 °C 5% CO₂条件下2 3小时。
  2. 移除培养基，并用缓冲液冲洗细胞样本 100 µL 用 D-PBS 洗涤两次。向细胞样品中加入 200 µL 含10% FBS的EMEM
  3. 核转位 笼锁型Glue-QD，将细胞样本暴露于紫外光下 2 分钟 通过 使用配备365 nm带通滤光片的100 W氙灯作为光源，通过光纤照射样品。对于无需紫外照射的对照细胞样品，应将其置于避光条件下保存。
  4. 为可视化细胞核，添加 1 µL 加入Hoechst 33342（1 mg/mL）至培养基中，并将所得细胞样品置于培养条件下孵育 37 °C 二氧化碳浓度低于5%2 10 分钟。
  5. 将细胞样品进行共聚焦激光扫描显微镜观察，并在405 nm激发光下记录显微图像（λ观察 = 430-520 nm）和 488 nm（λ观察 = 625–680 nm），分别用于Hoechst 33342和量子点（QDs）。

6. 细胞活力检测

  1. 在 EMEM（10% FBS）中培养人肝细胞癌 Hep3B 细胞 37 °C 5% CO₂条件下2.
  2. 实验前一天接种细胞。接种 5.0 × 103 96孔培养板中每孔接种Hep3B细胞，使用EMEM培养基（含10% FBS） 200 µL），并在指定条件下孵育细胞样品 37 °C 低于 5% CO₂2 24 h。
  3. 移除培养基，并用缓冲液冲洗细胞样本 100 µL 用 D-PBS 洗涤两次。
  4. 向细胞样品中加入 200 µL 不含FBS的EMEM 笼锁型Glue-NBD（0.1–100 µM）并将所得细胞样品孵育于 37 °C 5% CO₂条件下2 3 小时。
  5. 将细胞样品暴露于紫外光下 2 min 通过 使用配备365 nm带通滤光片的100 W氙灯光源通过光纤照射。对于未进行紫外照射的对照细胞样品，将其置于避光环境中。
  6. 添加 10 µL 细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8）试剂10 µL) 加入培养基中，并将所得的细胞样品在 37 °C 低于 5% CO₂2 2小时。
  7. 将细胞样品进行吸收光谱分析（λ 使用酶标仪在 450 nm 波长下检测。

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结果

在光照射前，与CagedGlue-NBD共同孵育的Hep3B细胞在其内部呈现点状荧光发射（λext = 488 nm；图4A和4C，绿色）。在543 nm激发下，红色荧光染料也获得了类似的显微图像（图4B和4C，红色），表明CagedGlue-NBD定位于内体中。相应地，归属于CagedGlue-NBD的荧光发射（图4D，绿色）出现在细胞核外，细胞核由Hoechst 33342染色显示（λext = 710 nm，双光子；图4D，蓝色）。紫外光照射后，细胞在细胞核区域（图4E，蓝色）也发出来自NBD的荧光（

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讨论

先前关于光触发蛋白质转位至细胞核的研究是通过使用笼锁型核定位信号（caged NLS）实现的7,8,9。如前所述，这些方法需要额外的技术手段将带有NLS标签的蛋白质导入细胞质。相比之下，我们的CagedGlue-R标签不仅能够实现光诱导的核转位，还可促进客体分子的细胞摄取。这一特性使CagedGlue-R标签在活体（in vivo）应用中具有显著优势。

的 笼锁型Glue-R标签可将大分子客体（如量子点）递送至细胞核内。此处使用的量子点直径较大（DH 比核孔（约5 nm）更大（15-20 nm）24，表明了递送其他无法被动扩散进入细胞核的大分子的可能性。已有成熟的方案可用于在生物大分子表面功能化修饰叠氮基团。2...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢东京大学纳米生物集成研究中心。本研究得到了日本青年科学家研究基金（B）（26810046）对K.O.的资助，以及特别推进行研究基金（25000005）对T.A.的部分资助。R.M.感谢日本学术振兴会（JSPS）青年科学家研究奖学金以及领先研究生院计划（GPLLI）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
叠氮-PEG4-活性酯Click Chemistry ToolsAZ103
Q-dot 655 ITKInvitrogenQ21521MP
再生纤维素膜（截留分子量 3,500）NIPPON GeneticsTOR-3K
再生纤维素膜（截留分子量 25,000）Harvard Apparatus7425-RC25K
Hep3B 细胞ATCCHB-8064
8孔玻璃底培养皿Nunc155411JP
96孔细胞培养板Nunc167008
伊格尔最小必需培养基（EMEM）Thermo Fisher Scientific10370-021
胎牛血清（FBS）GE HealthcareSH30406.02
杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）Wako Pure Chemical Industries045-29795
LysoTracker RedLonza WalkersvillePA-3015
Hoechst 33342DojindoH342
细胞计数试剂盒-8DojindoCK04
共聚焦激光扫描显微镜Carl-ZeissLSM 510配备双光子激发激光器（Mai Tai 激光器，Spectra-Physics）
共聚焦激光扫描显微镜LeicaTCS SP8
氙灯光源Asahi SpectraLAX-102
酶标仪Molecular DevicesSpectraMax Paradigm

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