通过喷墨打印机辅助的自动化棋盘阵列法与手工时间-杀菌法进行抗菌协同作用测试

摘要

抗菌药物协同作用测试用于评估两种或多种抗生素联合使用的效果，通常采用以下两种方法之一进行：棋盘格稀释法或时间-杀菌试验。本文介绍了一种基于自动喷墨打印机辅助的棋盘格稀释法协同作用技术，以及一种经典的时间-杀菌协同作用研究方法。

摘要

随着多重耐药（MDR）病原体的发病率持续上升，且超过了新型抗菌药物的研发速度，针对多重耐药细菌的治疗亟需新的策略。其中一种策略是联合用药，即联合使用两种或多种抗生素来治疗单药可能无效或对其中一种或两种药物均无效的感染。当两种药物联用产生的效应大于各自效应之和时，即被视为具有协同作用。体外协同活性的研究是评估药物组合潜在疗效的重要第一步。目前已有两种主要的体外协同作用检测方法：棋盘格法和时间-杀菌试验。本文介绍了一种利用喷墨打印技术实现自动化的棋盘格法，可提高该技术的效率与准确性，同时介绍了一种标准的手动时间-杀菌协同试验方法。自动化棋盘格法可用于高通量筛选，而手动时间-杀菌试验则可提供关于协同活性及杀菌效果的额外补充数据。

棋盘法阵列是标准最低抑菌浓度（MIC）检测的一种改进方法，该方法将细菌与不同浓度组合的抗生素共同孵育，并在过夜孵育后评估其生长抑制情况。手动进行棋盘法阵列实验需要一系列繁琐且易出错的计算和稀释步骤。本文介绍的自动化方法利用喷墨打印技术，实现了所需抗生素储备液体积的自动计算与分配。在时间-杀菌协同试验中，将细菌与目标抗生素单独或联合孵育，并在24小时过程中定时取样进行定量培养。该实验结果可判断抗生素组合是否具有协同作用，是否具有杀菌效应，并提供随时间变化的细菌抑制和杀灭数据。

引言

多重耐药（MDR）细菌病原体的传播，特别是碳青霉烯类耐药肠杆菌科（CRE）等多重耐药革兰阴性菌，使临床医生在成功实施抗感染治疗方面面临越来越有限的选择¹，而新型抗菌药物研发进展缓慢进一步加剧了这一问题^2,3。抗菌协同作用是指两种药物联用时产生的效应大于各自单独作用之和，这种机制为挽救现有抗生素用于治疗多重耐药菌感染提供了可能，即使这些细菌对其中一种或两种抗生素单独使用时具有耐药性。本文所述技术提供了两种互补的体外协同作用检测方法：联合使用时，可使研究人员高效地筛选感兴趣的抗菌药物组合是否具有协同活性（自动化棋盘格阵列法），并进一步评估在筛选阶段发现的有前景组合所表现出的抑制和杀菌动力学特征（手工时间-杀菌法）。

体外协同作用检测最常用的方法之一是棋盘格阵列法，该方法是最低抑菌浓度（MIC）检测的一种改进形式，通过一系列浓度组合来检测两种不同抗生素对某种细菌分离株的抑制活性^4,5。当两种药物联合使用时若其活性超过相加效应，则认为该组合具有协同作用⁶。然而，手动设置棋盘格阵列涉及一系列计算以及稀释和移液步骤，操作繁琐且容易引入人为误差。这些限制因素导致协同作用检测主要局限于对少量抗生素组合和细菌分离株进行回顾性评估，且不同研究之间的结果并不总是一致^7,8,9,10,11。此外，协同作用检测的复杂性也导致其在临床微生物学实验室中难以开展，并使得临床联合治疗研究中几乎缺乏体外协同作用检测的数据^12,13。

为了提高棋盘格阵列法的效率和通量，我们采用了一种本实验室先前开发的自动化MIC检测技术，该技术利用喷墨打印技术将抗生素储备液精确且一致地分配至微孔板的孔中¹⁴。该平台消除了复杂计算和多次移液步骤的需要。只要用户输入所需抗生素的浓度范围及其储备液浓度，配套软件即可自动计算并分配相应的抗生素体积，从而生成二维棋盘格阵列。我们最初在一组碳青霉烯类耐药肠杆菌（CRE）分离株上测试了该方法¹⁵，随后重点研究了含多粘菌素（colistin）的药物组合对多粘菌素耐药分离株的抗菌活性¹⁶。多粘菌素通常作为最后手段的药物，主要用于治疗多重耐药（MDR）革兰阴性病原菌感染^17,18，而多粘菌素耐药会使原本已为多重耐药的细菌几乎成为泛耐药菌¹⁹，因此这类细菌成为开发新型治疗策略的理想对象，即通过联合使用细菌对其单独不敏感的药物来实现协同作用。我们发现，多粘菌素与蛋白合成抑制剂类抗生素米诺环素（minocycline）联用时表现出极高的协同作用率，即使对这两种药物各自耐药的菌株亦是如此，这可能是由于多粘菌素对即使耐多粘菌素的细菌仍具有亚抑制浓度下的通透化效应。本文选择该组合作为示例进行阐述。值得注意的是，协同作用测试也可用于评估两种单独使用时均有效的药物联用后是否具有增强的疗效。

自动化棋盘格阵列法可实现快速、高通量的协同作用检测。然而，棋盘格阵列法也存在局限性。作为一种改良的最小抑菌浓度（MIC）检测方法，该法仅能提供关于细菌生长抑制的数据，而无法反映杀菌效果，且不能提供抗生素随时间变化的作用信息。相比之下，手工操作的时间-杀菌协同试验虽然更为耗时费力，但可在24小时的时间过程中提供关于抑制和杀菌的双重信息^20,21。我们对少量分离株进行了时间-杀菌分析，以验证棋盘格阵列法的结果，并确定所发现的协同组合是否同样具有杀菌作用。

棋盘式阵列法和时间-杀菌协同作用方法均可提供有关药物组合活性的重要信息，尤其适用于评估针对高度耐药细菌病原体的潜在新型治疗方案。这些方法也存在固有的局限性。标准的微量肉汤稀释法最小抑菌浓度（MIC）检测已知存在一个两倍稀释度的预期误差范围²²，当两种药物在棋盘式阵列中联合检测时，该误差范围会进一步增大。协同作用的标准定义仅将药物联合使用时在各自MIC的四分之一浓度下仍具有活性的情况视为协同作用⁶，这一定义已考虑了预期的变异性；但这种变异性（被认为源于生物和实验技术波动的共同作用²³）不可避免地导致对协同作用结果可靠性的不确定性。目前协同作用检测尚缺乏建立完善的质量控制标准，这也是当前的一大局限。或许所有协同作用检测方法中最显著的局限在于，体外检测结果与临床治疗效果之间尚缺乏明确的相关性，即当药物组合用于患者治疗时，其体外结果与实际临床结局之间的关联尚未确立²⁴。更简单且更快速的协同作用检测方法，例如本文所述的自动化棋盘式阵列法，可能有助于将体外协同作用检测整合到临床试验或其他患者结局评估中，从而在未来更好地阐明体外与体内效应之间的关系。

我们在此介绍的自动化棋盘阵列法为多种组合的高通量筛选提供了可行方案，并可快速评估非常规、 "高风险-高回报" 无需投入大量时间和资源即可实现组合。随后我们将演示的时间-杀灭法可为组合的协同活性提供额外支持性信息，并有助于表征其杀菌活性及抗菌动力学特征。

方案

注意：操作细菌时应采用适当的安全规程。始终佩戴手套和实验服。若可能产生气溶胶或操作高风险病原体，应在生物安全柜中进行操作。

注意：在开始实验前 20 至 24 小时，将待测细菌分离物（来自在含 50% 甘油的胰蛋白胨大豆肉汤中于 -80 °C 冷冻保存的菌落纯化、传代次数最少的菌种）划线接种至血琼脂平板上。将平板置于 35 °C 空气环境中培养。

1. 喷墨打印机辅助的自动化棋盘格阵列协同作用实验

1. 配制抗菌药物储备液（多粘菌素和米诺环素）。
   1. 根据抗生素在棋盘式稀释阵列中的溶解度及所需的最终浓度，确定抗生素储备液的浓度。以本示例为例，配制浓度为 10 mg/mL 的多粘菌素和米诺环素储备液。参考 CLSI M100 文件以确定每种抗生素适用的溶剂。²⁵. 多粘菌素和米诺环素均为水溶性；由于D300喷墨打印机需要添加表面活性剂以实现适当的水相流体处理，因此将抗生素溶解于含0.3%聚山梨酯20的超纯去离子水中。
   2. 使用分析天平称取抗生素粉末，并计算获得目标储备浓度所需的溶剂体积。
      1. 如果抗生素以盐的形式（如硫酸黏菌素、盐酸米诺环素）或水合物形式（如美罗培南三水合物）提供，或制造商报告其纯度低于100%，则需进行效价计算。²⁶ 确定所需溶剂的量。
      2. 以盐酸米诺环素（纯度为900）为例进行操作 μ克/毫克
         检测纯度：900 μg/mg
         水分含量：无
         活性部分：0.926（通过将米诺环素的分子量（457.48 Da）除以盐酸米诺环素的分子量（493.94 Da）获得）。
         效价 = (检测纯度) × (1 – 水分含量) × (活性组分)
                            = (900 μg/mg) * (1) * (0.926) = 833.4 μg/mg 或 83.34%
         然后按如下方法确定所需溶剂的体积：
         体积（mL）= [重量（mg）× 效价（μg/mg) ÷ [浓度 (μg/mL)
         例如，如果称取了34.7 mg的盐酸米诺环素粉末，则使用以下计算方法确定配制10 mg/mL溶液所需的溶剂体积：
         体积 = (34.7 mg) * (833.4 μg/mg = 2.89 mL
                                10,000 μg/mL
   3. 将抗生素粉末倒入15 mL锥形管中，加入适量水和0.3%聚山梨酯20。涡旋振荡至溶解。
   4. 将抗生素储备液分装至0.5 mL 微量离心管中，于 -80 ℃保存 °C，待用时取出。
2. 在进行协同作用检测至少一天前，应对用于棋盘格阵列实验的抗菌药物储备液进行质量控制（QC），以便在将储备液用于协同作用检测前评估其质量控制结果。
   注意： 此处描述的质控技术与用于单个药物最低抑菌浓度（MIC）检测的技术完全相同，研究者可将其用于任何感兴趣的菌株。
   1. 制备细菌悬液。
      1. 从-80℃中取出每种抗生素储备液的等分试样 °将C冷冻管置于室温开始解冻，同时准备细菌悬液。解冻后涡旋振荡，以确保抗生素充分溶解。
      2. 选择合适的质控菌株，并根据所测试药物确定可接受的最小抑菌浓度（MIC）范围 表 5A-1 在 CLSI M100 中²⁵此处所用的药物, 使用 E. coli ATCC 25922；该菌株的 MIC 范围为 0.25–1 μμg/mL 对于米诺环素和 0.25–2 μg/mL 用于多粘菌素 E
      3. 选择要测试的抗生素浓度范围，该范围应包含整个质量控制（QC）范围。使用 0.0156 的范围 μ微克/毫升至8 μg/mL，适用于ATCC 25922的米诺环素和多粘菌素
      4. 向一支12 mm × 75 mm的圆底玻璃培养管中加入1 mL 0.9%氯化钠溶液。从ATCC 25922过夜培养平板上挑选一个或两个菌落，轻轻涡旋混匀以悬浮。
      5. 使用麦氏比浊仪检测细菌浓度。根据需要添加0.9%氯化钠溶液或更多细菌，直至达到0.5麦氏浊度标准。
      6. 将100 μL的0.5麦氏浓度菌悬液加入到30 mL生理盐水中，制备1:300稀释的菌悬液 μ将悬浮液的 L 加入含有 30 mL 阳离子调节的 Mueller-Hinton 肉汤（CAMHB）的 50 mL 锥形管中，使最终细胞密度达到 5×10⁵⁵ CFU/mL，按照 CLSI 的建议²⁷.
      7. 使用无菌接种环，将起始接种物的一滴在血琼脂平板上进行划线分离，以确认接种物的纯度，并于35℃培养 °在环境空气中
   2. 使用 D300 将抗菌药物加入平底、方形孔、透明、未经处理的 384 孔板中。在制备细菌悬液后立即执行此步骤，以确保在悬液制备后 15 分钟内将其加入孔板中。²⁶.
      1. 打开 D300 喷墨打印机及配套计算机。启动软件程序。
      2. 新建一个文件。在平板网格图像的上方，右键单击 1号培养板 并选择 编辑平板. 选择合适的平板类型（384 孔）以及额外体积（50 μL)
      3. 通过点击旁边的加号，将液体（如抗生素储备液）添加到方案中 液体 在左侧面板中。添加两种液体（colistin 和 minocycline）。
         1. 将鼠标悬停在出现的 Fluid 1 面板上，点击铅笔图标进行编辑。将该液体命名为“Colistin”，并更改 分类 改为“水 + Tween 20” 浓度 至10,000，并将浓度单位改为 μ微克/毫升（注意：储备液浓度为10 μg/mL，即 10,000 mg/mL）。放置 分配 by 和 at 浓度 并保持其余字段为默认设置。点击 好的.
         2. 对流体2（米诺环素）重复上述步骤。
         3. 点击 当前方案 屏幕顶部的标签并更改 浓度 （质量） 至 μg/mL 确定最终孔中抗生素浓度所使用的单位。
      4. 通过点击并拖动在网格中选择10个孔，然后单击 滴定 屏幕顶部。对于 指定滴定使用 选择 最高浓度，用于 液体 选择 黏菌素，用于 最高浓度 输入 8 （确保单位正确） μ微克/毫升（g/mL），以及 分布 选择 1:2 (50%)保留窗口中其余部分的默认值，然后单击 好的.
      5. 对米诺环素重复上述步骤，以生成米诺环素的梯度稀释。
      6. 保存方案，然后单击 运行 左上角的按钮
      7. 点击 开始 按钮。将一个384孔板（移除盖子）放入板架中，然后按下 已加载 在“加载1号板——协同作用”提示下。
         注意： 此提示由软件选择，并不表示正在进行协同作用测试。将T8+试剂盒放入试剂盒插槽并按下 加载完成 在……的条件下 加载 T8+ 试剂盒 提示
      8. 当系统提示时，将抗生素储备液加入卡盒上指定的储液槽中。按照屏幕上的说明正确装入溶液，并小心移液，避免溶液中产生气泡。每种溶液加入后，按压 已填充 按钮
      9. 在喷墨打印机将抗生素原液以适当体积添加至各孔后，并完成 运行完成 出现对话框后，单击 关闭，取出培养板，并关闭 D300。
   3. 将细菌悬液加入384孔板并孵育。
      1. 将先前制备的细菌悬液倒入无菌试剂储液槽中。
      2. 使用多通道移液器加入 50 μL 的细菌悬液加入所有含抗生素的孔中。加入 50 μ向空孔中加入不含细菌的CAMHB培养基L，作为阴性对照孔，以确认培养基的无菌性。
      3. 将培养皿放入35 °C 恒温空气培养箱中培养 16-20 小时²⁶.
         注意： 若使用非上述生物体，可能需要不同的孵育时间。 肠杆菌科 正在测试；请查阅 CLSI M100²⁵ 针对特定生物体的推荐建议。
   4. 在600 nm光密度（OD）下使用酶标仪读取平板₆₀₀）并分析结果。
      1. 使用电子表格程序，对 OD 值小于 0.1 的孔进行标记₆₀₀ ≥0.07 为绿色，表示有生长，而数值为 <0.07 红色，表示无生长。
         注意：这些数值是根据实验中对生长与无生长情况的目视观察以及与OD读数的相关性确定的；OD₆₀₀ 仅含培养基的孔的读数 consistently 低于 0.07。不同酶标仪和细菌的适当 cutoff 值可能有所不同。
      2. 测定每种药物的 MIC。MIC 是指能够抑制细菌生长的药物最低浓度。如果 MIC 处于 CLSI M100 文件规定的预期质控范围内²⁵，该储备液适用于使用。
3. 为棋盘法阵列制备细菌悬液。
   1. 从 -80 冰箱中取出每种抗生素储备液的等分试样 °将冻存的抗生素置于 C 冷冻室开始解冻，同时准备细菌悬液。解冻后涡旋振荡，以确保抗生素完全溶解。
   2. 向一支12 mm × 75 mm的圆底玻璃培养管中加入约1 mL的0.9%氯化钠溶液。从细菌的过夜培养平板上挑选一个或两个菌落（本实验中， E. coli 菌株 FDA-CDC 0494）并轻轻涡旋，使其悬浮于 0.9% 氯化钠溶液中。
   3. 使用麦氏比浊仪检测细菌浓度。根据需要，通过添加更多0.9%氯化钠溶液或更多细菌，调节至0.5麦氏浊度标准。
   4. 将 0.5 麦氏浓度的菌悬液按 1:300 比例稀释，即加入 100 μ将悬浮液的 L 加入到 50 mL 锥形管中的 30 mL CAMHB 中，使最终细胞密度达到 5 × 10⁵ CFU/mL²⁷.
4. 使用 D300 将抗菌药物添加到平底、方孔、透明、未经处理的 384 孔板中。
   注意： 在制备细菌悬液后立即执行此步骤，以确保在悬液制备后的15分钟内将其加入到平板中。²⁶.
   1. 打开喷墨打印机，新建一个文件，并按照步骤 1.2.2.1–1.2.2.3 将液体添加到程序中。
   2. 生成协同作用网格。
      1. 点击 协同作用 屏幕顶部的图标，然后按步骤操作。对于 类型 选择 两种或多种液体组合。对于 培养皿，无需排除任何孔；单击 下一步 在此步骤中不进行任何更改。
      2. 在 滴定 标签，输入抗生素浓度及放置位置。
         1. 为了以32至0.031的递减倍比稀释方式加入米诺环素 μg/mL，以及一个不含抗生素的阴性孔，沿 y 轴，输入 12 作为 滴定梯度 左侧面板。对于 指定滴定使用，选择最高浓度；对于 液体 选择米诺环素；用于 最高浓度，输入 32（确保单位设置为 μ微克/毫升；如果不是，请关闭“协同作用”对话框并进行更改 当前方案 标签）。确保 包含 0 选中值框。更改 分布 至1:2（50%）。
         2. 对右侧面板的colistin重复上述步骤，使用12个滴定浓度水平，最高浓度为16。点击 下一步.
      3. 在 布局 标签，选择 前两种液体的滴定水平决定了布局网格中的行数和列数点击 下一步. 如果网格显示符合预期，则单击 完成.
   3. 保存方案，然后单击 运行 左上角的按钮
   4. 点击 开始 按钮。将一个384孔板（移除盖子）装入板架中，然后按下 已加载 在 加载 1 号板——协同作用 提示。将 T8+ 试剂盒放入试剂盒插槽并按下 已加载 在 加载 T8+ 试剂盒 提示
   5. 当系统提示时，将抗生素储备液加入卡盒中指定的储液槽内。按照屏幕上的说明正确加载，并小心加样以避免溶液中产生气泡。每种溶液添加完毕后，按下 已填满 按钮
   6. 一旦D300分配器已将抗生素储备液以适当体积加入各孔后 运行完成 框出现后，单击 退出，取出培养板，并关闭 D300。
5. 将细菌悬液加入384孔板并孵育。
   1. 将先前制备的细菌悬液倒入无菌试剂储液槽中。
   2. 使用多通道移液器加入 50 μ将 50 微升该悬液加入棋盘式稀释法阵列的所有孔中。加入 50 μL 的不含细菌的 CAMHB 加入空孔中；此孔作为阴性对照孔，用于确认培养基的无菌性。在 35 °C 常温空气培养箱中培养 16–20 小时²⁶.
6. 在分光光度计上以 OD 读取平板₆₀₀ 并分析棋盘式稀释法实验结果。
   1. 首先，检查纯度平板，确保分离的菌落为单一形态，且与所测生物体预期的形态一致。
   2. 使用电子表格程序，参照步骤 1.2.4.1，对指示有生长和无生长的细胞进行着色。
   3. 测定每种药物的最低抑菌浓度（MIC）。对于在最高测试浓度下仍无法抑制细菌生长的药物，其 MIC 视为超出量程。
   4. 对于每个抑制了生长的孔，根据该抗生素的 MIC 确定其部分抑菌浓度（FIC）（参见 图1B 以及 图 2B).
      注意： FIC 是指在抑制生长的孔中抗生素浓度与其 MIC 的比值；因此，对于 MIC 为 8 的药物 μ微克/毫升，一个含有 8 的孔 μg/mL 该药物的 FIC 为 1，而含有 4 μg/mL 的 FIC 为 0.5。
   5. 计算部分抑菌浓度指数（FIC）_I）将每个抑制生长孔的FIC值定义为该孔中每种药物FIC的总和。
   6. 确定最低的FIC_I 生长被抑制的浓度（最低FIC）_I）。如果最低FIC_I 是 £0.5，判定该组合具有协同作用；若为0.5–4，判定该组合为无关作用；若 >4，视为拮抗组合。若该组合在某些浓度配比下表现为协同作用，而在其他浓度下表现为拮抗作用，则需记录此结果，但总体上仍视为拮抗组合。

2. 时间-杀灭协同作用检测

1. 制备抗菌药物储备液。若此步骤在实验前进行，将储备液于 -80 ℃ 冷冻保存 °C，待使用时取出。
   1. 根据抗生素在时间-杀灭研究中的溶解度和所需的最终浓度，确定抗生素储备液的浓度。本示例中，制备浓度为 1 mg/mL 的多粘菌素和米诺环素储备液。参照 CLSI M100 文件确定每种抗生素的适宜溶剂。²⁵. 按推荐使用水分别溶解多粘菌素和米诺环素。
   2. 使用分析天平称取抗生素粉末，并计算获得目标储备浓度所需的溶剂体积。如有需要，可在确定所需溶剂量之前，按照上述步骤1.1.2.1所述进行效价计算。
   3. 将抗生素粉末倒入15 mL锥形管中，加入适量体积的水。涡旋振荡至溶解。
2. 采用 CLSI M07 中所述的手工肉汤微量稀释法²⁶，对用于时间-杀灭协同实验的抗菌药物储备液进行质量控制。该步骤应在协同作用检测前至少一天完成，以便在使用储备液前审核质量控制结果。
   1. 选择合适的质控菌株，并根据所测试药物确定可接受的最小抑菌浓度（MIC）范围 表 5A-1 在 CLSI M100 中²⁵此处所用的药物, 使用 E. coli ATCC 25922；该菌株的MIC范围为0.25–1 μμg/mL 对于米诺环素和 0.25–2 μg/mL（针对多粘菌素E）
   2. 制备含抗生素的肉汤微量稀释板。
      1. 选择要测试的抗生素最高浓度，以确保包含整个质控范围。使用 0.016 至 8 的范围 μg/mL，适用于ATCC 25922的米诺环素和多粘菌素。
      2. 在CAMHB中将抗生素储备液稀释为工作溶液 两倍 所需最高浓度（因其将与细菌悬液以1:1比例稀释）。本示例中，将两种储备液从10 mg/mL稀释至16 μg/mL
      3. 使用多通道移液器，加入 100 μ将每种2倍浓度抗生素悬液各50 L加入透明圆底未处理96孔板第一列的各个孔中，再加入50 μ向后续各列的每孔中加入 L 的普通肉汤（即不含抗生素）。
      4. 移除 50 μ从第一列各孔中取出含抗生素的肉汤，加入第二列各孔中。反复吹打数次以混匀内容物，使抗生素浓度为第一列浓度的一半。
      5. 重复步骤 2.2.2.4，对每一列进行操作，使每列形成一系列体积为 50 的连续两倍稀释 μL，以制备溶液。如需避免抗生素残留，可在每次稀释步骤之间更换移液器吸头。注意，所得浓度仍为最终浓度的2倍，因为后续将与细菌悬液以1:1比例稀释。
      6. 最后两列不添加任何抗生素，这两列将作为阴性对照和生长对照列。
   3. 制备细菌悬液。
      1. 从过夜培养的平板上制备0.5麦氏浓度的菌悬液 E. coli ATCC 25922 菌株悬浮于 0.9% 氯化钠溶液中，操作步骤见 1.2.1.5–1.2.1.6。
      2. 将 0.5 麦氏浓度的菌悬液按 1:150 比例稀释，通过加入 50 μ将悬浮液的 L 加至 7.5 mL CAMHB 中。
         注意： 最终细菌悬液与抗生素溶液以1:1混合后，将被稀释1:300，达到CLSI推荐的细胞密度5 x 10⁵ CFU/mL²⁷).
   4. 将细菌加入微孔板并孵育。
      1. 加入50 μ除第11列各孔外，向其余各孔中加入L的细菌悬液^th 列。加入 50 μL 的 CAMHB 加入到 11^th 阴性对照列
      2. 35 ℃下孵育平板 °C 培养 16–20 小时。
         注意： 若使用除上述生物体之外的其他微生物，则可能需要不同的孵育时间。 肠杆菌科 正在测试；请查阅 CLSI M100²⁵ 针对特定生物体的建议。
      3. 使用透射光目视读取平板中的细菌生长情况，并针对每种抗生素确定无菌生长的最低浓度，即为最小抑菌浓度（MIC）。有关 MIC 目视判读的更多细节，请参考 CLSI M07 文件。²⁶如果最低抑菌浓度（MIC）处于预期的质量控制范围内，则该储备液适合使用。
3. 开始初始培养。
   1. 在无菌0.9% NaCl中制备测试菌株的0.5麦氏浊度悬浮液，方法如上所述。
   2. 加入100 μ将0.5麦氏浓度的菌悬液1 mL加入含5 mL CAMHB的25 mm × 150 mm玻璃圆底培养管（带不锈钢封盖）中，轻轻涡旋混匀。
   3. 使用无菌接种环，将稀释后的菌悬液一滴在血琼脂平板上进行划线分离，以确认接种物的纯度，并于35 °在环境空气中
   4. 将试管盖盖好，置于试管架上，在35℃摇床中孵育 °在常温空气中培养至少3小时，直至达到对数生长期（参见步骤2.6.1）。培养物在培养箱中培养时，同时进行步骤2.4。
4. 在 25 mm × 150 mm 玻璃培养管中配制抗菌药物溶液。
   1. 从 -80 ℃ 取出抗菌药物储备液 aliquot °将冻存的抗生素置于 C 冷冻室中解冻。解冻后涡旋混匀，以确保抗生素完全溶解。
   2. 在初始培养孵育的同时，向五支灭菌的 25 mm × 150 mm 玻璃培养管中各加入 10 mL CAMHB，并按如下方式加入抗菌药物储备液。
      注意： 进行协同作用研究时，至少应有一种药物的浓度在其单独作用时不影响细菌的生长曲线²⁸；这可以通过在进行协同作用研究之前评估单个药物浓度的效果来确定。
      1. 试管1：加入适量抗生素#1以获得目标终浓度的抗生素。此处，加入10 μ1 mg/mL 多粘菌素储备液的 L，以获得 1 的最终多粘菌素浓度 μg/mL，因为该浓度对本示例所用菌株无效。
      2. 第2管：加入适量的抗生素#2，以获得待测的最终抗生素浓度。此处，加入10 μ1 mg/mL 米诺环素储备液的 L，以获得 1 的终浓度 μg/mL，该浓度对本示例中所用菌株无效。
      3. 第3管：加入等量的抗生素#1 和 抗生素 #2，与第1管和第2管中所用相同。此时，加入10 μ1 mg/mL 米诺环素储备液的 L 和 10 μ1 mg/mL 多粘菌素B储备液的L
      4. 4号管：不添加任何抗生素，作为生长对照管。
      5. 5号管：不添加任何抗生素；此管作为阴性对照管。
5. 准备96孔深孔聚丙烯板，每孔容量为2 mL，用于系列稀释，每孔加入900 µ用多通道移液器将 L 的无菌 0.9% 氯化钠加入第 1–5 列的 B–H 行。
6. 制备起始接种物并加入试管中。
   1. 初始培养物达到对数生长期后（约3小时） 肺炎克雷伯菌，本示例所用的生物体），从摇床中取出培养管，轻轻涡旋混匀，转移约 1 mL 悬液至一支 12 mm × 75 mm 玻璃培养管中，并使用 McFarland 比浊仪检测菌液密度。
      1. 如果小于1.0麦氏单位，将试管放回摇床继续孵育更长时间；如果大于1.0麦氏单位，向试管中加入CAMHB，轻轻涡旋混匀后重新取样，重复该过程直至菌悬液达到1.0麦氏单位。
   2. 加入100 μ将1.0麦氏悬液各1 L加入1-4号试管中，轻轻涡旋混匀。
7. 从每种培养物中取样并进行连续十倍稀释。
   1. 在0时（将细菌加入试管后立即）、1、2、4、6和24小时，分别取出150 μL样品 μ从每支培养管中取等分试样时，倾斜试管，使只有无菌的移液器吸头进入管内，而未灭菌的移液器杆部不接触管内环境。将等分试样分别加入先前准备好的96深孔板第一行的连续孔中。随后将试管放回摇床上的试管架中，在35 °C条件下继续孵育。 °每个时间点取样后，立即将样品放入C环境空气培养箱中培养。
   2. 使用多通道移液器，移除 100 μ从A行取L，加入至B行（B行含有900） μ用移液器将1 mL菌液加入9 mL 0.9%氯化钠溶液中，上下吹打4–5次混匀，制成1:10稀释液。每次稀释后丢弃吸头，以防止细菌交叉污染导致菌落计数假性升高。
   3. 对B-H行重复步骤2.7.2，每行使用新的移液器吸头。
8. 采用滴板法对稀释样品进行涂布，用于菌落计数^29,30.
   1. 用将要接种的抗生素处理条件和稀释度标记 Mueller-Hinton 琼脂平板。
   2. 使用多通道移液器和超长吸头（确保吸头能够触及悬浮液），移除10 μ从第一列各孔中取出 L，小心地逐行点样至相应标记的培养皿上。若使用小培养皿（直径 100 mm），每块培养皿点样 3 行（每行由单列 A-H 孔的液滴组成）；若使用大培养皿（直径 150 mm），每块培养皿点样 8 行。
   3. 待液滴完全干燥（约15分钟）。
   4. 24小时时，取10 μ从其中一个平板的指定区域取一滴阴性对照管中的液体，用于检测无菌性。将平板倒置，并在35℃下过夜培养。 °在环境空气中
9. 计数菌落并计算细胞密度。使用细头永久性标记笔在平板背面标记菌落，以避免重复计数或遗漏菌落。
   1. 首先，检查纯度平板，确保分离的菌落为单一形态，且与待测生物体预期的形态一致。
   2. 对每个稀释系列，选取含有3-30个菌落的液滴（通常每个稀释系列一个液滴）。计数这些液滴中的菌落数量，并记录菌落数及对应的稀释倍数。
      1. 如果在含有3-30个菌落的稀释系列中没有合适的滴加样本，则计数最后一个有菌落的滴加样本中的菌落数。 >30 个菌落以及第一滴 <3个菌落（这些应为相邻的液滴）。
   3. 对于每个稀释系列，根据液滴中菌落数量，使用以下公式计算样品中每毫升的菌落形成单位数（CFU/mL）：CFU/mL = n(1/d)(100) 其中 n 是菌落数量， d 是稀释倍数（未稀释样品（A行）为1，0.1或10）^-1 首次1:10稀释（B行）时，0.01或10^-2 对于第二次1:10稀释（C行），依此类推，常数100用于校正液滴总体积为10 μL这一事实 μL，而最终结果以 CFU/mL 表示，即 CFU/1,000 μL. 使用包含从菌落计数计算CFU/mL公式的电子表格来简化此过程。
      1. 对于稀释系列中可计数的液滴超过一个（或因无液滴落在范围内而需计数两个液滴）的情况，取所有计数液滴的最终CFU/mL数值的平均值。
      2. 由于检测下限为 300 CFU/mL（未稀释液滴中 3 个菌落），记录并绘制菌落计数为 £300 CFU/mL，用于稀释系列中存在的情况 <未稀释液滴中有3个菌落。
   4. 检查24小时的无菌对照液滴；若在此液滴中观察到任何生长，则不应采用该实验结果。
10. 绘制并分析结果。
    1. 将含三种抗生素的培养物及生长对照的生长曲线绘制在同一张图上。横坐标为时间，纵坐标为 x 轴和CFU/mL，采用对数刻度 y 轴
    2. 计算24小时时联合用药组与最有效的单药组在CFU/mL之间的差异。如果差异≥2 log₁₀，认为该组合具有协同作用。然后计算组合管在24小时与0小时之间的CFU/mL差异。如果差异≥3 log₁₀视为联合杀菌。

结果

图1A 展示了一项棋盘格阵列协同实验的网格结果，其中米诺环素（浓度范围为0–32 μg/mL）与多粘菌素（浓度范围为0–16 μg/mL）联用，针对大肠杆菌（E. coli）菌株FDA-CDC 0494进行测试。数值表示在600 nm光密度（OD₆₀₀）下的分光光度读数。OD₆₀₀ 值低于0.07的孔（肉眼观察无细菌生长）以红色阴影标示，而OD₆₀₀ 值为0.07或以上的孔（肉眼观察有细菌生长）以绿色阴影标示。对于每种药物，最低抑菌浓度（MIC；加粗显示）是指能够抑制细菌生长的最低药物浓度。米诺环素的最低抑菌浓度为32 μg/mL，多粘菌素的最低抑菌浓度为8 μg/mL。图1B 保留了相同的着色方式，但在细菌生长被抑制的孔中，数值被替换为部分抑菌浓度指数（FIC_I）值。其计算方法如下：在每个孔中，每种药物的部分抑菌浓度（FIC）通过将该孔中的抗生素浓度除以该药物的MIC得到，FIC_I 则为两种药物FIC值的总和。FIC_I 值为0.5的孔（通常作为协同作用的临界值）以虚线边框标示，FIC_I 值最低的孔（0.094）以加粗显示。由于最小FIC_I 值处于协同作用范围内，因此该药物组合被认为具有协同效应。

图2A 和 图2B 显示的网格与 图1A 和 图1B 中的类似，但在本例中，该组合对测试菌株（K. pneumoniae 分离株 BIDMC 4）未表现出协同作用，因为抑制生长的最低FIC_I为1，该值>0.5。

图3展示了棋盘式协同试验中出现多个跳过孔的光密度读数结果（Enterobacter cloacae 复合群分离株 BIDMC 27）。跳过孔是指尽管相邻孔中抗生素浓度更高但仍出现细菌生长抑制的孔。这一现象在标准 MIC 测试中亦有报道，可能源于不同孔之间细菌生长特性的生物学差异，以及某些抗生素对细菌接种量微小变化的敏感性^23,31,32。若在棋盘式阵列中出现一个以上的跳过孔，则舍弃该次实验结果并重新进行检测。

图4展示了三种药物组合针对肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）分离株BIDMC 32的时程杀菌协同作用结果示例。y轴以对数刻度表示菌落计数，x轴表示时间（小时）。红色条形和数字表示含药物组合试管中初始接种量与24小时后细菌浓度之间的差值，而蓝色条形和数字表示含药物组合的试管与仅含最有效单药的试管在24小时后细菌浓度之间的差值。图4A显示了多粘菌素与米诺环素组合的结果；该组合具有协同作用（24小时时，接受组合处理与仅接受最有效单药处理的细菌浓度差值 ≥2 log₁₀ CFU/mL），且具有杀菌效应（从初始接种量到24小时浓度的下降值 ≥3 log₁₀ CFU/mL）。图4B显示了多粘菌素与克林霉素组合的结果；该组合具有协同作用，但不具杀菌效应。该组合抑制了细菌生长（单独任一药物均无此作用），但未杀死细菌。图4C显示了多粘菌素与红霉素组合的结果；该组合既无杀菌效应，也无协同作用。

图1：棋盘法阵列结果展示协同作用（米诺环素 + 多粘菌素测试针对 E. coli 菌株 FDA-CDC 0494 (A) 棋盘式阵列的分光光度读数与生长结果解读。单元格中的数值为 600 nm 处的光密度读数（OD₆₀₀）。OD值的细胞₆₀₀ OD值低于0.07（目视观察无生长）以红色阴影标注，而OD值₆₀₀ 值为 0.07（对应于通过肉眼观察的生长）的部分用绿色标出。B) 部分抑菌浓度指数（FIC_我）计算。表示生长或无生长的阴影部分已保留。多粘菌素和米诺环素的数值沿 x- 和 y-轴分别表示抑制分数浓度（FIC），即该列或该行中药物浓度与其单独使用的最小抑制浓度（MIC）的比值。每个单元格中的数值即为FIC_我，或该孔中两种药物的FIC之和。由粗虚线边框标出的大区域包含具有FIC的孔_我 0.5。粗边框的孔表示FIC值最低的孔_我 生长受到抑制，或最低FIC_我由于最低FIC_I 若为0.5，则该组合被视为具有协同作用。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2：无协同作用的组合棋盘法阵列结果（米诺环素 + 多粘菌素测试针对 K. pneumoniae 分离 BIDMC 4） (A600 nm 处的光密度值及棋盘格阵列结果的生长解释，如所述 图1A. (B) 部分抑菌浓度指数（FIC_我）计算，方法如前所述 图1A由于最低FIC_我 是 >0.5时，该组合不被视为具有协同作用。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：由于跳过孔位导致无法解读的棋盘式阵列结果（米诺环素 + 多粘菌素用于检测对抗 阴沟肠杆菌 复合分离株 BIDMC 27 600 nm 处的光密度值及棋盘式阵列结果的生长情况解读，如所述 图1A出现多个跳孔现象，即尽管相邻孔中抗生素浓度更高且有细菌生长，但某些孔中细菌生长仍受到抑制。结果无法解读，需重复实验。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图4：三种组合针对肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）分离株BIDMC 32的时杀协同作用结果。 菌落计数以对数刻度表示在y轴上，时间（小时）表示在x轴上。组合组在24小时时的细菌浓度与起始接种量之间的差异由红色条形和数字表示。如果从起始接种量到24小时浓度的下降≥3 log₁₀ CFU/mL，则认为该组合具有杀菌作用。含有组合的试管与仅含最有效单药的试管在24小时时细菌浓度之间的差异由蓝色条形和数字表示；如果浓度降低≥2 log₁₀ CFU/mL，则认为该组合具有协同作用。（A）黏菌素（CST）+ 米诺环素（MIN），一种既具有协同作用又具有杀菌作用的组合。（B）黏菌素 + 克林霉素（CLI），一种具有协同作用但无杀菌作用的组合。（C）黏菌素 + 红霉素（ERY），一种既无协同作用也无杀菌作用的组合。这些结果最初作为一项研究的一部分发表，该研究探讨了含黏菌素组合对黏菌素耐药肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的协同活性，我们在此证明黏菌素可与多种仅对革兰阳性菌个别有效（例如克林霉素）或主要有效（例如红霉素）的抗生素产生协同作用¹⁶。（注意：红霉素在此菌株的棋盘格试验中显示协同作用，但在时杀试验中未显示，因此在此选作非协同组合的示例。）我们假设，已知通过破坏革兰阴性菌外膜通透性发挥作用的黏菌素，可在耐黏菌素的革兰阴性菌中产生亚抑制浓度下的通透化效应，从而允许如克林霉素等通常无法进入革兰阴性菌细胞的药物进入。本图A部分经 Brennan-Krohn、Pironti 和 Kirby 2018¹⁶ 修改，版权 © 美国微生物学会，《抗菌剂与化疗》，62(10)，2018，pii: e00873-18，doi: 10.1128/AAC.00873-18。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本文所述的两种方法均可提供有关联合使用抗菌药物时其活性相对于各自单独使用时活性的信息。自动化喷墨打印机辅助数字分配法是对《临床微生物学操作手册》中所述方法的一种改进³³，而时间-杀菌法则更严格遵循同一参考文献中的相应方案³⁴。

在棋盘格阵列法中，确定每孔所需添加的抗菌剂储备液体积以及这些体积的分配均由自动化完成，从而消除了手动操作棋盘格阵列时可能遇到的一些主要误差来源。然而，研究者仍必须确保原始储备液的配制浓度符合预期，并且目标终浓度已正确输入D300软件中。将抗菌剂悬液加入384孔板的孔中起初可能具有挑战性，需格外小心，以确保移液器吸头准确进入相应孔位，并防止液体溅至孔壁边缘。可使用自动化液体处理仪替代手持多通道移液器，以提高细菌悬液加入孔板的速度和准确性。如实验方案所述，D300系统需要添加表面活性剂聚山梨酯20（P-20），以实现正常的液体处理。已有文献指出，在标准肉汤微量稀释法中，使用浓度为0.002%的另一种表面活性剂聚山梨酯80可降低对多粘菌素MIC <2 µg/mL的微生物的多粘菌素MIC值。^35,36 我们实验室先前已证实，与参考BMD方法相比，浓度高达0.0015%的P-20对D300辅助测定的MIC结果无影响¹⁴。在本实验示例中，P-20的最高浓度为0.0014%。

我们在进行某些棋盘式阵列实验时遇到的一个问题是大量孔位被跳过。这种情况在某些抗生素中出现的比例明显偏高。具体而言，在针对一组碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（Enterobacteriaceae）的药物联用筛选中，我们发现521次试验中有49次（9.4%）因多个孔位被跳过而无法使用，其中12种测试抗生素中的2种（磷霉素和头孢吡肟）占到了46次（94%）。此类较高发生率可能更常见于对接种量效应特别敏感的药物^31,32,37。值得注意的是，美国临床与实验室标准协会（CLSI）不推荐使用肉汤稀释法检测磷霉素的敏感性²⁵，原因是该方法所得结果的可靠性存疑，这可能解释了本研究中该药物结果不稳定的现象。根据研究者的偏好，可对自动化棋盘法进行一些修改。例如，若实验室工作流程需要，可将抗菌药物直接加入已含有细菌悬液的孔板中，而非加入空孔中。尽管本研究使用了384孔板，但该方法也可在96孔板中进行，只需相应调整孔内液体体积。采用96孔板格式可能有助于减少对接种量微小变化特别敏感的抗生素出现跳孔现象。在计算FIC_I时，可能会遇到最小抑菌浓度（MIC）超出检测范围（即高于所测试浓度）的情况，包括被测药物对目标微生物单独作用时无活性的情形。在此类情况下，可假设MIC为比最高测试浓度高一个稀释度的值来计算FIC。这是一种最保守的策略，因为它假设在协同作用测试中观察到抑制效应的任何稀释度下，FIC均取可能的最大值。例如，若实际MIC比最高测试浓度高出两个倍比稀释度，则相应的FIC值将比保守估计值低两倍，依此类推。

为了在时间-杀菌实验中准确评估药物的杀菌活性，必须确保细菌处于对数生长期，尤其是在测试细胞壁活性抗生素时尤为关键²⁸。对于本示例中使用的快速生长细菌（K. pneumoniae），在振荡条件下培养3小时即可达到该生长阶段，但不同微生物可能需要不同的培养时间。通常情况下，菌液应呈现明显但不过度的浑浊。可通过在连续时间点（例如每30分钟一次，持续4–6小时）取样进行菌落计数，绘制生长曲线，以确定合适的培养时间³⁸。时间-杀菌实验中初始接种量的设定也至关重要。目标初始接种浓度约为5 × 10⁵ 至1 × 10⁶ CFU/mL。本文所述的稀释方法（将100 μL 1.0麦氏浊度标准的菌悬液加入10 mL培养基中）适用于肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）及其他我们已测试过的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）菌种。若在使用其他微生物的实验中，初始接种菌液密度显著高于或低于此范围，则可能需要调整稀释比例。（可通过测定0.5或1.0麦氏浊度菌悬液的平板菌落计数，确定该浊度对应的活菌数量，再计算初始菌悬液需稀释的倍数，以获得目标终浓度。）在分析协同作用实验的平板计数结果时，若发现含抗生素试管的初始接种量显著低于生长对照组的初始接种量，可能提示存在抗生素残留效应，或在将细菌加入含抗生素试管至取样涂板的短暂时间内发生了极快速的细菌杀灭。若在系列稀释中，未稀释样本点的菌落数量低于后续稀释度的菌落数量，则提示可能存在抗生素残留效应。已有多种方法被提出用于避免该效应，包括将单次取样液均匀涂布于整块平板³⁸，或在涂板前将样本离心、弃去上清液，并用无菌生理盐水重悬³⁹。在时间-杀菌实验的每个时间点，研究者均需高效且准确地从每支培养管中取出等份样本，并进行系列稀释。操作过程中的延迟，尤其是在连续且早期的时间点，可能导致培养物在非培养、非振荡条件下停留过久；而粗略的加样或稀释操作则可能导致平板计数结果不准确。与涂布平板法（将每种稀释液100 μL均匀涂布于整块琼脂平板）相比，本研究所描述的滴液平板法速度更快，所需琼脂平板数量显著减少，且计数更迅速，因为每个液滴的最大可计数菌落数为30，而涂布平板通常可计数多达300个菌落。然而，若研究者更熟悉涂布平板法，也可选择该方法。若使用多通道移液器加样后液滴发生相互融合，可改用单通道移液器分别点加间距更大的液滴。根据我们的经验，在加样前将平板冷却至4 °C，似乎可减少液滴过度扩散现象。

本文所述技术的一个局限性在于，两种协同作用检测方法（棋盘格阵列法和时间-杀菌法）的结果并不总是一致。由于大多数已发表的协同作用研究仅使用其中一种方法，而非同时结合两种方法，因此可能难以整合这两类检测的数据。由于我们开发的自动化棋盘格阵列法操作简便且通量高，我们实际上将其作为一种筛选手段，用于在更多分离株中测试药物组合，并确定哪些浓度组合具有协同作用。随后，我们针对在棋盘格阵列中表现有效的组合和浓度，开展了少量的时间-杀菌实验。值得注意的是，由于棋盘格检测通常在微量肉汤稀释体系中进行，而时间-杀菌检测使用较大的反应体积（类似于宏量肉汤稀释），我们发现两种方法所得的FIC值有时存在差异，通常在时间-杀菌实验中需要更高的浓度才能观察到活性。此前已有报道指出，当比较革兰阴性杆菌的宏量与微量肉汤稀释MIC检测结果时²⁶，以及当时间-杀菌实验中使用的较大接种量与微量肉汤稀释和棋盘格阵列检测中标准接种量进行比较时³²，也会出现类似现象。棋盘格阵列检测的一个具体局限性在于微量肉汤稀释MIC测试本身固有的变异性²²。尽管协同作用的FIC_I 判断阈值已在数学上对这种变异性进行了校正⁶，但这种变异性仍不可避免地引发人们对棋盘格阵列结果可靠性和一致性的担忧。

由于所有体外协同作用检测方法本身存在局限性（包括在人工培养基中培养细菌、抗生素浓度恒定以及作用时间有限），通过这些方法获得的结果必须通过补充技术进行验证和进一步评估。此类方法包括体外药代动力学/药效学（PK/PD）研究（例如中空纤维感染模型⁴⁰）、动物模型，以及最终的人体PK/PD和疗效研究。本文所述的自动化棋盘格阵列方法提供了一种快速筛选潜在协同作用组合的手段，从而更有针对性地利用上述技术。进一步实现这些方法的自动化，以及更系统地研究体外参数与临床结果之间的关系，对于扩大协同作用检测的应用规模并提高其临床适用性具有重要意义。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Escherichia coli 菌株 ATCC 25922	ATCC	25922	质控菌株
0.5 mL 微量离心管	USA Scientific	1605-0000
1 L 0.22 µm 瓶顶过滤器	Thermo Scientific Nalgene	597-4520
12 mm × 75 mm 硼硅酸盐玻璃圆底培养管	Fisherbrand	14-961-26
15 mL 圆锥形离心管	Phenix	SS-PH15
15 × 100 mm 或 15 × 150 mm 水解酪蛋白琼脂平板	Thermo Scientific	R01620 或 R04050
25 mm 不锈钢密封盖（用于 25 × 150 mm 玻璃培养管）	Bellco	2005-02512
25 × 150 mm 硼硅酸盐玻璃圆底培养管	Bellco	2011-25150
348 孔无菌透明平底未处理微孔板（带盖）	Greiner Bio-One	781186
50 mL 圆锥形离心管	Phenix	SS-PH50
50 mL 无菌试剂储液槽	Corning	4870
96 深孔聚丙烯微孔板（每孔 2 mL）	Fisherbrand	12-566-612
96 孔无菌透明圆底未处理微孔板（带盖）	Evergreen	222-8032-01R
阳离子调节水解酪蛋白肉汤	BD Diagnostics	212322
硫酸多粘菌素	Alfa Aesar	J60915
D300e 控制软件	HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland 比浊仪	bioMérieux	21250
Excel 电子表格软件	Microsoft
超长 SHARP 10 µL 精密屏障吸头	Denville Scientific	P1096-FR
HP D300 数字分配仪	HP/Tecan
HP D300 T8+ 加样卡盒	HP/Tecan	30097370
盐酸米诺环素	Chem-Impex	14302
Picus 12 通道 10–300 µL 移液器	Sartorius	735461
聚山梨酯 20	Fisher Bioreagents	BP-337	商品名：Tween 20
氯化钠	Fisher Chemical	S271
分光光度计	Tecan	Infinite M1000 PRO
Xplorer 12 通道 50–1200 µL 移液器	Eppendorf	2231000328