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方法文章

大规模自上而下蛋白质组学采用毛细管区带电泳串联质谱法

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DOI：

10.3791/58644

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2018年10月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Michigan State University, 2Department of BioHealth Informatics, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 3Center for Computational Biology and Bioinformatics, Indiana University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文详细描述了一种利用毛细管区带电泳-电喷雾电离-串联质谱法（CZE-ESI-MS/MS）对蛋白质样品中的蛋白质变体进行分离、鉴定和表征的实验方案。该方案可用于简单蛋白质样品中蛋白质变体的高分辨率表征，以及复杂蛋白质组样品中蛋白质变体的大规模鉴定。

摘要

毛细管区带电泳-电喷雾电离-串联质谱法（CZE-ESI-MS/MS）已被公认为是一种用于自上而下蛋白质组学研究的有效工具，旨在对复杂蛋白质组中的蛋白质变体进行表征。然而，由于毛细管区带电泳（CZE）的样品负载量低且分离时间窗口窄，其在大规模自上而下蛋白质组学中的应用受到限制。本文描述了一种采用微升级样品加载体积和90分钟分离时间窗口的CZE-MS/MS方法，适用于大规模自上而下蛋白质组学分析。该CZE-MS/MS平台基于一种涂覆线性聚丙烯酰胺（LPA）的分离毛细管，具有极低的电渗流；采用基于动态pH连接的在线样品富集方法，可高效实现蛋白质堆积；配备电驱动泵式鞘流CE-MS接口，灵敏度极高；并结合具有高质荷比分辨率和扫描速度的离子阱质谱仪。该平台可用于对简单的完整蛋白质样品进行高分辨率分析，以及对多种复杂蛋白质组中的蛋白质变体进行大规模表征。例如，利用该平台实现了标准蛋白质混合物的高效分离，并对多种杂质实现了高灵敏度检测。另一个示例表明，在单次CZE-MS/MS运行中，该平台可从大肠杆菌（Escherichia coli）蛋白质组中鉴定出超过500种蛋白质变体和190种蛋白质。

引言

自上而下的蛋白质组学（TDP）旨在对蛋白质组中的蛋白质变体进行大规模表征。由于蛋白质组具有高度复杂性和宽广的浓度动态范围，TDP依赖于在电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）分析之前对完整蛋白质进行高效的液相分离1,2,3,4,5。毛细管区带电泳（CZE）是一种基于生物分子荷质比实现分离的强有力技术6。CZE方法相对简单，仅需一根开放式熔融石英毛细管、背景电解质（BGE）和电源即可完成。完整蛋白质样品可通过压力或电压加载至毛细管中，通过将毛细管两端浸入BGE并施加高电压来启动分离过程。CZE在生物分子分离中可达到极高的分离效率（>一百万理论塔板数）7。与广泛使用的反相液相色谱（RPLC）-MS相比，CZE-MS在完整蛋白质分析中具有显著更高的灵敏度8。尽管CZE-MS在大规模自上而下蛋白质组学中具有巨大潜力，但其在蛋白质组学中的广泛应用仍受到若干问题的限制，包括样品负载量低和分离时间窗口窄。CZE中的典型样品加载体积约为毛细管总体积的1%，通常对应于不足100 nL9,10,11。由于强烈的电渗流（EOF），CZE的分离时间窗口通常少于30分钟9,10。这些问题限制了CZE-MS/MS从复杂蛋白质组中鉴定大量蛋白质变体以及低丰度蛋白质变体的能力。

人们已付出大量努力以提高毛细管区带电泳的样品加载体积 通过 在线样品浓缩方法例如，固相微萃取 [SPME]12,13场增强样品堆积 [FESS]9,11,14，以及动态 pH 连接15,16,17,18）。FESS 和动态 pH 界面比 SPME 更简单，仅需样品缓冲液与背景电解质（BGE）在电导率和 pH 值上存在显著差异。FESS 采用电导率远低于 BGE 的样品缓冲液，导致分析物在毛细管中样品区带与 BGE 区带交界处发生堆积。动态 pH 界面则利用一个碱性样品塞（例如，50 mM 碳酸氢铵，pH 8）和酸性BGE（例如，5% [v/v] 乙酸，pH 2.4）置于样品塞的两侧。在毛细管进样端施加高正电压后，碱性样品塞发生滴定反应，使分析物聚焦为一个紧密的样品塞，随后进行CZE分离。近期，Sun课题组系统比较了FESS与动态pH junction在线富集完整蛋白质的性能，结果表明，当样品进样体积为毛细管总体积的25%时，动态pH junction在完整蛋白质的在线浓缩中表现显著优于FESS19.

已采用中性涂层分离毛细管（例如，线性聚丙烯酰胺 [LPA]），以减少毛细管中的电渗流（EOF），从而减缓毛细管区带电泳（CZE）的分离速度并拓宽分离时间窗口20,21。最近，Dovichi 研究组开发了一种简便的方法，利用过硫酸铵（APS）作为引发剂，并通过温度（50 °C）引发自由基生成和聚合反应，从而在毛细管内壁形成稳定的 LPA 涂层22。更近的研究中，Sun 研究组将 LPA 涂层分离毛细管与动态 pH 结合技术相结合，实现了完整蛋白质的毛细管区带电泳分离，样品加载体积达到微升级别，分离时间窗口长达 90 分钟19。该 CZE 系统为大规模自上而下蛋白质组学中应用 CZE-MS/MS 技术开辟了新途径。

CZE-MS 需要一种高度稳定且灵敏的接口，以实现 CZE 与 MS 的联用。在 CE-MS 的发展历程中，已有三种 CE-MS 接口得到充分开发并实现商业化，其中一种为同轴鞘流接口23，采用多孔尖端作为电喷雾电离发射器的无鞘层接口24以及电驱动泵鞘流接口25,26基于电驱动泵控鞘流接口的毛细管区带电泳-串联质谱技术已达到zeptomole级别的肽段检测限9单次运行中从HeLa细胞蛋白质组获得超过10,000个肽段鉴定（IDs）14一种对完整蛋白质进行快速表征的方法11，以及对生物分子进行高度稳定且可重复的分析26最近，LPA 涂层分离毛细管、动态 pH 结合方法以及电驱动泵鞘流接口被用于大规模自上而下蛋白质组学分析 大肠杆菌 (E. coli蛋白质组19,27单次运行中，CZE-MS/MS 平台接近鉴定出 500 种蛋白质变体19 近6,000个蛋白质异构体鉴定结果 通过 与尺寸排阻色谱（SEC）-反相液相色谱（RPLC）分级联用27结果清楚地展示了毛细管区带电泳-串联质谱（CZE-MS/MS）在大规模自上而下蛋白质组学中的应用能力。

本文详细描述了利用毛细管区带电泳-串联质谱法（CZE-MS/MS）进行大规模自上而下蛋白质组学分析的实验流程。该CZE-MS/MS系统采用LPA涂层毛细管以减少毛细管内的电渗流，利用动态pH junction方法实现蛋白质的在线富集，通过电动泵驱动的鞘流接口实现CZE与质谱的耦合，采用Orbitrap质谱仪采集蛋白质的MS和MS/MS谱图，并使用TopPIC（基于自上而下质谱的蛋白质变体鉴定与表征）软件进行蛋白质变体鉴定。 通过 数据库检索

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方案

1. 分离毛细管内壁线性聚丙烯酰胺涂层的制备

  1. 毛细管预处理
    1. 使用注射泵依次用500 µL的1 M氢氧化钠、去离子水、1 M盐酸、去离子水和液相色谱-质谱（LC-MS）级甲醇冲洗一根熔融石英毛细管（长度120 cm，内径50 µm，外径360 µm）。
    2. 用氮气（10 psi，≥12小时）干燥毛细管，并使用注射泵将50%（v/v）甲基丙烯酸-3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯的甲醇溶液填充至毛细管中。用硅橡胶密封毛细管两端，并在室温下孵育至少24小时。
      注意：此步骤中，毛细管内壁被修饰上C=C基团。更长的孵育时间可使反应更完全，从而获得更好的毛细管涂层。
    3. 用切割刀从毛细管两端各切去一小段（约5 mm）。使用注射泵以甲醇（500 µL）冲洗毛细管，以清除未反应的试剂。再用氮气（10 psi，≥12小时）干燥毛细管。
  2. 线性聚丙烯酰胺（LPA）涂层的制备
    注意：本步骤基于Zhu et al.22的方法并进行了少量修改。
    1. 配制丙烯酰胺溶液（40 mg丙烯酰胺溶于1 mL水中）和过硫酸铵（APS）溶液（5% [w/v] 水溶液）。
    2. 将2–3 µL APS溶液加入500 µL丙烯酰胺溶液中，涡旋混合，并用氮气脱气5分钟，以去除溶液中的氧气。
    3. 通过真空将上述混合液吸入预处理过的毛细管中，用硅橡胶密封两端，然后在50 °C水浴中孵育40分钟。
    4. 用切割刀从毛细管两端各去除一小段（约5 mm）。使用注射泵以水（200 µL）将未反应的溶液从毛细管中推出。
      注意：确保被推出的聚合产物呈琼脂糖凝胶状。延长孵育时间（可达约45–50分钟）可获得更优的毛细管涂层。随着反应时间延长，毛细管可能堵塞，需施加较高压力才能将聚合物用水推出，此时可使用高效液相色谱（HPLC）泵完成此操作。

2. 氢氟酸蚀刻毛细管

警告：操作氢氟酸（HF）溶液时需采用适当的安全规程。所有与氢氟酸相关的操作必须在化学通风橱中进行。在进行任何氢氟酸操作前，确保备有2.5%葡萄糖酸钙凝胶，以备接触后使用。必须佩戴双层手套，内层为普通腈类手套，外层为厚实的氯丁橡胶手套。同时需穿着实验服并佩戴化学防护眼镜。氢氟酸操作结束后，液体和固体危险废物应分开存放。液体氢氟酸废物在等待回收前，必须立即用高浓度氢氧化钠溶液中和。固体氢氟酸废物需临时储存在塑料容器中，容器内部衬有两层厚的1加仑塑料自封袋，并加盖密封。液体和固体废物均须正确贴上标签。

  1. 使用温和的火焰（例如，打火机）灼烧毛细管的一段，以去除毛细管一端约4 cm处长度为1 cm的聚酰亚胺外涂层。轻轻擦拭灼烧部位，彻底清除聚酰亚胺涂层。
    注意：操作时需谨慎，因去除聚酰亚胺涂层后的毛细管部分会略显脆弱。
  2. 在200 µL离心管的管壁末端钻一个与毛细管外径相近的小孔，以便将毛细管穿入并固定。将靠近灼烧部位的毛细管端穿过该孔，直至灼烧段完全进入管内。
    注意：建议使用远离灼烧部位的毛细管末端测试孔径大小，以确保合适，因为灼烧部分的毛细管较为脆弱。
  3. 向200 µL离心管中加入约150 µL氢氟酸（HF，48%–51%水溶液），使液面达到毛细管灼烧段约一半高度。将毛细管在室温下浸入HF溶液中孵育90–100分钟。
    注意：建议在管盖上另钻一个小孔，并使用小物件（例如，小移液器吸头）将离心管悬空支撑。可用移液器吸头刺穿泡沫板或其他固体平台，使反应容器悬挂其上，以创造安全的操作环境。在含HF的离心管下方铺设纸巾，并按规范程序应对可能的泄漏。
  4. 将毛细管从离心管中取出，并用去离子水冲洗其外表面，以彻底去除残留的HF。
    注意：应确保毛细管灼烧部分最窄处的外径已缩小至小于100 µm，符合预期。
  5. 使用刻划石在蚀刻部分最窄处的中段切断毛细管，从而获得一端外径小于100 µm的分离毛细管。将未蚀刻的一端切断，截取一段长度为1 m的分离毛细管。
    注意：HF废液应按照机构规定的处理程序进行处置。

3. 样品制备

  1. 标准蛋白质混合物的制备
    1. 配制含有细胞色素 c（Cyto.c，12 kDa，0.1 mg/mL）、溶菌酶（14.3 kDa，0.1 mg/mL）的标准蛋白质混合物 β酪蛋白（24 kDa，0.4 mg/mL）、肌红蛋白（16.9 kDa，0.1 mg/mL）、碳酸酐酶（CA，29 kDa，0.5 mg/mL）和牛血清白蛋白（BSA，66.5 kDa，1.0 mg/mL）溶于LC-MS级水制成储备液。
      注意：该储备液可分装后于 -80 ℃ 保存 °C 以供使用。
    2. 用LC-MS级水配制的50 mM碳酸氢铵溶液（pH 8.0）将储备液稀释10倍，用于CZE-MS分析。
      注意：使用膜滤器过滤碳酸氢铵溶液后再使用例如, 0.2 µ硝酸纤维素膜，50 毫米直径
  2. 制备 大肠杆菌 样品
    1. 培养 大肠杆菌 （K-12 MG1655）细胞在 LB 培养基中于 37 °C，同时以 225 rpm 振荡，直至 OD600 值接近 0.7。收集 大肠杆菌 细胞 通过离心（3,283 × g，10 分钟）并用磷酸盐缓冲液（PBS）多次洗涤以去除培养基。
    2. 悬浮 大肠杆菌 在含有8 M尿素、蛋白酶抑制剂和100 mM碳酸氢铵（pH 8.0）的裂解缓冲液中重悬细胞，使用带杯状探头的超声波细胞破碎仪在冰上进行15分钟超声处理，以实现完全的细胞裂解。
      1. 设置 占空比 (%) 至 50 并设置 输出控制 调节至7档用于超声细胞破碎仪。
    3. 将裂解液在 18,000 x g 离心10分钟，收集上清液并弃去沉淀。取少量上清液，用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度。
      注意：为了与 BCA 法兼容，裂解液需要至少稀释三倍，以使尿素浓度降至 3 M 以下。BCA 法按照制造商的操作步骤进行。
    4. 将1 mg的 大肠杆菌 用体积比为1:4的冷丙酮处理蛋白质，并将混合物置于-20 ℃ °C过夜以沉淀蛋白质。
      注意：所有使用丙酮的实验均须在化学通风橱中进行。
    5. 离心沉淀蛋白质（12,000 x g，5 分钟）并去除上清液。用预冷的丙酮再次洗涤沉淀（体积与前次相同），再次离心。
    6. 移除上清液，将沉淀物置于通风橱中干燥数分钟。
      注意：切勿将蛋白质沉淀过度干燥。
    7. 溶解沉淀物 大肠杆菌 蛋白质（1 mg）溶于 200 µ8 M 尿素的 100 mM 碳酸氢铵（pH 8.0）溶液
    8. 使样品变性、还原和烷基化。
      1. 在 37 ℃ 下孵育样品 °30 分钟，以变性蛋白质。
      2. 使用二硫苏糖醇（DTT）进行还原，加入 2 µ将 1 M DTT 溶液（溶于 100 mM 碳酸氢铵）加入样品中，并在 37 °C 下孵育样品 °30 分钟，C
      3. 使用碘乙酰胺（IAA）对蛋白质进行烷基化，加入 6 µ加入 1 M IAA 溶液（溶于 100 mM 碳酸氢铵）至终体积为 L，于室温避光孵育 20 分钟。
      4. 通过加入2 µ加入1 M DTT溶液L，室温孵育5分钟。用甲酸（FA）酸化样品，使FA终浓度为1%（v/v）。
        注意：还原和烷基化步骤旨在促进蛋白质 unfolding，以利于后续的片段化。这些步骤将丢失蛋白质中二硫键的信息。如果研究目标是分析蛋白质中的二硫键，请避免执行这些步骤。请务必在化学通风橱中操作所有浓酸溶液。
    9. 使用 C4 捕获柱对样品进行脱盐（例如，内径4 mm，长10 mm，填充有3-µ300-的微粒Å 孔）连接至高效液相色谱系统，使用紫外检测器在254 nm波长下进行检测。
      1. 将流动相流速设置为1 mL/min。用80%（v/v）乙腈（ACN）、0.1%甲酸（FA）水溶液冲洗色谱柱10 min以活化色谱柱，再用2%（v/v）ACN、0.1% FA水溶液冲洗10 min进行平衡。
      2. 加载 500-µ将g蛋白上样至色谱柱，并以流速1 mL/min、用含2%（v/v）乙腈和0.1%甲酸的水溶液冲洗10分钟进行脱盐。
      3. 用80%（v/v）乙腈、0.1%甲酸水溶液以1 mL/min流速洗脱蛋白质，持续3分钟。收集洗脱液，并用真空浓缩仪冻干。
        注意：C4 捕获柱可用于脱盐大量蛋白质，但由于可能的样品损失，不适用于低微克量级的蛋白质。对于有限的蛋白质样品，可考虑使用含 C4 介质的移液枪头进行蛋白质脱盐。在冻干样品时，注意避免蛋白质过度干燥。
    10. 溶解 500 µ假设样品制备过程中无损失，250微升中含g级蛋白质 µ50 mM 碳酸氢铵（pH 8.0）溶液，用于 CZE-MS 实验。

4. CZE-MS/MS 系统的设置与样品分析

  1. 毛细管区带电泳系统的设置
    1. 配制含有5%或10%（v/v）乙酸（pH ~2.4 或 ~2.2）的背景电解质溶液（BGE），使用LC-MS级水。取约1.5 mL该BGE溶液置于与CZE自动进样器缓冲液托盘匹配的BGE小瓶中。
      注意：每周新鲜配制BGE，并每天更换样品瓶中的BGE溶液，以避免任何污染。
    2. 加入样品溶液（5 - 200 µL）将样品加入插管，并将插管放入与CZE自动进样器样品盘相匹配的样品瓶中。
    3. 将样品、背景电解质（BGE）和分离毛细管装入CZE自动进样器中。
      注意：本方案中使用的语言最准确地反映了某一特定自动进样器的使用（见 材料表），但这些原理可应用于其他自动进样器。
      1. 选择 样品上样 在CZE自动进样器的手动控制页面中，将BGE小瓶装入自动进样器的缓冲液托盘中，并记录其在缓冲液托盘中的位置。将样品小瓶装入自动进样器的样品托盘中，并记录其在样品托盘中的位置。
        注意：可通过点击仪器图片以手动控制方式操作仪器 设备监控器 在主仪器页面上，然后选择 手动 在 直接控制.
      2. 将分离毛细管的未刻蚀端插入CZE自动进样器中，并将自动进样器置于 校准 使用手动控制进行定位。将毛细管未刻蚀的一端穿入用于固定分离毛细管的孔中，直至无法再物理穿入为止。
        注意：本案例中，毛细管末端几乎与电极末端处于同一高度，且至少高出50 µ样品瓶中需要有 L 的样品，以确保进样时毛细管末端浸入样品中。如果样品体积较少（即, 5 µL），需要按照步骤4.1.3.2.1中的描述调节毛细管进样端的高度。
        1. 如果样品体积低于 50，调整毛细管进样端的高度 µL (即, 5 µL）。将自动进样器切换至 待机 使用手动控制。在系统中输入样品位置，并将毛细管移至样品处。将毛细管的进样端进一步下推，以触及样品瓶底部。
          注意：在此情况下，样品进样可使用仅含5 μL样品的样本 µ样品瓶中的 L。
      3. 继续使用手动控制，以20 psi的压力用BGE冲洗毛细管20分钟。
  2. CZE-MS 接口的设置
    1. 拉制一根硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1 mm，内径0.75 mm，长10 cm），制成两个喷嘴孔径为20 - 40的电喷雾发射器 µ分钟（光密度）
      注意：电喷雾发射器的长度应保持在 4 - 5 cm，必要时使用刻划刀切割。所有玻璃废弃物须弃置于锐器容器中。“20 至 40”的设定参数µm 尖端的设置如下：将加热温度设为 498，拉力设为 5，速度设为 10，延迟设为 150，压力设为 200。使用前用显微镜检查喷嘴尺寸，必要时可略微调整参数。
    2. 安装商用的电驱动泵式鞘流接口（参见 材料表)移至质谱仪前端。向鞘液缓冲液储液槽中加入含有10%（v/v）甲醇和0.2%（v/v）甲酸的LC-MS级水溶液。
    3. 冲洗 T 在鞘流缓冲液接口中 通过 使用注射器手动施加压力。将外径为1 mm的电喷雾发射器一端穿过套管，并将发射器与鞘流接口的一个端口连接 T通过 一个接头。只需冲洗 T 用注射器手动再次填充鞘液缓冲液以充满喷雾头。
    4. 利用接口附带的摄像头，调节喷雾器出口与质谱仪入口之间的距离至约2 mm。在鞘液缓冲液瓶处施加2至2.2 kV电压以产生电喷雾。调节喷雾电压，直至获得稳定的电喷雾。
      注意：如果未观察到电喷雾或电喷雾不稳定，应检查接口，确保喷雾头、毛细管中无大气泡 T，以及连接鞘液瓶与 T喷雾器出口与质谱仪入口之间的距离可通过与喷雾器外径（1 mm）相比较进行粗略估计。喷雾电压取决于喷雾器的尺寸。对于20至40-µm 发射器，2 - 2.2 kV 已足够。使用高电压时务必始终小心谨慎。
    5. 关闭喷雾电压，轻轻将分离毛细管的刻蚀端穿过 T 直至无法继续推进。施加低压（即在毛细管进样端施加 5 psi 压力，以确保毛细管内无气泡。
      注意：毛细管已连接至 T 通过 套管和接头。借助摄像头调整毛细管刻蚀端在喷嘴中的位置，使其偏差在500以内 µm. 可通过与直径为1 mm的喷雾器进行比较，粗略估计该距离。
    6. 停止在毛细管进样端施加低压。用鞘液缓冲液略微冲洗喷雾器。再次施加 2 - 2.2 kV 的喷雾电压以测试喷雾情况。
  3. 建立用于样品进样、分离、毛细管冲洗及触发质谱数据采集的毛细管区带电泳方法
    1. 选择 新方法 在……的条件下 文件 在主仪器屏幕上的下拉菜单中启动新方法。
    2. 选择 进样口 如 SV/EV， 托盘 作为样品， 压力 5 psi KV 作为0，且 时长 样品注入时间为95秒。
      注意：样品被注入毛细管中 通过 施加压力。可根据压力和进样时间，利用泊肃叶定律计算样品进样体积。例如，95秒的样品进样施加5 psi压力，对应于1米长分离毛细管（50-µm i.d.)
    3. 选择毛细管区带电泳分离参数，并设置数据采集触发参数。
      1. 设置 进样口 如 InV， 托盘 作为缓冲液， 压力 0 psi KV 如30，以及 时长 如标准蛋白质混合物样品的分离时间为4,200秒。设置 进样口 如 InV， 托盘 作为缓冲液， 压力 为0 psi， KV 如20，以及 时长 6,600 秒用于分离 大肠杆菌 蛋白质组样品
        注意：分离所用的电压可根据样品复杂性进行调整。对于简单的蛋白质样品，可施加30 kV以加快分析速度；对于复杂样品，则施加20 kV以减缓分离过程，从而获得更多的MS/MS谱图用于蛋白质变体鉴定。
      2. 设置触发数据采集的参数 时间事件设置 时间（s） 为 0.0 和 类型 作为继电器1用于 启动 在步骤1中；设置 时间（s） 为1.0和 类型 作为继电器1 停用 在步骤 2 中
    4. 选择 进样口 如 InV， 托盘 作为缓冲液， 压力 10 psi KV 如30，和 时长 毛细管冲洗时间为600秒。
    5. 保存毛细管区带电泳-质谱（CZE-MS）和串联质谱（MS/MS）实验的方法文件。
  4. 质谱与串联质谱的设置
    1. 使用四极杆离子阱质谱仪设置完整蛋白质分析的质谱和串联质谱参数（参见 材料清单).
      注意：采用正离子模式和高能碰撞解离（HCD）进行碎裂。
      1. 调整调谐文件设置：开启 完整蛋白质模式 并使用0.2的捕获压力。将离子传输毛细管温度设为320 °C 和 s-透镜射频水平调至 55。
      2. 构建质谱（MS）和串联质谱（MS/MS）方法文件。
        1. 对于全扫描质谱，将微扫描次数设置为3，分辨率设置为240,000（在 m/z 200），自动增益控制（AGC）目标值设为1E6，最大注入时间设为50 ms，扫描范围设为600 - 2000 m/z.
      3. 对于 MS/MS，采用数据依赖性采集（DDA）模式，针对全扫描 MS 谱中强度最高的八个离子进行。将隔离窗口设为 4 m/z 并将归一化碰撞能量（NCE）设为20%。将微扫描次数设为1，分辨率设为120,000（在 m/z 200），AGC目标值设为1E5，最大注入时间设为200 ms。
      4. 将触发碎裂的离子强度阈值设为1E5，并对电荷态高于5的离子进行选择以进行碎裂。开启 排除同位素 并将动态排除设置为 30 s。
        注意：MS/MS 的微扫描次数可增加至 3 次。在此情况下，可采用 Top3 DDA 方法以缩短循环时间。
    2. 在毛细管电泳自动进样器与质谱仪之间建立有线连接，以实现数据采集的自动触发。将导线一端连接至 继电器1 触点A 和 继电器1触点B 在CE自动进样器背面。将导线另一端连接至 开始于 - 和 开始 In + 在质谱仪的一侧。
  5. CZE-MS/MS 实验与样品分析
    1. 在样品进样端使用毛细管电泳手动控制施加30 kV电压，同时使用外接电源在鞘液缓冲液瓶端施加2 - 2.2 kV电压，以测试分离毛细管和电喷雾。
      注意：此处的分离电流约为 8 - 9 µ若使用5%（v/v）乙酸作为背景电解质。
    2. 在质谱仪计算机上选择新建序列，设置数据采集序列。
      1. 选择 未知 作为样本类型，并指定文件名和路径。在每次样本运行下标明将要使用的质谱方法 仪器方法.
        注意：由于毛细管电泳自动进样器由独立的计算机控制，此处无需指定样品位置。
    3. 在毛细管电泳计算机上设置CZE分离序列，以指定缓冲液位置、样品位置和CZE方法。要开始新序列，请选择 序列 在……的条件下 分析 主仪器页面上的下拉菜单。
    4. 首先在质谱仪计算机上选择数据采集方法以启动数据采集 运行序列 或 运行样品 单次运行）。然后，在CE自动进样器计算机上启动CE序列。
      注意：在样品注入后开启分离电压时，毛细管电泳自动进样器会向质谱仪发送信号，以触发数据采集。由于动态pH junction样品堆积效应，分离初期电流会下降，随后逐渐恢复。

5. 使用 TopPIC 软件对采集的原始文件进行数据库搜索

  1. 将包含 MS 和 MS/MS 数据的 .raw 文件从质谱仪计算机转移至专门用于数据库搜索的计算机。
    注意：这些 .raw 文件可能体积较大，需要高性能计算机才能实现快速数据库搜索。
  2. 在专门用于数据库搜索的计算机上下载 ProteoWizard 和 TopPIC 套件。
    注意：ProteoWizard 和 TopPIC 套件为开源软件，可在线获取（ProteoWizard：http://proteowizard.sourceforge.net；TopPIC 套件：http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/）。数据库搜索使用 UniProt 数据库，可在 UniProt 官网获取。
  3. 使用 ProteoWizard 中的 MS 文件格式转换工具 msconvert 将 .raw 文件转换为 .mzML 文件28。在 msconvert 的图形界面（MSConvertGUI.exe）中，点击 浏览 按钮并选择要转换的 .raw 文件。选择 mzML 作为输出格式，其余选项均保持默认设置。点击图形界面右下角的 开始 按钮。
  4. 使用 TopPIC 套件中的 TopFD 工具将 .mzML 文件转换为 .msalign 文件29。
    1. 在 TopFD 的图形界面（topfd_gui.exe）中，点击 文件 按钮并选择上一步生成的 .mzML 文件。保持参数的默认值，然后点击图形界面右下角的 开始 按钮。
      注意：TopFD 将前体离子和碎片离子的同位素簇转换为单一同位素质量，并通过结合具有相似单一同位素质量和相近迁移时间的前体离子同位素簇，识别 MS1 数据中可能的蛋白变体特征。TopFD 将生成三个文件，分别为 ms1.msalign 文件、ms2.msalign 文件和 .feature 文件。ms1.msalign 和 ms2.msalign 文件分别包含 MS1 和 MS/MS 谱图去卷积后的单一同位素质量。.feature 文件包含可能的蛋白变体特征。
  5. 使用 TopPIC 套件中的 TopPIC（版本 1.1.3）进行数据库搜索30。
    1. 在 TopPIC 图形界面（toppic_gui.exe）中，点击 数据库文件 并选择合适的搜索数据库。
    2. 点击 谱图文件 并选择第 5.4.1 步生成的 ms2.msalign 文件作为输入。选择 MS1 特征文件 并指定第 5.4.1 步生成的 .feature 文件。
    3. 由于 IAA 处理，将半胱氨酸的羧甲基化（C57）设为固定修饰。
      注意：也可使用文本编辑器创建包含多种固定修饰的文本文件，然后在 TopPIC 图形界面中通过 固定修饰 旁边的 文件 按钮选择该文本文件。
    4. 选择 反向数据库 功能，在截断设置下拉菜单中选择 FDR（错误发现率），位于 谱图水平 旁边。将谱图水平的 FDR 设为 0.01，蛋白变体水平的 FDR 设为 0.05。
      注意：TopPIC 提供多种结果过滤选项：谱图水平 FDR、蛋白变体水平 FDR 或两者同时使用。FDR 基于目标-反向数据库方法进行评估31。
    5. 不选择 生成函数，并将 误差容限（ppm） 设置为 15。
    6. 在 高级参数 下，从下拉菜单中选择最大质量偏移数为 2。将未知修饰的 最大质量偏移（Da） 设为 500 Da。其余参数保持默认值，点击图形界面右下角的 开始 按钮。
      注意：TopPIC 软件生成两个结果文本文件。后缀为 .OUTPUT_TABLE 的文件包含已鉴定的蛋白变体-谱图匹配（PrSMs）列表，后缀为 .FORM_OUTPUT_TABLE 的文件包含已鉴定的蛋白变体列表。对于每个 PrSM，软件提供匹配的一般信息、观测到的碎裂模式、匹配的碎片离子以及检测到的质量偏移。

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结果

图1 展示了基于动态 pH 界面的毛细管区带电泳-电喷雾质谱联用系统（CZE-ESI-MS）在实验中所用的示意图。将一段较长的、溶于碱性缓冲液中的样品注入内壁涂覆有 LPA 的分离毛细管中，该毛细管预先充满酸性背景电解质（BGE）。施加高电压 I 和 II 后，样品区带中的分析物将被富集 通过 动态pH结方法。为评估CZE-MS系统的性能，通常分析一种标准蛋白质混合物（细胞色素c、溶菌酶、β-酪蛋白、肌红蛋白、CA和BSA）。标准蛋白质混合物的代表性电泳图如下所示 图2A标准蛋白混合物通常至少重复运行两次，以评估系统的分离效率和重现性。分离效率可通过某些蛋白质的理论塔板数来评估，如图所示 图2B可通过蛋白质强度和迁移时间的相对标准偏差来评估重现性。 图3

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讨论

本文提供了一种详细的方案，利用毛细管区带电泳-串联质谱法（CZE-MS/MS）对简单蛋白质样品中的蛋白质变体进行高分辨率表征，并对复杂蛋白质组样品中的蛋白质变体进行大规模鉴定。图示为CZE-ESI-MS/MS系统的示意图 图1该方案中有四个关键步骤。首先，在分离毛细管内壁上制备高质量的LPA涂层至关重要。经LPA涂层处理的分离毛细管可降低毛细管内的电渗流，拓宽毛细管区带电泳的分离窗口，并减少蛋白质在其内壁上的吸附19. 制备LPA涂层的聚合反应进行如下 通过 将毛细管填充入丙烯酰胺（单体）与过硫酸铵（聚合引发剂）的混合物，随后将毛细管置于水浴中加热以引发反应22水浴中的反应时间至关重要。反应时间过短会导致反应不完全，涂层质量差。我们通常将反应时间延长至50分钟，以确保反应充分进行，获得更佳的涂层效果。若反应时间过长，毛细管可能发生堵塞，此时可能需要使用高效液相色谱（HPLC）泵通过水冲洗将毛细管内的聚合物推出。根据文献报道及我们的经验，一根LPA涂层毛细管可连续使用...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢密歇根州立大学化学系Heedeok Hong课题组慷慨提供实验所用的大肠杆菌（Escherichia coli）细胞。作者感谢美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（National Institute of General Medical Sciences, National Institutes of Health）通过资助项目R01GM118470（授予X. Liu）和R01GM125991（授予L. Sun和X. Liu）提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
熔融石英毛细管Polymicro Technologies106815001750 µm 内径，360 µm 外径
氢氧化钠颗粒Macron Fine Chemicals7708-10腐蚀性
LC-MS 级水Fisher ScientificW6-1
盐酸Fisher ScientificSA48-1腐蚀性
甲醇Fisher ScientificA456-4有毒，健康危害
3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯Sigma-AldrichM6514对湿气和热敏感
氢氟酸Acros Organics423805000剧毒
丙烯酰胺Acros Organics164855000有毒，健康危害
过硫酸铵Sigma-AldrichA3678健康危害，氧化剂
溶菌酶Sigma-AldrichL6876
细胞色素 CSigma-AldrichC7752
肌红蛋白Sigma-AldrichM1882
ß-酪蛋白Sigma-AldrichC6905
碳酸酐酶Sigma-AldrichC3934
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA2153
尿素Alfa Aesar36428-36
二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol）Sigma-AldrichD0632健康危害
碘乙酰胺Fisher ScientificAC122270250健康危害
甲酸Fisher ScientificA117-50腐蚀性，健康危害
C4 捕获柱Sepax Technologies110043-4001C3 µm 颗粒，300 Å 孔径，4.0 mm 内径，10 mm 长
乙腈Fisher ScientificA998SK-4有毒，氧化剂
碳酸氢铵Sigma-Aldrich1066-33-7
Nalgene 快流速滤器Thermo Scientific126-00200.2 µm CN 膜，50 mm 直径
大肠杆菌细胞K-12 MG1655
杜尔贝科磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichD8537
BCA 蛋白定量测定Thermo Scientific23250
丙酮Fisher ScientificA11-1
用于蛋白质脱盐的高效液相色谱系统Agilient1260 Infinity II
乙酸Fisher ScientificA38-212
毛细管电泳自动进样器CMP ScientificECE-001
电驱动鞘流接口CMP Scientific
Q Exactive HF 混合四极杆-轨道阱质谱仪Thermo Fisher Scientific
Sutter 火焰/布朗微电极拉制仪Sutter InstrumentsP-1000
用于细胞裂解的超声波细胞破碎仪Branson101063196型号 S-250A
真空浓缩仪Thermo Fisher ScientificSPD131DDA-115

参考文献

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