大规模自上而下蛋白质组学采用毛细管区带电泳串联质谱法

摘要

本文详细描述了一种利用毛细管区带电泳-电喷雾电离-串联质谱法（CZE-ESI-MS/MS）对蛋白质样品中的蛋白质变体进行分离、鉴定和表征的实验方案。该方案可用于简单蛋白质样品中蛋白质变体的高分辨率表征，以及复杂蛋白质组样品中蛋白质变体的大规模鉴定。

摘要

毛细管区带电泳-电喷雾电离-串联质谱法（CZE-ESI-MS/MS）已被公认为是一种用于自上而下蛋白质组学研究的有效工具，旨在对复杂蛋白质组中的蛋白质变体进行表征。然而，由于毛细管区带电泳（CZE）的样品负载量低且分离时间窗口窄，其在大规模自上而下蛋白质组学中的应用受到限制。本文描述了一种采用微升级样品加载体积和90分钟分离时间窗口的CZE-MS/MS方法，适用于大规模自上而下蛋白质组学分析。该CZE-MS/MS平台基于一种涂覆线性聚丙烯酰胺（LPA）的分离毛细管，具有极低的电渗流；采用基于动态pH连接的在线样品富集方法，可高效实现蛋白质堆积；配备电驱动泵式鞘流CE-MS接口，灵敏度极高；并结合具有高质荷比分辨率和扫描速度的离子阱质谱仪。该平台可用于对简单的完整蛋白质样品进行高分辨率分析，以及对多种复杂蛋白质组中的蛋白质变体进行大规模表征。例如，利用该平台实现了标准蛋白质混合物的高效分离，并对多种杂质实现了高灵敏度检测。另一个示例表明，在单次CZE-MS/MS运行中，该平台可从大肠杆菌（Escherichia coli）蛋白质组中鉴定出超过500种蛋白质变体和190种蛋白质。

引言

自上而下的蛋白质组学（TDP）旨在对蛋白质组中的蛋白质变体进行大规模表征。由于蛋白质组具有高度复杂性和宽广的浓度动态范围，TDP依赖于在电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）分析之前对完整蛋白质进行高效的液相分离^1,2,3,4,5。毛细管区带电泳（CZE）是一种基于生物分子荷质比实现分离的强有力技术⁶。CZE方法相对简单，仅需一根开放式熔融石英毛细管、背景电解质（BGE）和电源即可完成。完整蛋白质样品可通过压力或电压加载至毛细管中，通过将毛细管两端浸入BGE并施加高电压来启动分离过程。CZE在生物分子分离中可达到极高的分离效率（>一百万理论塔板数）⁷。与广泛使用的反相液相色谱（RPLC）-MS相比，CZE-MS在完整蛋白质分析中具有显著更高的灵敏度⁸。尽管CZE-MS在大规模自上而下蛋白质组学中具有巨大潜力，但其在蛋白质组学中的广泛应用仍受到若干问题的限制，包括样品负载量低和分离时间窗口窄。CZE中的典型样品加载体积约为毛细管总体积的1%，通常对应于不足10....

方案

1. 分离毛细管内壁线性聚丙烯酰胺涂层的制备

1. 毛细管预处理
   1. 使用注射泵依次用500 µL的1 M氢氧化钠、去离子水、1 M盐酸、去离子水和液相色谱-质谱（LC-MS）级甲醇冲洗一根熔融石英毛细管（长度120 cm，内径50 µm，外径360 µm）。
   2. 用氮气（10 psi，≥12小时）干燥毛细管，并使用注射泵将50%（v/v）甲基丙烯酸-3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯的甲醇溶液填充至毛细管中。用硅橡胶密封毛细管两端，并在室温下孵育至少24小时。
      注意：此步骤中，毛细管内壁被修饰上C=C基团。更长的孵育时间可使反应更完全，从而获得更好的毛细管涂层。
   3. 用切割刀从毛细管两端各切去一小段（约5 mm）。使用注射泵以甲醇（500 µL）冲洗毛细管，以清除未反应的试剂。再用氮气（10 psi，≥12小时）干燥毛细管。
2. 线性聚丙烯酰胺（LPA）涂层的制备
   注意：本步骤基于Zhu et al.²²的方法并进行了少量修改。
   1. 配制丙烯酰胺溶液（40 mg丙烯酰胺溶于1 mL水中）和过硫酸铵（APS）溶液（5% [w/v] 水溶液）。
   2. 将2–3 µL APS溶液加入500 µL丙烯酰胺溶液中，涡旋混合，并用氮气....

结果

图1 展示了基于动态 pH 界面的毛细管区带电泳-电喷雾质谱联用系统（CZE-ESI-MS）在实验中所用的示意图。将一段较长的、溶于碱性缓冲液中的样品注入内壁涂覆有 LPA 的分离毛细管中，该毛细管预先充满酸性背景电解质（BGE）。施加高电压 I 和 II 后，样品区带中的分析物将被富集 通过 动态pH结方法。为评估CZE-MS系统的性能，通常分析一种标准蛋白质混合物（细胞色素c、溶菌酶、β-酪蛋白、肌红蛋白、CA和BSA）。标准蛋白质混合物的代表性电泳图如下所示 图2A标准蛋白混合物通常至少重复运行两次，以评估系统的分离效率和重现性。分离效率可通过某些蛋白质的理论塔板数来评估，如图所示 图2B可通过蛋白质强度和迁移时间的相对标准偏差来评估重现性。 图3

讨论

本文提供了一种详细的方案，利用毛细管区带电泳-串联质谱法（CZE-MS/MS）对简单蛋白质样品中的蛋白质变体进行高分辨率表征，并对复杂蛋白质组样品中的蛋白质变体进行大规模鉴定。图示为CZE-ESI-MS/MS系统的示意图 图1该方案中有四个关键步骤。首先，在分离毛细管内壁上制备高质量的LPA涂层至关重要。经LPA涂层处理的分离毛细管可降低毛细管内的电渗流，拓宽毛细管区带电泳的分离窗口，并减少蛋白质在其内壁上的吸附¹⁹. 制备LPA涂层的聚合反应进行如下 通过 将毛细管填充入丙烯酰胺（单体）与过硫酸铵（聚合引发剂）的混合物，随后将毛细管置于水浴中加热以引发反应²²水浴中的反应时间至关重要。反应时间过短会导致反应不完全，涂层质量差。我们通常将反应时间延长至50分钟，以确保反应充分进行，获得更佳的涂层效果。若反应时间过长，毛细管可能发生堵塞，此时可能需要使用高效液相色谱（HPLC）泵通过水冲洗将毛细管内的聚合物推出。根据文献报道及我们的经验，一根LPA涂层毛细管可连续使用.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
熔融石英毛细管	Polymicro Technologies	1068150017	50 µm 内径，360 µm 外径
氢氧化钠颗粒	Macron Fine Chemicals	7708-10	腐蚀性
LC-MS 级水	Fisher Scientific	W6-1
盐酸	Fisher Scientific	SA48-1	腐蚀性
甲醇	Fisher Scientific	A456-4	有毒，健康危害
3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯	Sigma-Aldrich	M6514	对湿气和热敏感
氢氟酸	Acros Organics	423805000	剧毒
丙烯酰胺	Acros Organics	164855000	有毒，健康危害
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	A3678	健康危害，氧化剂
溶菌酶	Sigma-Aldrich	L6876
细胞色素 C	Sigma-Aldrich	C7752
肌红蛋白	Sigma-Aldrich	M1882
ß-酪蛋白	Sigma-Aldrich	C6905
碳酸酐酶	Sigma-Aldrich	C3934
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A2153
尿素	Alfa Aesar	36428-36
二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol）	Sigma-Aldrich	D0632	健康危害
碘乙酰胺	Fisher Scientific	AC122270250	健康危害
甲酸	Fisher Scientific	A117-50	腐蚀性，健康危害
C4 捕获柱	Sepax Technologies	110043-4001C	3 µm 颗粒，300 Å 孔径，4.0 mm 内径，10 mm 长
乙腈	Fisher Scientific	A998SK-4	有毒，氧化剂
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	1066-33-7
Nalgene 快流速滤器	Thermo Scientific	126-0020	0.2 µm CN 膜，50 mm 直径
大肠杆菌细胞			K-12 MG1655
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	D8537
BCA 蛋白定量测定	Thermo Scientific	23250
丙酮	Fisher Scientific	A11-1
用于蛋白质脱盐的高效液相色谱系统	Agilient	1260 Infinity II
乙酸	Fisher Scientific	A38-212
毛细管电泳自动进样器	CMP Scientific	ECE-001
电驱动鞘流接口	CMP Scientific
Q Exactive HF 混合四极杆-轨道阱质谱仪	Thermo Fisher Scientific
Sutter 火焰/布朗微电极拉制仪	Sutter Instruments	P-1000
用于细胞裂解的超声波细胞破碎仪	Branson	101063196	型号 S-250A
真空浓缩仪	Thermo Fisher Scientific	SPD131DDA-115