本方案用于从肝脏中分离组织来源的细胞外囊泡（EVs）。该方案描述了一个两步法流程，包括先进行胶原酶灌注，再通过差速超速离心，以分离肝脏组织中的细胞外囊泡。
本文内容
摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）可由多种不同类型的细胞释放，并可在大多数（即使不是全部）体液中检测到。EVs可通过将活性分子（如RNA或蛋白质）从一个细胞转运至另一个细胞，参与细胞间的通讯。目前对EVs的研究大多基于细胞培养模型或从体液中分离的EVs。近年来，人们日益关注从组织中分离EVs，以研究其在生理过程中的作用及其在疾病状态下的改变。由于需要在不损伤细胞的前提下对组织进行解离，因此从组织中获得足够产量的EVs在技术上具有挑战性。本文所述方法介绍了一种从小鼠肝脏组织中分离EVs的操作流程。该方法包括两个步骤，首先为 原位 胶原酶消化结合差速超速离心。与机械切割或肝脏组织匀浆相比，使用胶原酶进行组织灌注可提高所获得细胞外囊泡（EVs）的得率。该两步法用于分离肝脏来源的细胞外囊泡，将有助于组织来源EVs的研究。
引言
细胞外囊泡（EVs）是一类由体内多种不同类型细胞释放的膜包被小泡。EVs携带包括RNA、DNA和蛋白质在内的多种分子 cargo。目前认为，EVs通过将这些分子 cargo 从一个细胞转移至另一个细胞，是组织内细胞间相互通讯的机制之一。1关于细胞外囊泡（EVs）在正常生理和疾病状态下的 cargo 及其作用的大部分信息，均来自对体外培养细胞获得的 EVs 或从循环系统及其他体液中收集的 EVs 的研究2为了理解它们的生理功能 体内因此，有必要采用一种稳健的方法来分离组织中的细胞外囊泡（EVs），以捕获所有EV亚群，并避免细胞损伤或污染3本方法的总体目标是从小鼠肝脏中分离组织来源的细胞外囊泡（EVs）。
肝脏中的大多数细胞类型已被证实能够产生细胞外囊泡（EVs），基于EVs的信号传导研究正在推动人们对肝脏疾病基础认知的深入。然而，不同细胞类型来源的EVs在组织内共同作用的影响目前仍仅被部分阐明。为了理解 原位 细胞外囊泡在组织微环境中的作用。本文所述方法基于两步灌流法，以增强组织解离并最大限度减少细胞损伤。随后从解离的肝组织中分离细胞外囊泡。自20世纪50年代初以来，两步灌流法已广泛应用于肝细胞的分离。4这些肝细胞分离方法经过修改和不断完善，现已成为从组织、细胞悬液及培养物中分离肝细胞的标准方法。5,6,7第一步，对肝脏进行非循环灌注，使用无钙缓冲液——Hank's 平衡盐溶液（HBSS）。第二步，用胶原酶灌注肝脏，以降解细胞外基质，从而进一步分离桥粒样细胞间连接。胶原酶消化的最佳处理时间为7至10分钟；处理时间过短会导致消化不完全，肝细胞间连接仍会保留，而处理时间过长则可能导致肝脏损伤或门静脉破裂。随后通过差速离心法分离细胞外囊泡（EVs），以去除细胞和细胞碎片。该方法可高效回收EVs，适用于后续的分析或研究。
方案
所有涉及动物的研究均按照经梅奥诊所机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。
1. 实验台准备
- 准备一个水浴锅，并将其温度设置为 37 °C。其他必要的设备和装置如图1所示。
- 称取 100 mg IV 型胶原酶，加入含有 100 mL HBSS 的 125 mL 锥形瓶中，并将锥形瓶置于 40 °C 水浴中。通过轻轻摇动锥形瓶确保胶原酶完全溶解，同时确保锥形瓶完全浸没在水浴中。为了提高效率，即使胶原酶看似已立即溶解，也应让其溶解至少 30 分钟。
- 将装有 50 mL HBSS 的 125 mL 锥形瓶置于 40 °C 水浴中。该溶液将用于初始灌注冲洗。
- 用 70% 乙醇喷洒剪刀、镊子等所有器械的表面。准备若干干净的棉签。
- 通过泵管路循环 70% 乙醇清洗泵的管路，然后用流动水冲洗两次以去除残留的乙醇。
- 在实验台面上铺上吸水性实验台垫，并在其上放置一个硬质盒子容器。该容器用于收集小鼠灌注过程中可能溢出的液体。将一块聚苯乙烯泡沫垫用铝箔包裹后放入容器内。
- 在实验台附近放置一个无菌的 10 cm 培养皿。灌注完成后，用于盛放消化后的肝脏组织。
- 提前将 10 mL 胶原酶消化液（步骤 1.2）倒入无菌培养皿中。
- 使用带翼静脉采血套件，将 23 号针头连接至泵管路的自由端（剪除蝶形针头的翼部可改善操作手感）。持续操作直至采血针头的尖端充满液体。
2. 动物准备
- 在使用异氟烷开始麻醉前，确保在手术过程中有足够的供气量。将氧气（O2）供应至诱导室，流速调至1-2 L，然后通过流量计将异氟烷浓度调至2-4%。
- 将小鼠放入诱导室并关闭顶部盖子。持续观察小鼠，直至其呈侧卧状态。
注意：诱导室内的气体可使小鼠维持麻醉状态数分钟。 - 将小鼠置于用铝箔包裹的聚苯乙烯泡沫垫上。将气流从诱导室切换至鼻罩。确保麻醉深度足够。若小鼠开始出现反应，应轻柔地将其固定于鼻罩中，直至完全麻醉。
- 在操作过程中通过监测呼吸频率及对刺激的反应来确认麻醉状态，并根据需要调节流量计以维持适当的麻醉深度。麻醉状态下，小鼠四肢对夹捏测试应无反应。更多细节可参考实验动物护理实验室指南。
- 用胶带或图钉固定小鼠的四肢。
- 用70%乙醇喷洒腹部皮肤，并用纱布和酒精棉片擦拭清洁。此步骤至关重要，可避免小鼠毛发带来的污染。
- 使用无菌剪刀从腹部前方至骨盆处沿中线剪开皮肤，注意避免损伤任何内部器官。用棉签轻轻将肠管移至动物左侧 ，以充分暴露门静脉（PV）和下腔静脉（IVC）。
3. 插管与灌注（0.5 小时）
- 使用弯头镊子将缝线置于门静脉下方，并松散地打结，以便在插管后收紧结扎。
- 将套管（采血套装中的23G针头）插入门静脉结扎线下方5-10 mm处。切勿将套管插入第一分支以下，否则可能导致右前叶灌注不充分。可使用止动结以缝线固定或加固套管。
- 启动泵，以低流速（1-2 mL/min）灌注HBSS。一旦确认插管成功，肝脏将开始变白。
- 剪开下腔静脉（IVC）以释放压力，使肝脏内多余液体得以排出。此操作最好用操作者另一只手完成，以避免移动套管。
- 缓慢将流速增加至8 mL/min，并在接下来的5分钟内以总共50 mL的HBSS完成肝脏灌注。
- 在HBSS即将用尽前，立即更换为含胶原酶的培养基（步骤1.2）。更换培养基时应确保无气泡产生，且避免气泡进入肝脏。
- 每隔5秒用镊子夹闭下腔静脉（IVC）施加瞬时压力。这将引起肝脏膨胀，有助于组织消化和细胞解离（持续7-8分钟）。随着消化进行，肝脏会逐渐肿胀并变为白色，通常可均匀膨胀至原始体积的约两倍。
- 消化完成后关闭泵并移除套管。肝脏消化的完成程度取决于小鼠体型及肝脏状态。若用棉签轻轻探触肝脏表面，可观察到凹陷，提示消化已完成。
- 小心移除肝脏上的胆囊，避免撕裂。使用经清洗的剪刀和镊子将肝脏取出，转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌10 cm培养皿中进行表面清洗。随后小心将肝脏转移至另一无菌10 cm培养皿中，该皿内含有步骤1.8制备的胶原酶消化液。此步骤对避免小鼠血液和胆汁污染至关重要。
- 用两把洁净的镊子夹住肝脏并将其撕开，同时轻轻振荡以释放肝细胞。此过程中，消化液将逐渐变浑浊。所有肝细胞均可被振荡脱离，仅留下结缔组织和血管组织。
- 使用3 mL注射器反复吹打细胞悬液，直至未消化的肝脏组织完全脱落。将悬液倒入装有70 µm尼龙细胞筛网的50 mL锥形管中，以滤除未消化的结缔组织。用HBSS冲洗培养皿，收集残留细胞，并补满50 mL锥形管。
- 将50 mL锥形管置于水平转子离心机中，于4 °C下以50 × g轻轻离心10 min。
- 将上清液转移至新的50 mL锥形管中。
4. 细胞外囊泡（EVs）的分离（5 小时）
- 在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心 10 分钟，收集上清液，并转移至新的 50 mL 圆锥形离心管中。
- 在 4 °C 条件下，以 2000 x g 离心 20 分钟，以去除细胞碎片和聚集体。
- 将上清液转移至圆底离心管中，在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 70 分钟。
- 收集上清液，转移至聚碳酸酯超速离心管中，在 4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 70 分钟。
- 收集超速离心管中的沉淀物，用 PBS 重悬洗涤。再次在 4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 70 分钟。
- 最终获得的沉淀物含有细胞纳米囊泡，可直接用于实验，或用 1000 µL PBS 重悬后于 -80 °C 保存。
5. 分离产物的质量与得率评估
- 根据仪器制造商的操作规程，采用纳米颗粒跟踪分析或可调电阻脉冲传感技术评估粒径分布和浓度。
- 根据特定实验需求，通过多种方法（如添加蔗糖梯度或垫层、免疫亲和技术或尺寸排阻色谱）对特定囊泡群体进行进一步分离和纯化。
结果
进行这些分离所需的装置由常规实验室设备组成，因此该方法相对简单且成本较低。分离操作已在12至30周龄的雄性和雌性Balb/c或FVB小鼠中完成。用于放置小鼠的托盘内衬铝箔，并置于硬质容器中，以收集灌注过程中多余的液体。装有HBSS或含胶原酶培养基的烧瓶浸没于水浴（40 °C）中，随时备用。使用两个无菌的10 cm培养皿：一个用于PBS表面清洗，另一个用于肝细胞与结缔组织成分的分离。
该方法中，肝脏采用非连续方式灌注 通过 优先选择门静脉插管，而非从下腔静脉插管。另一种常用且可替代的灌注方法是通过下腔静脉插管并切断门静脉进行引流，实现逆行灌注。然而，门静脉位置易于接近，且距离肝脏较短，因为门静脉直接通入肝脏8插入点的选择对于插管的成功至关重要（图2将套管插入至胃和胰腺静脉分支之后，但不超过门静脉的第一个分支（左右肝门静脉）。确定门静脉内的最佳插入位置后，使用弯钳在门静脉下方穿过一根缝线并打一个松结。用止血结将套管针头与缝线固定，以防止针头脱落。
图3 概述了用于肝组织EVs分离的差速离心整体处理流程。超速离心可去除细胞、碎片及其他杂质。前四步离心（50 × g、300 × g、2,000 × g、10,000 × g）分别旨在去除肝细胞、完整的其他细胞、死亡细胞或细胞碎片（图4A 和 4B）。经过这些步骤后，再次在100,000 × g条件下进行超速离心以收集沉淀（图4C）。通过将沉淀重悬于PBS中进行洗涤，并再次在100,000 × g条件下进行最终的超速离心。在此过程中，与来自条件培养基的EVs相比，超速离心后的沉淀物明显可见且呈黏稠状。需反复吹打多次，直至任何棕色聚集体完全消失并彻底溶解。最终的沉淀物用1000 µL PBS重悬（图4D）。超速离心可去除血浆中的杂质及其他可溶性污染物，这些物质可能影响功能实验的结果。离心过程应在4 °C下进行。
通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测定，从小鼠肝脏中分离得到的组织EV浓度范围为1.74至4.00 × 1012，平均为每毫升3.46 × 1012个颗粒（图5）。分离所得肝脏组织EV的平均粒径为157.7 nm，众数粒径为144.5 nm，EV粒径分布范围为100–600 nm（NTA测定结果）。EV的得率取决于肝脏重量以及灌注液或超速离心步骤中的损失等因素。
图 1：实验台准备。 材料及其位置包括：(A) 注射泵，(B) 已预热的 125 mL 锥形瓶，内含 HBSS 和连接水泵的吸气口，(C) 连接异氟烷挥发器的鼻罩，(D) 水泵的排气口与针头相连，(E) 置于硬质容器内的铝箔衬里托盘，以及 (F) 事先加入胶原酶培养基的 10 cm 培养皿。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：插管部位。显示小鼠腹部的解剖结构。使用弯头镊子将一根缝线置于门静脉（PV）下方，并打一个松结。插入位置靠近肝脏，位于结扎线以下 5–10 mm 处，但不应超过第一门静脉分支（左、右肝门静脉）。使用缝线和止动结将插管固定。如果插管脱落，此结可作为门静脉位置的标记。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：离心步骤示意图。 目的是去除不需要的细胞及其他成分，从而分离出细胞外囊泡（EVs）。前四步离心采用差速离心法，旨在去除肝细胞及其他细胞、死亡细胞或细胞碎片。完成这些步骤后，以100,000 × g进行超速离心，收集EV沉淀。通过将沉淀重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中进行洗涤，并再次在100,000 × g条件下进行最终的超速离心。所有离心步骤均在4 °C下进行。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：差速离心。（A）在 50 × g 条件下离心 10 分钟后，可见含有肝细胞的沉淀。（B）使用圆底管在 10,000 × g 条件下离心 70 分钟以去除细胞碎片。（C）使用聚碳酸酯超速离心管在 100,000 × g 条件下离心 70 分钟。将沉淀收集至一支试管中，并通过加入 PBS 重悬进行洗涤。（D）最终沉淀用 1000 µL PBS 重悬。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：代表性结果。肝脏组织EV的粒径和浓度可通过纳米颗粒追踪分析（NTA）进行测定。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本方案描述了一种利用两步灌注法分离肝组织细胞外囊泡（EV）的最佳且可重复的方法 通过 门静脉插管后进行差速超速离心。该操作的关键步骤包括导管放置、胶原酶浓度与消化时间、培养基流速、组织消化后的处理，以及经典的差速超速离心。
使用IV型胶原酶消化后，通过与结缔组织成分分离实现细胞分离。用于灌注的胶原酶浓度范围可为0.1至5 mg/mL。不同批次胶原酶在组织消化效果上可能存在显著差异。已测试0.5至5 mg/mL的胶原酶浓度，但所用浓度对获得的细胞外囊泡（EVs）产量无显著影响。使用较高浓度的胶原酶将导致肝脏更快地肿胀和变白。目标是在不造成过度污染或损伤的情况下获得满意的细胞解离效果。在这些分离过程中，推荐使用的胶原酶最佳浓度为1–2 mg/mL，以8 mL/min的流速灌注7–8分钟。灌注时间过长会增加破坏肝脏内细薄结缔组织的风险，同时也增加技术风险，例如门静脉针头脱落或静脉内气体滞留。
本方案中最具挑战性的步骤是门静脉插管。该操作可能较为困难，尤其是在体重为18至25克的小鼠中。胶原酶灌注技术最初是为大鼠设计的，后经多次修改和调整才应用于小鼠。使用23G采血套装进行插管，比在管腔较细的血管中置入导管更为容易。建议使用带止动结的缝线固定插管，以防止其脱落；此外，若插管脱离血管，该结还可作为门静脉位置的标记。
对于后续分析而言，尽可能减少细胞污染至关重要。组织消化后的处理过程中有若干关键注意事项。首先，在取出肝脏时应更换镊子和剪刀，以避免血液污染。其次，必须小心地将胆囊从肝脏上完整移除，以防撕裂及胆汁的意外污染。第三，一旦将肝脏从小鼠体内取出，需使用 PBS 非常轻柔地清洗肝脏，以去除任何残留血液。在此过程中，应优先考虑最大限度减少细胞污染，而非提高所获得的 EV 产量。
超速离心法是分离和纯化细胞外囊泡（EVs）最常用的方法8,9,10,11。该方法可去除大多数实质细胞（如肝细胞或胆管上皮细胞）以及非实质细胞（如库普弗细胞、窦状内皮细胞和星状细胞）。此外，通过差速离心还可去除细胞碎片、细胞聚集体和死亡细胞。为进一步纯化和分离特定亚群，可采用尺寸排阻色谱法，以去除非囊泡性蛋白聚集体或脂蛋白。
该方案的一个局限性在于，由于部分囊泡可能随灌注液被清除，因此可能无法捕获全部组织来源的囊泡。若需进行整体评估，应考虑收集灌注液并从中分离囊泡。另一个局限性是可能存在细胞损伤。为监测过度细胞死亡带来的潜在影响，可对细胞活力进行检测，并将其纳入组织EV分离的质量控制参数中。总之，本方案描述了一种采用两步灌注技术的优化工作流程 通过 门静脉灌注后经差速超速离心法，可从鼠肝组织中高效获取肝脏组织来源的细胞外囊泡（EVs）。这些组织来源的EVs适用于后续分析，如生物分子组成表征，以及旨在阐明其生理或病理生理功能，或评估其作为疾病标志物潜在应用价值的相关研究。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究获得了美国国家癌症研究所资助项目 CA-217833 的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 125 mL 锥形瓶 | Fisher scientific | FB500125 | |
| 125 mL 锥形瓶 | Fisher scientific | FB500125 | |
| 弯头无齿剪刀 | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| 弯头镊子 | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 美纹纸胶带 | 家用用品商店 | ||
| 铝箔 | 家用用品商店 | ||
| 泡沫塑料垫板 | 家用用品商店 | ||
| 吸水实验台垫 | Scientific inc. | B1623 | |
| Masterflex L/S 数字迷你泵 | Cole-parmer | ZX-07525-20 | |
| 水浴锅 | Thermo Electron Precision | 2837 | |
| 采血套装 | Becton Dickinson | 367292 | |
| 平皿，透明盖，100×15 | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Falcon 70 mm 尼龙细胞筛 | Fisher scientific | 352350 | |
| 50 mL 圆底离心管 | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 棉签 | Moore medical | 69622 | |
| 25 mL 血清移液管 | Falcon | 357525 | |
| Ohmeda Isotec 4 异氟烷蒸发器 | BioSurplus | 203-2751 | |
| O2 气体 | |||
| 异氟烷 | |||
| Levo Plus 电动移液器助吸器 | Scilogex | 74020002 | |
| Centrifuge 5804R 离心机 | Sigma-aldrich | 22628048 | |
| Beckman Coulter Optima L-100 XP 超速离心机 | Beckman | 969347 | |
| Beckman Coulter Avanti JXN-26 高速离心机 | Beckman | B34182 | |
| 70 Ti 固定角转子 | Beckman | 337922 | |
| JA-25.50 固定角转子 | Beckman | 363055 | |
| Nalgene 圆底管 | Thermo Scientific | 3118-0028 | |
| 带盖组件的聚碳酸酯超速离心管 | Beckman | 355618 | |
| 试剂 | |||
| HyClone 无钙镁 Hank's 平衡盐溶液（HBSS） | Fisher scientific | SH30588.01 | |
| IV 型胶原酶，粉末 | Fisher scientific | 17104019 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Fisher scientific | SH30256.01 |
参考文献
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重印与许可
