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方法文章

小鼠脑内蓝斑核的定位

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DOI：

10.3791/58652

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2019年3月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Johns Hopkins University, 3Department of Molecular and Medical Genetics, OHSU, 4X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

本文内容

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摘要

蓝斑是一个参与多种生理过程的小型神经元群。本文介绍了一种制备小鼠脑切片的方案，用于研究该核团中的蛋白质和金属元素。

摘要

蓝斑（locus coeruleus, LC）是产生去甲肾上腺素神经元的主要中枢，可调节多种生理功能。LC的结构或功能异常会影响包括大脑皮层、海马和小脑在内的多个脑区，可能与抑郁症、双相情感障碍、焦虑症以及帕金森病和阿尔茨海默病相关。这些疾病常伴随金属元素失衡，但金属在LC中的作用尚不完全清楚。为了更深入理解人类病理机制及金属元素的参与，有必要对LC进行形态学和功能研究。小鼠是广泛使用的实验模型，但小鼠的LC体积较小（直径约0.3 mm），非专业人员难以识别。本文介绍了一种基于免疫组织化学的逐步操作方案，用于定位小鼠脑中的LC。利用多巴胺-β-羟化酶（dopamine-β-hydroxylase, DBH）以及可选的酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）作为脑切片中LC高表达的酶类，作为免疫组织化学标记物。含有LC的切片相邻的切片可用于进一步分析，包括用于形态学研究的组织学检测、代谢测试，以及通过X射线荧光显微技术（XFM）进行的金属成像。

引言

蓝斑（locus coeruleus, LC）是脑干中的一个重要区域，也是去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）生成的主要部位1。LC 向大脑多个区域发出投射2，包括大脑皮层、海马和小脑3，并调控多种重要的生理过程，如昼夜节律4,5、注意力与记忆6、应激反应7、认知功能8以及情绪9,10。LC 功能障碍已被认为与多种神经及神经精神疾病相关11，包括帕金森病12,13,14、阿尔茨海默病14、抑郁症15,16,17、双相情感障碍18,19以及焦虑症20,21,22,23,24。鉴于其重要作用，对 LC 的分析对于研究其正常功能及功能障碍至关重要。

小鼠被广泛用于生理学和病理生理学过程的研究。由于其体型较小，小鼠蓝斑（LC）的平均直径约为300 μm，导致该结构难以定位。在脑切片过程中，无论是冠状面还是矢状面切片，都很容易遗漏蓝斑。目前已有研究描述了动物蓝斑的识别方法，但并未提供非专家可遵循的逐步操作方案1,25。因此，为了指导蓝斑的定位，我们介绍了一种自行开发的在小鼠脑中定位该区域的实验方案，适用于多种研究目的（图1、图2、图3）。该方案结合了精确控制的脑切片技术以及对多巴胺β-羟化酶（DBH）26,27的免疫组织化学检测，也可选择酪氨酸羟化酶（TH）24进行检测，这两种酶在蓝斑中均高度富集28。通过免疫组织化学确定蓝斑位置后，相邻的脑切片可用于进一步研究，包括形态学和代谢分析，以及通过X射线荧光显微成像（XFM）进行的金属成像研究29。本文以XFM为例描述了该技术的应用（图3）。

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方案

动物实验已获得约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会（ACUC）批准，协议编号为 M017M385。

1. 脑切片

  1. 使用3%异氟烷麻醉小鼠以进行固定。
    1. 将几滴异氟烷滴加到棉球上，然后放入15 mL微量离心管中。将动物的鼻子放入管内，使其吸入异氟烷。通过脚趾夹捏无反应来判断麻醉深度。
  2. 将动物仰卧放置，用T型针固定其四肢以 immobilize，同时暴露其腹部。
  3. 用手术剪从腹部皮肤开始剪开，并沿胸部区域剪开皮肤。使用T型针将皮肤固定。随后撕裂腹膜至胸部区域。通过打开胸腔并剪断膈肌来暴露心脏。
  4. 剪开右心房，使血液流出动物体外。用一支装有25号针头的10 mL注射器插入左心室，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）进行灌注。
    注意：这使得溶液能够流经体循环，并通过右心房流出。
  5. 移除10 mL注射器，将连接60 mL注射器的25号针头插入左心室。用50 mL冰冻的4%多聚甲醛（PFA）灌注。
    1. 通过将10% PFA溶液用H₂O稀释，制备冰上预冷的4% PFA溶液2O 并将最终的 4% PFA 溶液在 4 °C 下冷却。
  6. 分离小鼠头部并从颅骨中取出脑组织。
    1. 从颈部切开皮肤，然后向眼睛方向切开以暴露颅骨。沿颈部至鼻部方向敲裂颅骨，再从一侧眼球至另一侧眼球方向裂开颅骨。剥离颅骨并取出完整脑组织。
  7. 在4 °C下用4%多聚甲醛（PFA）孵育脑组织24小时。
  8. 用镊子将脑组织转移至装有25 mL 30%蔗糖溶液的50 mL锥形管中，4 °C保存48–72小时，直至脑组织沉入管底。
  9. 使用成年小鼠脑切片矩阵冠状切割脑组织，切面通过中脑（约在前囟后方3 mm处）。保留包含脑干的脑组织切片。
    注意：这将产生两个脑组织切片——一个包含大部分皮层（切面的前部），另一个包含脑干/小脑（切面的后部）。后续步骤请使用脑干部分。
  10. 将脑干切片切面朝下置于包埋模具底部，周围用最佳切割温度化合物（OCT）包埋；将包埋好的脑组织放入-80 °C冰箱中冷冻至少12小时，直至后续使用。
  11. 在冷冻切片机中进行切片：将含有脑组织的OCT包埋模具放入冷冻切片机中；在冷冻切片机中孵育数小时，使脑组织块的温度与冷冻切片机的温度达到平衡。
  12. 剥离包埋模具，露出含有脑组织的OCT包埋块。
  13. 使用剃须刀片去除包埋块表面多余的OCT，注意不要触碰到脑组织。
  14. 将OCT包埋块安装在冷冻切片机的夹头上，使脑组织的切面朝前暴露。
  15. 调整脑组织的切面，使其与冷冻切片机的刀片平行。
  16. 从延髓开始向头端方向修剪脑组织，切取100 µm厚的切片。
  17. 向头端修剪，直至小脑和脑干被切成一个连续的切片。开始收集厚度为50 µm的切片。
    注意：当从延髓向头端修剪时，脑干和小脑将被切成两个独立的部分。在更靠头端的切面上，脑干与小脑最终将在第四脑室水平处融合。th 心室。一旦第四脑室的外侧边缘th 脑室形态良好时，小脑和脑干将呈现为一个连续的切片。
    1. 用镊子夹取OCT包埋的脑切片，置于盛有PBS的24孔板孔中图2a）。当小脑与下丘在前囟后约 -5.52 mm 处相互交汇时，外侧丘系将最为显著。图1b).
      注意：一旦小脑被完全切开，且在前囟后约 -5.34 mm 处不再包绕下丘时，蓝斑最前部将消失图1c).

2. 多巴胺β-羟化酶或酪氨酸羟化酶的免疫组织化学（图2）

  1. 第1天
    1. 用 PBS 清洗所选切片，每次 5 分钟，共清洗三次。
    2. 在 4 °C 条件下，使用含 0.5% 去垢剂的磷酸盐缓冲液（PBSD）透化处理 24 小时。
      1. 将125 µL去垢剂加入25 mL PBS中稀释。
  2. 第2天
    1. 用0.5% PBSD洗涤切片，每次5分钟，共洗涤三次。
    2. 加入一抗（抗-DBH 或抗-TH），在 4 °C 条件下以 1:500 的比例溶于 0.5% PBSD 中孵育 18 小时。
  3. 第3天
    1. 用0.5% PBSD洗涤切片，每次10分钟，共洗涤三次。
    2. 在0.5% PBSD中按1:1000稀释比例加入所需的二抗（488驴抗兔用于绿色荧光），孵育16小时。
    3. 用铝箔包裹24孔板，置于4 °C保存。
    4. 用0.5% PBSD洗涤切片，每次5分钟，共洗涤三次。
    5. 用 PBS 洗涤 5 分钟。
    6. 用毛笔将切片转移至盛水的容器中。
    7. 将漂浮在水中的切片置于带电荷的载玻片上。
    8. 用硬封片剂（不含DAPI）封固盖玻片。
    9. 将贴附的脑切片在室温下干燥30分钟。
    10. 使用共聚焦或荧光显微镜，设置适当的二抗荧光染料波长以检测信号，对脑切片进行成像。
    11. 调整显微镜至脑切片的焦平面，并在10倍放大倍数下采集单张图像。
    12. 为定位脑切片中可能的 LC 区域，使用 4th 心室用于定位；小脑位于心室上方，脑桥和脑干位于下方30.
    13. 要定位蓝斑（LC），需聚焦于第四脑室的外侧边缘th 心室；LC起源于第4脑室的边缘th 脑室并指向脑桥/脑干区域（图2b，图2c).
    14. 在对特定脑切片中的蓝斑进行成像和定位后，将含有脑切片的载玻片置于4 °C保存。

3. 脑切片中蓝斑的检测

  1. 为定位包含蓝斑（LC）的脑切片，按照上述方法切取小鼠脑组织，并将切片收集至盛有PBS的24孔板中，如图所示。 图2a.
    1. 每孔放置一个脑切片，以确保蓝斑的准确定位。
  2. 每只小鼠脑组织共收集48个脑切片用于免疫染色。
    注意：图中所示两个培养皿的所有孔 图2a 包含来自一只动物的脑切片。
  3. 每隔第三至第五个切片进行DBH或TH免疫染色。优先对那些与后续用于X射线荧光显微镜（XFM）检测的脑切片相邻的切片进行免疫组织化学染色。
    注意：该步骤可确保在最终的切片检测中精确定位蓝斑核（LC）图2a；在孔之间用数字标记。
  4. 根据具体应用调整进行免疫染色的脑切片数量， 例如，无论其是否需要精确确定蓝斑的中心和边缘位置，还是仅需粗略估计。
  5. 免疫组织化学染色后，通过观察脑片两侧蓝斑区域特有的表达模式来识别含有蓝斑的脑片th 心室（图2b，2c）。连续脑切片中蓝斑区DBH信号的放大图像如图所示 图2d，图2e；显示了经TH染色的LC区域的放大图像 图 2f。
  6. 使用邻近含有 LC 的区域进行后续研究——在本例中用于 XFM 以定量金属含量（图3).
  7. 进行X射线荧光显微成像（XFM）时，将10–30 µm厚（根据实验装置而定）的冠状脑切片收集到薄聚合物膜上，以便将其固定在样品支架上，并在同步辐射装置中进行成像。
  8. 将制备在薄聚合物膜上的脑切片于室温保存，并进行X射线荧光显微成像（XFM）。

4. 通过XFM在蓝斑中进行金属成像

  1. 按照上述方法切取小鼠脑组织样本，确定蓝斑（LC）位置，并通过X射线荧光显微成像（XFM）检测包含蓝斑的脑切片中的金属元素水平。
  2. 在美国阿贡国家实验室（Argonne IL）先进光子源（Advanced Photon Source）2-ID-E线站上进行元素分布成像。
  3. 按照先前所述方法进行“飞行模式”数据采集31。
  4. 使用MAPS程序32,33分析包含蓝斑的脑切片中各元素的浓度。

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结果

在神经系统疾病中，常可观察到金属稳态（如 Cu、Fe、Zn 和 Mn）的变化，包括蓝斑核（LC）中的变化34,35。因此，测定脑组织中的金属含量对于理解疾病机制至关重要。利用本方案制备的脑切片可用于定量分析蓝斑核（LC）中 Cu 及其他金属的水平，并将其与 LC 以外脑区的金属水平进行比较（图3）。在本示例中，对穿过蓝斑核的脑切片检测了磷酸盐、钾、氯和铜的含量。其中仅铜在蓝斑核中显著升高。还可进行更高分辨率的X射线荧光显微成像（本图未显示），以检测金属在亚细胞结构中的分布情况。本方案的其他潜在应用包括检测多巴胺β-羟化酶（DBH）（图2b、2d、2e）、酪氨酸羟化酶（TH）（图2c、2f）以及其他在蓝斑核中单独表...

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讨论

正确固定样本方向是本方案中的关键步骤。由于我们利用脑背侧表面的解剖特征（小脑与下丘之间的边界）来定位蓝斑核（LC），因此切片必须正确对齐。这要求在将脑组织放入小鼠脑切片矩阵时格外小心。我们建议在蓝斑核的前部和后部各多切约500 μm的组织，以避免遗漏该核团。最常见的错误是切片数量不足，导致完全错过蓝斑核。因此，初次操作本方案时，我们建议多切一些切片。在染色前仔细研究脑图谱图像非常有帮助。脑干的形态每隔几百微米就会发生明显变化，积累一定经验后，仅凭肉眼观察切片的宏观形态即可判断哪些切片值得进行染色。

在定位蓝斑（LC）的过程中，信号强度可能因脑组织切片时的方向差异而有所不同。当切片穿过蓝斑中心时，信号较强且覆盖面积较大；而当切片经过蓝斑边缘时，信号仅出现在较小的区域。若冠状切片存在轻微倾斜，则一侧蓝斑的th 脑室可能在一个切片中明显可见，而在另一侧的脑室可能仅在相邻切片中才能观察到。因此，不能总是期望在单个脑切片中双侧蓝斑区域均呈现最强信号。通过使用小鼠脑切片定位模具将脑组织精确地按冠状面切割，并小心地将脑组织包埋于OCT包埋剂中的立方体模具内，可避免此类伪影。...

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致谢

感谢Abigael Muchenditsi对小鼠品系的维护工作。本研究使用阿贡国家实验室先进光子源设施得到了美国能源部科学办公室基础能源科学办公室的支持，合同编号：DE-AC02-06CH11357。感谢Olga Antipova和Stefan Vogt博士在先进光子源提供的用户支持与协助。本工作由美国国立卫生研究院资助项目2R01GM101502（授予SL）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
成年小鼠脑切片矩阵Zivic InstrumentsBSMAS001-1
驴源抗兔二抗，Alexa Fluor 488标记Thermo Fisher ScientificA-21206
带电荷载玻片Genesee29-107
共聚焦显微镜ZeissLSM 800
冷冻切片机Microm GmbHHM 505E
冷冻切片机切割刀片Thermo Fisher ScientificMX35
微型剪刀，9.5 cmAntech Diagnostcs503241
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）Sigma-AldrichD9542-10MG
多巴胺β-羟化酶（DBH）抗体 —— 实验室自制（兔源）B. Eipper-
多巴胺β-羟化酶（DBH）抗体 —— 商业化产品（兔源）Cell Signaling8586
Falcon管，50 mlUSA Scientific339652
异氟烷（Forane）BaxterNDC 1019-360-60
显微有齿镊（Micro Adson 镊）Antech Diagnostcs501245
硬封固封片介质EM sciences17984-24
显微镜PascalLSM 5
多孔板，24孔Thermo Fisher Scientific930186
最佳切割温度包埋剂（OCT）VWR/ tissue tech102094-106
10% 多聚甲醛（PFA）/ 甲醛溶液Fisher ScientificSF98-4
一次性可剥离包埋模具（Peel-A-Way）Polysciences Inc.18646A
画笔
磷酸盐缓冲液（PBS）Life Tech14190250
剃须刀片AmazonASIN: B000CMFJZ2
刮铲Antech Diagnostcs14374
T型针Office Depot344615
《立体定位坐标中的小鼠脑》，Paxinos 与 Franklin，第3版AmazonISBN: 978-0123694607
Triton-X 100（用于配制PBSD）Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP7949-500ml
酪氨酸羟化酶（TH）抗体（兔源）EMD MilliporeAB152
X射线荧光分析用Ultralene超薄膜SPEX Sample Prep3525
宽场荧光显微镜ZeissAxio Zoom.V16

参考文献

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 4/08/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Evan Maxey was updated from:

Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

to:

X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

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免疫组织化学多巴胺β-羟化酶酪氨酸羟化酶脑切片共聚焦显微镜X射线荧光金属成像脑图谱
小鼠脑内蓝斑核的定位
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