蓝斑是一个参与多种生理过程的小型神经元群。本文介绍了一种制备小鼠脑切片的方案，用于研究该核团中的蛋白质和金属元素。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
勘误通知
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
摘要
摘要
蓝斑（locus coeruleus, LC）是产生去甲肾上腺素神经元的主要中枢，可调节多种生理功能。LC的结构或功能异常会影响包括大脑皮层、海马和小脑在内的多个脑区，可能与抑郁症、双相情感障碍、焦虑症以及帕金森病和阿尔茨海默病相关。这些疾病常伴随金属元素失衡，但金属在LC中的作用尚不完全清楚。为了更深入理解人类病理机制及金属元素的参与，有必要对LC进行形态学和功能研究。小鼠是广泛使用的实验模型，但小鼠的LC体积较小（直径约0.3 mm），非专业人员难以识别。本文介绍了一种基于免疫组织化学的逐步操作方案，用于定位小鼠脑中的LC。利用多巴胺-β-羟化酶（dopamine-β-hydroxylase, DBH）以及可选的酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）作为脑切片中LC高表达的酶类，作为免疫组织化学标记物。含有LC的切片相邻的切片可用于进一步分析，包括用于形态学研究的组织学检测、代谢测试，以及通过X射线荧光显微技术（XFM）进行的金属成像。
引言
蓝斑（locus coeruleus, LC）是脑干中的一个重要区域，也是去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）生成的主要部位1。LC 向大脑多个区域发出投射2，包括大脑皮层、海马和小脑3，并调控多种重要的生理过程，如昼夜节律4,5、注意力与记忆6、应激反应7、认知功能8以及情绪9,10。LC 功能障碍已被认为与多种神经及神经精神疾病相关11，包括帕金森病12,13,14、阿尔茨海默病14、抑郁症15,16<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
动物实验已获得约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会（ACUC）批准，协议编号为 M017M385。
1. 脑切片
- 使用3%异氟烷麻醉小鼠以进行固定。
- 将几滴异氟烷滴加到棉球上，然后放入15 mL微量离心管中。将动物的鼻子放入管内，使其吸入异氟烷。通过脚趾夹捏无反应来判断麻醉深度。
- 将动物仰卧放置，用T型针固定其四肢以 immobilize，同时暴露其腹部。
- 用手术剪从腹部皮肤开始剪开，并沿胸部区域剪开皮肤。使用T型针将皮肤固定。随后撕裂腹膜至胸部区域。通过打开胸腔并剪断膈肌来暴露心脏。
- 剪开右心房，使血液流出动物体外。用一支装有25号针头的10 mL注射器插入左心室，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）进行灌注。
注意：这使得溶液能够流经体循环，并通过右心房流出。 - 移除10 mL注射器，将连接60 mL注射器的25号针头插入左心室。用50 mL冰冻的4%多聚甲醛（PFA）灌注。
- 通过将10% PFA溶液用H₂O稀释，制备冰上预冷的4% PFA溶液2O 并将最终的 4% PFA 溶液在 4 °C 下冷却。
- 分离小鼠头部并从颅骨中取出脑组织。
- 从颈部切开皮肤，然后向眼睛方向切开以暴露颅骨。沿颈部....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在神经系统疾病中，常可观察到金属稳态（如 Cu、Fe、Zn 和 Mn）的变化，包括蓝斑核（LC）中的变化34,35。因此，测定脑组织中的金属含量对于理解疾病机制至关重要。利用本方案制备的脑切片可用于定量分析蓝斑核（LC）中 Cu 及其他金属的水平，并将其与 LC 以外脑区的金属水平进行比较（图3）。在本示例中，对穿过蓝斑核的脑切片检测了磷酸盐、钾、氯和铜的含量。其中仅铜在蓝斑核中显著升高。还可进行更高分辨率的X射线荧光显微成像（本图未显示），以检测金属在亚细胞结构中的分布情况。本方案的其他潜在应用包括检测多巴胺β-羟化酶（DBH）（图2b、2d、2e）、酪氨酸羟化酶（TH）（图2c、2f）以及其他在蓝斑核中单独表.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
正确固定样本方向是本方案中的关键步骤。由于我们利用脑背侧表面的解剖特征（小脑与下丘之间的边界）来定位蓝斑核（LC），因此切片必须正确对齐。这要求在将脑组织放入小鼠脑切片矩阵时格外小心。我们建议在蓝斑核的前部和后部各多切约500 μm的组织，以避免遗漏该核团。最常见的错误是切片数量不足，导致完全错过蓝斑核。因此，初次操作本方案时，我们建议多切一些切片。在染色前仔细研究脑图谱图像非常有帮助。脑干的形态每隔几百微米就会发生明显变化，积累一定经验后，仅凭肉眼观察切片的宏观形态即可判断哪些切片值得进行染色。
在定位蓝斑（LC）的过程中，信号强度可能因脑组织切片时的方向差异而有所不同。当切片穿过蓝斑中心时，信号较强且覆盖面积较大；而当切片经过蓝斑边缘时，信号仅出现在较小的区域。若冠状切片存在轻微倾斜，则一侧蓝斑的th 脑室可能在一个切片中明显可见，而在另一侧的脑室可能仅在相邻切片中才能观察到。因此，不能总是期望在单个脑切片中双侧蓝斑区域均呈现最强信号。通过使用小鼠脑切片定位模具将脑组织精确地按冠状面切割，并小心地将脑组织包埋于OCT包埋剂中的立方体模具内，可避免此类伪影。.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
感谢Abigael Muchenditsi对小鼠品系的维护工作。本研究使用阿贡国家实验室先进光子源设施得到了美国能源部科学办公室基础能源科学办公室的支持，合同编号：DE-AC02-06CH11357。感谢Olga Antipova和Stefan Vogt博士在先进光子源提供的用户支持与协助。本工作由美国国立卫生研究院资助项目2R01GM101502（授予SL）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 成年小鼠脑切片矩阵 | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| 驴源抗兔二抗，Alexa Fluor 488标记 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| 带电荷载玻片 | Genesee | 29-107 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 800 | |
| 冷冻切片机 | Microm GmbH | HM 505E | |
| 冷冻切片机切割刀片 | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| 微型剪刀，9.5 cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚） | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| 多巴胺β-羟化酶（DBH）抗体 —— 实验室自制（兔源） | B. Eipper | - | |
| 多巴胺β-羟化酶（DBH）抗体 —— 商业化产品（兔源） | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon管，50 ml | USA Scientific | 339652 | |
| 异氟烷（Forane） | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| 显微有齿镊（Micro Adson 镊） | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| 硬封固封片介质 | EM sciences | 17984-24 | |
| 显微镜 | Pascal | LSM 5 | |
| 多孔板，24孔 | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| 最佳切割温度包埋剂（OCT） | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| 10% 多聚甲醛（PFA）/ 甲醛溶液 | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| 一次性可剥离包埋模具（Peel-A-Way） | Polysciences Inc. | 18646A | |
| 画笔 | |||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Life Tech | 14190250 | |
| 剃须刀片 | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| 刮铲 | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T型针 | Office Depot | 344615 | |
| 《立体定位坐标中的小鼠脑》，Paxinos 与 Franklin，第3版 | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100（用于配制PBSD） | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| 酪氨酸羟化酶（TH）抗体（兔源） | EMD Millipore | AB152 | |
| X射线荧光分析用Ultralene超薄膜 | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| 宽场荧光显微镜 | Zeiss | Axio Zoom.V16 |
参考文献
- Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
- Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 4/08/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. An author affiliation was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory
