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方法文章

使用机器人系统处理并包埋小鼠结肠样本以进行组织学分析

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DOI：

10.3791/58654

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2019年1月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pathology Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology, 3Gastroenterology and Endoscopy Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 4Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

本文内容

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摘要

缺乏标准化的小鼠组织处理流程降低了小鼠组织病理学分析的质量，相较于人类样本存在明显不足。本文介绍一种用于小鼠炎症性及非炎症性结肠组织病理学检查的实验方案，以证明常规用于组织处理与包埋的机器人系统的可行性 人源样本

摘要

由于动物模型的研究，人类疾病的认识已得到极大拓展。然而，实验模型的组织病理学评估必须与人类样本的评估同样严格。事实上，得出可靠且准确结论的关键在于组织切片制备的质量。本文介绍了一种小鼠组织组织病理学分析的方案，在从初始处理到小鼠样本石蜡包埋的整个过程中引入了多个自动化步骤。通过自动化操作实现严格的方案标准化，减少了方法学上的变量，从而提高了小鼠病理分析的整体可靠性。具体而言，本方案描述了利用自动化处理和包埋机器人系统——这些系统通常用于人类样本的组织处理和石蜡包埋——来处理小鼠肠道炎症标本的方法。我们得出结论：引入标准化和自动化的技术可显著提高小鼠组织组织病理学检查的可靠性。

引言

近几十年来，已开发出多种实验模型，用于解析导致人类疾病的致病机制1,2。为了评估疾病的严重程度，研究人员必须评价治疗的效果，并研究细胞学和组织学结构的变化或炎症程度3。对这些实验模型进行研究时，需要进行详细的组织病理学分析，通常需比较小鼠与人类样本4,5。

此外，人类样本通常由组织病理学核心设施和经验丰富的病理学家通过标准化的组织病理学标准和方法进行处理和评分。相反，小鼠组织通常由对组织病理学操作流程经验有限的研究人员进行固定、包埋和分析。组织病理学检查的质量和可靠性始于高质量组织切片的制备。多个关键因素会影响最终分析结果的质量，包括固定、大体切片、处理、石蜡包埋以及样本的包埋方式6,7。

所有这些涉及样本操作的步骤均可能引入人为误差，包括样本的手动包埋，以及在较小程度上的手动切片和染色。目前，小鼠组织用于组织学评估的整个制备过程依赖于各实验室之间存在差异的手动操作方案。本研究的目标是建立标准化的自动化操作流程，以减少小鼠组织病理学检查中的误差和变异。

据我们所知，本文首次描述了用于小鼠组织病理学评估的全自动组织处理与包埋方案，这些方案通常被病理科用于人类标本的分析。作为该方法可行性的实际示例，已对一种小鼠肠道炎症模型进行了分析，即, 通过在饮水中反复给予硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的慢性结肠炎模型8,9该实验条件与人类炎症性肠病（IBD）高度相似10 由于DSS处理的动物会表现出肠道炎症的迹象，例如体重减轻、稀便或腹泻、结肠缩短以及纤维化8,9,11正如在人类炎症性肠病（IBD）患者中所观察到的那样，DSS处理会引发复杂的疾病进程。在此背景下，需要进行详尽的组织学评估，以理解组织结构的深刻改变。因此，采用所述方案提高样本制备质量，可能有助于依赖组织学和免疫组织化学分析来解读小鼠实验结果的研究人员。涉及组织结构改变、不同组织和器官（如肠道、脑、肝脏、皮肤）中存在细胞浸润或炎症反应的人类疾病小鼠实验模型，均可从更高质量的样本制备中受益，以用于组织病理学检查。

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方案

动物实验已获得意大利卫生部批准（授权编号：127/15，27/13），并遵循欧洲肿瘤研究所IACUC（机构动物护理与使用委员会）的动物护理指南

1. 通过重复给予DSS诱导慢性结肠炎

  1. 将年龄和性别相匹配的小鼠分为2组（DSS处理组 vs. 对照H2每实验组至少5只同窝小鼠。
  2. 处理组饮用含2.5% DSS（40 kDa）的水，对照组饮用纯水，持续7天。
    注意： 该模型可诱导产生慢性透壁性肠道炎症9.
  3. 7天后停止DSS处理，两组均给予饮水14天。重复此过程3次。
    注意：重复给予DSS可诱导结肠黏膜发生改变，与人类炎症性肠病（IBD）的纤维化表现极为相似。9.
  4. 根据机构IACUC批准的程序处死小鼠，即, 由 CO2 吸入
  5. 用手术刀切开小鼠腹腔和腹膜。
    注意： 建议无菌操作，但并非严格必需。
  6. 用镊子和止血钳将结肠与小肠分离。用镊子和止血钳切除结肠。
    注意： 结肠长度测量（图1A是一种用于确定DSS处理小鼠是否发生结肠炎的方法。
  7. 在培养皿中用 10 mL 冷的 1x 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗结肠，并轻轻按压以去除粪便物质。

2. 小鼠组织固定

  1. 将每份小鼠结肠样本浸入 10 mL 的 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）中，于室温（RT）下处理。
    注意：建议保持无菌，但非严格必需。
  2. 于室温下固定组织 18–24 小时。

3. 结肠切片与组织制备

  1. 用小镊子将固定组织从NBF容器中取出，并放入培养皿中。用小镊子将结肠放置在切片工作板上。
  2. 用无菌手术刀将结肠切成片段（长度为0.2 cm至0.3 cm）。此片段长度最为适宜，可避免超过包埋盒的厚度限制。
  3. 用小镊子夹取一段结肠组织（图2A）。用小镊子将一段结肠组织插入定向石蜡包埋盒的其中一个塑料凸起端内（图2B）。
  4. 每个包埋盒重复步骤（3.2–3.3）再插入另外3段结肠组织。避免将组织段插入相邻的凸起端，以尽量减少组织重叠。
  5. 小心按压包埋盒的四个边缘，将其紧密闭合（图2C）。避免挤压组织，以防造成组织损伤。
  6. 将网格插入塑料支撑架中。标记支撑架以识别样品。对每个生物学样品重复上述操作。

4. 组织处理

  1. 按下电源按钮，启动自动组织处理仪（图3A，3B）。
  2. 预热1小时，以确保石蜡完全融化。观察仪器上专用图标是否出现，以确认石蜡已完全融化（图3C）。
  3. 将每个已定向的组织包埋盒（内含组织样本）手动插入自动组织处理仪配备的金属篮中（图3D）。将包埋盒垂直放置，并紧密排列，以优化篮子的空间利用率。
  4. 关闭金属篮（图3E）。
  5. 打开浸蜡缸的盖子（图3F）。浸蜡缸是用于将金属篮插入仪器内部的腔室。将金属篮插入处理仪指定的卡槽中（图3G），然后关闭浸蜡缸盖子（图3H）。
  6. 使用仪器计算机上的触摸屏设定工作程序（图3I）。根据表1提供的方案，选择所用试剂溶液的顺序、处理时间和温度。
  7. 通过点击计算机上的专用图标，将选定程序分配给装有金属篮的浸蜡缸（图3J）。点击启动按钮开始运行程序（图3L）。
  8. 等待仪器显示程序结束的专用图标，并听到仪器发出的提示音，以确认程序已完成。
  9. 打开浸蜡缸盖子，从处理仪中取出金属篮（图3M）。

5.  组织包埋

  1. 按下电源按钮，启动自动包埋机（图4A）。
  2. 预热1小时，以确保石蜡完全融化。观察仪器内置温度计显示的石蜡浴温度，待仪器确认石蜡已完全融化后方可继续操作。
  3. 将处理完毕的组织盒从处理机篮中手动转移至包埋机架上。每个架最多可容纳32个组织盒（图4B、4C）。
  4. 打开包埋机主盖板（图4C、4D、4E）。
  5. 使用仪器计算机上的触摸屏，向机器人系统发出即将插入架的信号（图4F）。
  6. 打开进样仓盖板（图4G），将架插入进样仓。每台包埋机最多可同时容纳4个架（图4H、4I）。关闭进样仓盖板（图4J）。
  7. 根据表2，使用仪器计算机上的触摸屏启动包埋程序（图4K）。
    注意：每批32个组织盒的包埋过程需时45分钟。
  8. 观察仪器上专用图标是否出现，待仪器确认程序结束后再进行下一步操作（图4L）。
  9. 取出出口架（图4M），关闭包埋机主盖板。
  10. 从架上取下已包埋的蜡块（含方向网格），并将蜡块转移至储存用纸板盒中。

6. 微米切片

  1. 打开切片机的冷却板，将温度设置在 -8 至 -10 °C 之间。
  2. 打开切片机的恒温水浴，其中装有2 L蒸馏水，将水浴温度设定在42–45 °C之间。
  3. 将石蜡包埋块置于冷却板上，至少静置5分钟以使包埋块充分冷却。
  4. 从冷却板上取下一个组织块，并将其放入切片机的样品夹中。
  5. 将切片机切片厚度设置为 10 µm。以 10 µm 厚度对包埋块进行修块，连续切片 6 次。
  6. 将切片机的厚度设置从10 µm调整为3 µm。切一张3 µm厚的切片用于苏木精和伊红（Hematoxylin and Eosin，H&E）染色。&E) 染色。
  7. 用小刷子收集3 µm切片。将3 µm切片放入水浴中，小心铺展于水面，以减少组织皱褶。从恒温水浴中将组织切片转移至单张载玻片上。
    1. 如有需要，可切取更多切片。
  8. 用记号笔在载玻片上标注样本编号。
  9. 将载玻片放入37 °C的烘箱中至少10分钟。
  10. 将载玻片放入架子中用于立即分析，或放入储存盒中保存。

7. 苏木精和伊红（H&E）染色

  1. 按下电源按钮，开启自动染色机。通过观察仪器显示器上加载进度条的变化，等待机械臂完成初始化。
  2. 将玻璃载玻片垂直插入染色机支架中，最多可插入30张载玻片。
  3. 使用合适的射频识别（RFID）塑料标签标记支架。RFID标签系统用于识别已加载到染色机计算机中的正确染色程序。
  4. 将支架插入染色机中。计算机将根据RFID标签的识别信息自动加载并启动相应的染色程序。
    注意：苏木精和伊红（H&E）染色的程序详见表3。

8. 免疫组织化学染色

  1. 按照先前所述方法进行免疫组织化学染色和马洛里三色染色7。

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结果

通过在饮水中反复给予DSS诱导的实验性慢性结肠炎是一种小鼠肠道炎症模型，与人类炎症性肠病（IBD）非常相似8,9。图1描述了DSS处理的影响，包括结肠缩短（图1A），这是评估DSS诱导炎症存在与否的常用指标，以及结肠中促炎基因CXCL10、tnf和mcp-1的表达（图1B）。DSS处理显著增强了炎性细胞的浸润，通过流式细胞术分析显示肠道固有层中免疫反应被募集（图1C）。

图2 展示结肠组织...

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讨论

在小鼠组织进行组织病理学分析的制备过程中，我们采用了多种自动化步骤。本方案旨在提供技术提示，以提高整个流程的可重复性和标准化程度，从而提升最终组织病理学评估的整体质量。我们引入了用于组织制备和包埋的自动化仪器与方法，这些仪器和方法在病理学核心设施中常用于人源样本的研究。

为了展示该方法的潜在适用性，我们选择了一种称为DSS诱导的慢性结肠炎模型的小鼠慢性实验体系，用于研究肠道炎症。该模型类似于炎症性肠病（IBD）患者中观察到的复杂疾病进程，需要进行精细的组织学评估，以深入分析慢性肠道炎症过程中组织结构发生的显著改变。总体而言，对这些过程的组织学评估可能会因样本制备质量的提高而显著受益。需要注意的是，本方案也可应用于其他小鼠组织（如脾脏、淋巴结、肝脏、脑组织），唯一的区别在于，对于无管腔的组织，无需使用定向包埋盒。

最重要的观察结果是手动错误的减少（即, 由于使用了带有网格的包埋盒，并且在包埋过程中无需重新打开包埋盒（这一步骤在手动操作流程中通常需要），样品的取向得以保持，从而显著提高了分析的整体可重复性。根据本...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢米兰IRCCS综合医院病理科提供的技术支持，以及IEO动物实验中心在动物饲养方面给予的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水乙醇Carlo Erba414605试剂
无水乙醇（ETOH）Honeywell02860-1L试剂
硫酸铝钾SIGMAA6435试剂
苯胺蓝SIGMA415049试剂
石炭酸品红SIGMAC4165试剂
CD11b（克隆 M1/70）TONBO biosciences35-0112-U100抗体
CD20 免疫组化（克隆 SA275A11）Biolegend150403抗体
CD3（17A2）TONBO biosciences35-0032-U100抗体
CD4（GK1.5）BD Biosciences552051抗体
CD45.2（克隆 104）BioLegend109837抗体
CD8（53-6.7）BD Biosciences553031抗体
柠檬酸盐缓冲液 pH 6 10倍浓缩液SIGMAC9999试剂
DABVector LaboratoriesSK-4100试剂
DPBS 1倍溶液MicrogemL0615-500试剂
DSSTdB ConsultancyDB001试剂
EDTASIGMAE9884试剂
EnVision Flex 过氧化物酶阻断试剂DAKO包含于 GV80011-2
EnVision Flex 底物DAKO包含于 GV80011-2
EnVision Flex/HRPDAKO包含于 GV80011-2
EnVision Flex+ 大鼠连接剂DAKO包含于 GV80011-2
伊红VWR1.09844试剂
F4/80（克隆 BM8）BioLegend123108抗体
福尔马林PanReac2,529,311,215试剂
冰醋酸SIGMA71251试剂
山羊抗大鼠-HRPAgilent DAKOP0448抗体
苏木精DIAPATHC0303试剂
LEICA 旋转式切片机（RM2255）LeicaRM2255设备
Ly6g（克隆 1A8）BD Biosciences551459抗体
氧化汞(II)SIGMA203793试剂
Omnis Clearify 透明剂DAKOCACLEGAL试剂
Omnis EnVision Flex TRSDAKOGV80011-2试剂
橙黄GSIGMAO3756试剂
石蜡Sakura7052试剂
PelorisLEICA设备
PercollSIGMAP4937试剂
不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基MicrogemL0501-500试剂
STS020Leica设备
Tissue-Teck 可切片包埋盒（Paraform）SAKURA7022设备
Tissue-Tek 自动石蜡包埋机Sakura设备
二甲苯J.T.Baker8080.1000试剂

参考文献

  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
  3. Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
  4. Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
  5. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
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  7. Rosai, J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , Elsevier. (2011).
  8. Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
  9. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
  10. Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
  11. Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 2/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

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机器人组织处理小鼠样本包埋组织学分析方案自动石蜡包埋小鼠结肠组织肠道炎症模型苏木精和伊红染色验证免疫组织化学染色组织包埋盒制备自动处理仪操作
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