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利用机器人系统对结肠小鼠样本进行处理和嵌入进行组织学分析

DOI:

10.3791/58654

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pathology Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology, 3Gastroenterology and Endoscopy Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 4Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

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Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

与人体标本相比, 小鼠组织处理缺乏标准化, 降低了小鼠组织病理学分析的质量。在这里, 我们提出了一个方案, 以进行组织病理学检查小鼠发炎和非炎症结肠组织, 以显示机器人系统的可行性, 通常用于处理和嵌入人体样本。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于对动物模型的研究, 对人类疾病的了解大大扩展。尽管如此, 对实验模型的组织病理学评价需要像人类样本一样严格。事实上, 得出可靠和准确的结论是关键的影响组织切片准备的质量。在这里, 我们描述了一种小鼠组织组织病理学分析的协议, 该协议在过程中实现了几个自动化步骤, 从最初的准备工作到小鼠样本的石蜡嵌入。通过严格的协议标准化从自动化程序减少方法变量有助于提高小鼠病理分析的整体可靠性。具体而言, 该协议描述了利用自动处理和嵌入机器人系统, 通常用于组织处理和石蜡嵌入人体样本, 以处理肠道炎症的小鼠标本。我们的结论是, 在采用标准化和自动化技术后, 小鼠组织组织病理学检查的可靠性显著提高。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在过去的几十年里, 已经开发了几个实验模型来剖析导致人类疾病的致病机制 1,2。为了评估疾病的严重程度, 研究人员必须评估治疗的效果, 并研究细胞学和组织学建筑变化或炎症的数量 3。为了在这些实验模型上进行, 需要进行详细的组织病理学分析, 通常比较小鼠和人体样本 4,5。

此外, 人类样本通常由组织病理学核心设施和经验丰富的人类病理学家通过标准化的组织病理学标准和方法进行处理和评分。相反, 小鼠组织通常是固定的, 嵌入和分析的研究人员有有限的经验, 组织病理学方案。组织病理学检查的质量和可靠性始于高质量组织切片的制备。有几个因素对提高或降低最终分析的质量有重要的作用, 包括固定、宏观切片、处理、石蜡嵌入和样本6、7 的嵌入。

所有这些涉及操作样品的段落都会出现手动错误, 包括手工嵌入样品, 以及在较小程度上进行人工微胶卷切片和染色。目前, 用于组织学评价的小鼠组织制备的整个过程依赖于从实验室到实验室和人工的规程。本研究的目的是实施标准化的自动化协议, 以减少小鼠组织病理学检查中的错误和变异性。

据我们所知, 我们在这里描述了用于全自动组织处理和嵌入的用于小鼠组织组织学评估的第一个协议;这些通常用于病理单位的人体标本的分析。作为该方法可行性的一个实例, 分析了肠道炎症的小鼠模型, 即饮用水中反复给药的硫酸右旋酯钠 (dss) 引起的慢性结肠炎模型8 ,9。这个实验设置非常类似于人类炎症性肠病 (ibd)10 , 因为 dss 治疗的动物表现出肠道炎症的迹象, 如体重减轻, 大便松动或腹泻, 结肠缩短, 以及纤维化8,9,11。正如对人类 ibd 患者所观察到的, dss 治疗会产生复杂的疾病过程。在此背景下, 需要进行详细的组织学评估, 以了解组织结构的深刻改变。因此, 实施所述提高样品制备质量的方案可能有利于研究人员依靠对小鼠实验设置的组织学和免疫组织化学分析的解释。小鼠疾病的实验模型涉及组织结构的改变、细胞组织浸润或不同组织和器官 (肠道、大脑、肝脏、皮肤) 中的炎症, 可以使用增加的质量。组织病理学检查的样品制备。

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Protocol

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动物程序得到意大利卫生部的批准 (auth. 127/15, 27/13), 并遵循了欧洲肿瘤学研究所 (机构动物护理和使用委员会) 的动物护理指南

1. 重复 dss 诱导慢性结肠炎

  1. 两组分别对小鼠进行年龄和性别匹配 (治疗 dss 与对照h2o, 每个实验组至少5只小鼠分类)。
  2. 在饮用水中对治疗组进行7天的2.5% 的 dss (40 kda), 并向对照组进行水分处理。
    请注意:这种模式诱发慢性经膜肠道炎症9。
  3. 7天后, 停止 dss 处理, 给两组人供水 1 4天。重复此过程3次。
    注: 重复给药 dss 会引起与人类 ibd 非常相似的结肠黏膜的改变, 即纤维化9。
  4. 根据机构 iacuc 授权的程序, 即通过吸入二氧化碳来牺牲小鼠.
  5. 用手术刀打开老鼠的腹部和腹膜。
    请注意:建议使用无菌, 但不是严格要求。
  6. 用钳子和推子将结肠从小肠分开。用钳子和钳子把结肠吃了。
    请注意:结肠长度测量 (图 1a) 是一种确定是否发生在 dss 治疗小鼠的结肠炎的方法。
  7. 用10毫升冷的1x 磷酸盐缓冲碱 (pbs) 在培养皿中冲洗结肠, 然后轻轻按压以去除粪便材料。

2. 小鼠组织固定

  1. 将每个小鼠结肠标本浸泡在10毫升的10% 中性缓冲福尔马林 (nbf) 在 rt (室温)。
    请注意:建议使用无菌, 但不是严格要求。
  2. 在 rt 将组织固定18-24小时。

3. 结肠切片和组织准备

  1. 用小推拿器从 nbf 容器中取出固定组织, 放入培养皿中。用小子把结肠放在切片工作板上。
  2. 用无菌手术刀将冒号切成碎片 (0.2 厘米至0.3 厘米长)。为了不超过盒式磁带的厚度, 此片段长度是最佳的。
  3. 拿起一个结肠段与小推子 (图 2a)。将一个冒号段插入定向石蜡用小推拿包盒的塑料凸出尖端 (图 2b)。
  4. 重复操作 (3.2–3.3), 每盒磁带增加3个冒号段。避免将节段插入相邻的凸起提示, 以最大限度地减少组织的重叠
  5. 小心地推四个边 (图 2c), 将盒式磁带紧紧地合上。避免挤压组织, 以防止组织损伤。
  6. 将网格插入塑料支撑架。标记支持框架以标识示例。对每个生物样本重复此操作。

4. 组织加工

  1. 按下电源按钮打开自动处理器 (图 3 a, 3A)。
  2. 加热 1小时, 确保石蜡融化。通过观察专用图标的存在, 等待仪器确认石蜡完全融化 (图 3c)。
  3. 将每个定向盒式磁带 (包含组织标本) 手动插入自动处理器提供的金属篮 (图 3d)。将盒式磁带垂直放置, 将其排列在靠近一个的地方, 以优化篮筐的占用率。
  4. 关闭金属篮子 (图 3e)。
  5. 打开蒸馏器的盖子 (图 3f)。反驳是将篮子插入机器的地方。将购物篮插入处理器的专用外壳 (图 3g)。合上蒸馏器的盖子 (图 3h)。
  6. 使用仪表计算机上的触摸屏定义工作协议 (图 3i)。根据表 1提供的方案选择要实现的解决方案、时间和温度的顺序。
  7. 通过单击专用计算机图标 (图 3j), 将在包含购物篮的蒸馏器上运行的协议分配给您。通过单击"开始" 按钮启动协议 (图 3l)。
  8. 通过观察专用图标的存在和听到来自机器的报警音, 等待仪器确认协议的结束。
  9. 打开反驳盖。从处理器中取出购物篮 (图 3m)。

5. 组织嵌入

  1. 按下电源按钮打开自动嵌入器 (图 4 a)。
  2. 加热 1小时, 确保石蜡融化。通过观察仪器内部温度计指示的石蜡浴温度, 等待仪器确认石蜡完全熔化。
  3. 手动将所有已处理过的盒式磁带从处理器篮转移到嵌入式机架。每个机架最多可以包含32盒磁带。(图 4b, 4B)。
  4. 打开主盖盖 (图 4c、 4C、4C)。
  5. 使用仪表计算机上的触摸屏向机器人系统发出正在插入机架的信号 (图 4f)。
  6. 打开进气盖 (图 4g)。将机架插入进气口。每个嵌入式器最多可以同时包含4个机架 (图 4h, 4H)。关闭进气盖 (图 4j)。
  7. 根据表 2 (图 4k), 使用仪表计算机上的触摸屏开始嵌入过程。
    注: 每个32个盒式磁带的机架需要45分钟才能嵌入。
  8. 通过观察专用图标的存在 (图 4l), 等待仪器确认协议的结束。
  9. 卸下出口机架 (图 4m)。合上主盖盖。
  10. 从机架中取出嵌入的块 (包含方向网格)。将嵌入的方块转移到存储纸板箱中。

6. 千分尺分割

  1. 打开微孔的冷却板。设置-8 到-10°c 之间的温度。
  2. 打开含有2升蒸馏水的微晶的恒温水浴。将水浴温度设置在42–45°c 之间。
  3. 将石蜡嵌入块放在冷却板上。等待至少 5分钟, 让方块冷却。
  4. 从冷却板上取下一个方块, 并将其放入微孔块支架中。
  5. 将微孔切割厚度设置为 10μm. 在10微米的厚度下切割 6次, 将块修剪。
  6. 将微晶的厚度设置从10μm 改为 3μm, 为血液中氧乙烯和 eosin (h & e) 染色切割一个3μm 的部分。
  7. 用小刷子收集3微米的部分。将3μm 部分放入水浴中, 小心地放置在水面上, 以减少组织皱纹。在一个玻璃滑梯上收集恒温控制的水浴中的组织部分。
    1. 如果需要, 请剪切其他部分。
  8. 通过编写样品标识来标记玻璃滑块。
  9. 将幻灯片放入37°c 的烤箱中至少10分钟。
  10. 将玻璃滑块放入机架中进行即时分析或放入储物箱中。

7. 血红素和 eosin (h & e) 染色

  1. 按下电源按钮, 打开自动着色器。通过观察仪器监视器上加载杆的变化, 允许机器人手臂的初始化。
  2. 将玻璃滑块插入污渍架, 垂直插入多达30张幻灯片。
  3. 用适当的射频识别 (rfid) 塑料标签标记机架。rfid 标签是一种识别加载到着色器计算机中的正确染色协议的系统。
  4. 将机架插入污渍。允许计算机根据 rfid 标签的识别自动加载和启动染色协议。
    请注意:h & e 染色的方法见表 3.

8. 免疫组织化学染色

  1. 进行免疫组织化学和马罗里三色体染色, 如前面所述7。

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Results

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在饮用水中反复给药 dss 引起的实验性慢性结肠炎是一种与人类 ibd8,9非常相似的肠道炎症小鼠模型。图 1描述了 dss 治疗的效果, 包括结肠缩短 (图 1a), 这是一个广泛使用的参数, 用于评分 dss 引起的炎症的存在, 以及包括cxcl10 在内的促炎症基因的结肠表达, tnf和mcp-1 (图 1b)。dss 治疗可大大增强炎症细胞的浸润, 显示细胞荧光法分析的肠道自身免疫反应的吸收 (图 1c)。

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Discussion

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我们在准备小鼠组织的过程中使用不同的自动化步骤进行组织病理学分析。该方案旨在提供技术提示, 以提高整个过程的重现性和标准化, 从而提高最终组织病理学评价的整体质量。我们实施了制备和嵌入组织的自动化仪器和方法, 这些仪器和方法通常用于病理核心设施中, 用于人体标本的研究。

为了证明这种方法的潜在适用性, 我们选择了一种慢性小鼠肠道炎症实验设置, 称为 dss 诱导的慢性结肠炎模型。这种情况类似于在 ibd 患者中观察到的复杂疾病过程, 需要详细的组织学评估, 以调查慢性肠道炎症后组织结构的深刻变化。总之, 这些过程的组织学评价可能会大大受益于样品制备质量的提高。需要注意的是, 该方案可应用于其他小鼠组织 (即脾脏、淋巴结、肝脏、大脑), 唯一的区别是没有腔的组织不需要定向盒式磁带。

最重要的观察是, 由于使用带网格的盒式磁带和消除了嵌入的盒式磁带重新打开 (这是手动过程中通常执行的步骤), 减少了手动错误 (即样品的方向)协议), 有力地增强了分析的整体重现性。使用此处描述的协议, 只有在准备开始时, 当实验者...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢米兰 irccs 警察医院病理学系的技术支持和 ieo 动物设施在畜牧业方面的援助。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
无水乙醇无水 Carlo Erba414605试剂
无水 ETOH霍尼韦尔02860-1L试剂
硫酸铝钾SIGMAA6435试剂
苯胺蓝SIGMA415049试剂
卡波尔 品红SIGMAC4165试剂
CD11b（克隆 M1/70）TONBO biosciences35-0112-U100抗体
CD20 IHC（克隆 SA275A11）Biolegend150403抗体
CD3 （17A2）TONBO biosciences35-0032-U100抗体
CD4 （GK1.5）BD生物科学552051抗体
CD45.2（克隆 104）BioLegend109837抗体
CD8 （53-6.7）BDBiosciences 553031抗体
柠檬酸盐缓冲液 pH 6 10xSIGMAC9999试剂
DabVector LaboratoriesSK-4100试剂
DPBS 1xMicrogemL0615-500试剂
DSSTdB ConsultancyDB001试剂
EDTASIGMAE9884试剂
EnVision Flex过氧化物酶封闭试剂GV80011-2DAKO
compreso GV80011-2
EnVision Flex/HRPcompre GV80011 so中的DAKO
EnVision Flex+ 大鼠接头GV80011-2 中的DAKOcompreso
曙红VWR1.09844试剂
F4/80（克隆 BM8）BioLegend123108抗体
福尔马林PanReac2,529,311,215试剂
冰醋酸SIGMA71251试剂
山羊抗大鼠 HRP安捷伦 DAKOP0448抗体
苏木精DIAPATHC0303试剂
徕卡 轮转切片机 （RM2255）徕卡RM2255设备
Ly6g（克隆 1A8）BD Biosciences 551459抗体
氧化汞 IISIGMA203793试剂
Omnis Clearify 清除剂DAKOCACLEGAL试剂
Omnis EnVision Flex TRSDAKOGV80011-2试剂
橙色 GSIGMAO3756试剂
石蜡Sakura7052试剂
PelorisLEICA设备
PercollSIGMAP4937试剂
RPMI 1640 不含 L-谷氨酰胺MicrogemL0501-500试剂
STS020Leica设备
Tissue-Teck Paraform 可切片盒SAKURA7022设备
Tissue-Tek 自动石蜡包埋机Sakura设备
二甲苯J.T.Baker8080.1000试剂
EnVision Flex 底物中的 中的 DAKO EnVision Flex/HRP compreso，

References

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 2/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

Tags

Robotic Tissue ProcessingMurine Sample EmbeddingHistological Analysis ProtocolAutomated Paraffin EmbeddingColonic Murine TissueIntestinal Inflammation ModelH E Staining ValidationImmunohistochemical StainingTissue Cassette PreparationAutomated Processor Operation

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