缺乏标准化的小鼠组织处理流程降低了小鼠组织病理学分析的质量，相较于人类样本存在明显不足。本文介绍一种用于小鼠炎症性及非炎症性结肠组织病理学检查的实验方案，以证明常规用于组织处理与包埋的机器人系统的可行性 人源样本
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摘要
摘要
由于动物模型的研究，人类疾病的认识已得到极大拓展。然而，实验模型的组织病理学评估必须与人类样本的评估同样严格。事实上，得出可靠且准确结论的关键在于组织切片制备的质量。本文介绍了一种小鼠组织组织病理学分析的方案，在从初始处理到小鼠样本石蜡包埋的整个过程中引入了多个自动化步骤。通过自动化操作实现严格的方案标准化，减少了方法学上的变量，从而提高了小鼠病理分析的整体可靠性。具体而言，本方案描述了利用自动化处理和包埋机器人系统——这些系统通常用于人类样本的组织处理和石蜡包埋——来处理小鼠肠道炎症标本的方法。我们得出结论：引入标准化和自动化的技术可显著提高小鼠组织组织病理学检查的可靠性。
引言
近几十年来，已开发出多种实验模型，用于解析导致人类疾病的致病机制1,2。为了评估疾病的严重程度，研究人员必须评价治疗的效果，并研究细胞学和组织学结构的变化或炎症程度3。对这些实验模型进行研究时，需要进行详细的组织病理学分析，通常需比较小鼠与人类样本4,5。
此外，人类样本通常由组织病理学核心设施和经验丰富的病理学家通过标准化的组织病理学标准和方法进行处理和评分。相反，小鼠组织通常由对组织病理学操作流程经验有限的研究人员进行固定、包埋和分析。组织病理学检查的质量和可靠性始于高质量组织切片的制备。多个关键因素会影响最终分析结果的质量，包括固定、大体切片、处理、石蜡包埋以及样本的包埋方式6,7。
所有这些涉及样本操作的步骤均可能引入人为误差，包括样本的手动包埋，以及在较小程度上的手动切片和染色。目前，小鼠组织用于组织学评估的整个制备过程依赖于各实验室之间存在差异的手动操作方案。本研究的目标是建立标准化的自动化操作流程，以减少小鼠组织....
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方案
动物实验已获得意大利卫生部批准（授权编号：127/15，27/13），并遵循欧洲肿瘤研究所IACUC（机构动物护理与使用委员会）的动物护理指南
1. 通过重复给予DSS诱导慢性结肠炎
- 将年龄和性别相匹配的小鼠分为2组（DSS处理组 vs. 对照H2每实验组至少5只同窝小鼠。
- 处理组饮用含2.5% DSS（40 kDa）的水，对照组饮用纯水，持续7天。
注意： 该模型可诱导产生慢性透壁性肠道炎症9. - 7天后停止DSS处理，两组均给予饮水14天。重复此过程3次。
注意：重复给予DSS可诱导结肠黏膜发生改变，与人类炎症性肠病（IBD）的纤维化表现极为相似。9. - 根据机构IACUC批准的程序处死小鼠，即, 由 CO2 吸入
- 用手术刀切开小鼠腹腔和腹膜。
注意： 建议无菌操作，但并非严格必需。 - 用镊子和止血钳将结肠与小肠分离。用镊子和止血钳切除结肠。
注意： 结肠长度测量（图1A是一种用于确定D....
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结果
通过在饮水中反复给予DSS诱导的实验性慢性结肠炎是一种小鼠肠道炎症模型，与人类炎症性肠病（IBD）非常相似8,9。图1描述了DSS处理的影响，包括结肠缩短（图1A），这是评估DSS诱导炎症存在与否的常用指标，以及结肠中促炎基因CXCL10、tnf和mcp-1的表达（图1B）。DSS处理显著增强了炎性细胞的浸润，通过流式细胞术分析显示肠道固有层中免疫反应被募集（图1C）。
图2 展示结肠组织.......
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讨论
在小鼠组织进行组织病理学分析的制备过程中，我们采用了多种自动化步骤。本方案旨在提供技术提示，以提高整个流程的可重复性和标准化程度，从而提升最终组织病理学评估的整体质量。我们引入了用于组织制备和包埋的自动化仪器与方法，这些仪器和方法在病理学核心设施中常用于人源样本的研究。
为了展示该方法的潜在适用性，我们选择了一种称为DSS诱导的慢性结肠炎模型的小鼠慢性实验体系，用于研究肠道炎症。该模型类似于炎症性肠病（IBD）患者中观察到的复杂疾病进程，需要进行精细的组织学评估，以深入分析慢性肠道炎症过程中组织结构发生的显著改变。总体而言，对这些过程的组织学评估可能会因样本制备质量的提高而显著受益。需要注意的是，本方案也可应用于其他小鼠组织（如脾脏、淋巴结、肝脏、脑组织），唯一的区别在于，对于无管腔的组织，无需使用定向包埋盒。
最重要的观察结果是手动错误的减少（即, 由于使用了带有网格的包埋盒，并且在包埋过程中无需重新打开包埋盒（这一步骤在手动操作流程中通常需要），样品的取向得以保持，从而显著提高了分析的整体可重复性。根据本.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢米兰IRCCS综合医院病理科提供的技术支持，以及IEO动物实验中心在动物饲养方面给予的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无水乙醇 | Carlo Erba | 414605 | 试剂 |
| 无水乙醇（ETOH） | Honeywell | 02860-1L | 试剂 |
| 硫酸铝钾 | SIGMA | A6435 | 试剂 |
| 苯胺蓝 | SIGMA | 415049 | 试剂 |
| 石炭酸品红 | SIGMA | C4165 | 试剂 |
| CD11b（克隆 M1/70） | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | 抗体 |
| CD20 免疫组化（克隆 SA275A11） | Biolegend | 150403 | 抗体 |
| CD3（17A2） | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | 抗体 |
| CD4（GK1.5） | BD Biosciences | 552051 | 抗体 |
| CD45.2（克隆 104） | BioLegend | 109837 | 抗体 |
| CD8（53-6.7） | BD Biosciences | 553031 | 抗体 |
| 柠檬酸盐缓冲液 pH 6 10倍浓缩液 | SIGMA | C9999 | 试剂 |
| DAB | Vector Laboratories | SK-4100 | 试剂 |
| DPBS 1倍溶液 | Microgem | L0615-500 | 试剂 |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | 试剂 |
| EDTA | SIGMA | E9884 | 试剂 |
| EnVision Flex 过氧化物酶阻断试剂 | DAKO | 包含于 GV80011-2 | |
| EnVision Flex 底物 | DAKO | 包含于 GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | 包含于 GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ 大鼠连接剂 | DAKO | 包含于 GV80011-2 | |
| 伊红 | VWR | 1.09844 | 试剂 |
| F4/80（克隆 BM8） | BioLegend | 123108 | 抗体 |
| 福尔马林 | PanReac | 2,529,311,215 | 试剂 |
| 冰醋酸 | SIGMA | 71251 | 试剂 |
| 山羊抗大鼠-HRP | Agilent DAKO | P0448 | 抗体 |
| 苏木精 | DIAPATH | C0303 | 试剂 |
| LEICA 旋转式切片机（RM2255） | Leica | RM2255 | 设备 |
| Ly6g（克隆 1A8） | BD Biosciences | 551459 | 抗体 |
| 氧化汞(II) | SIGMA | 203793 | 试剂 |
| Omnis Clearify 透明剂 | DAKO | CACLEGAL | 试剂 |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | 试剂 |
| 橙黄G | SIGMA | O3756 | 试剂 |
| 石蜡 | Sakura | 7052 | 试剂 |
| Peloris | LEICA | 设备 | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | 试剂 |
| 不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基 | Microgem | L0501-500 | 试剂 |
| STS020 | Leica | 设备 | |
| Tissue-Teck 可切片包埋盒（Paraform） | SAKURA | 7022 | 设备 |
| Tissue-Tek 自动石蜡包埋机 | Sakura | 设备 | |
| 二甲苯 | J.T.Baker | 8080.1000 | 试剂 |
参考文献
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Gen....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 2/03/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. An author affiliation was updated.
The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:
Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology
to:
Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS
