分离、测序与分析人源间充质干细胞的细胞外微小RNA

摘要

本方案展示了如何从细胞培养基中纯化细胞外microRNA，用于小RNA文库构建及下一代测序。文中描述了多种质量控制检查点，帮助读者了解在处理低丰度样本（如exRNA）时的预期结果。

摘要

细胞外和循环RNA（exRNA）由机体多种细胞类型产生，存在于唾液、血浆、血清、乳汁和尿液等多种体液中。其中一类RNA是转录后调控因子——微小RNA（miRNA）。为了明确特定细胞类型所产生的miRNA，可利用体外培养系统来收集并分析来源于特定细胞亚群的exRNA。间充质干细胞分泌的因子被认为在缓解多种疾病中发挥重要作用，因此本文将其作为体外模型系统。本文描述了从培养基中收集样本、小RNA纯化及文库构建以测序分析细胞外miRNA的完整流程。由于培养基中的exRNA属于RNA起始量较低的样本，因此需要优化实验步骤。本方案提供了从培养基中进行小exRNA测序的全面操作指南，并在exRNA纯化与测序的每一步骤中设置了质量控制检查点。

引言

细胞外和循环RNA（exRNA）存在于多种体液中，并对RNase具有抗性^1,2。由于其丰度高、稳定性好且易于获取，exRNA在临床评估中作为诊断和预后标志物具有重要价值³。exRNA的运输方式包括通过细胞外囊泡（EVs）、与脂蛋白（如高密度脂蛋白；HDL）结合以及与核糖核蛋白复合物（如Argonaute2复合物）结合⁴。

一部分外泌RNA（exRNA）为微小RNA（miRNA），这类小分子非编码RNA长约22个核苷酸，可调控转录后基因表达。外泌miRNA（ex-miRNA）已被证实参与细胞间的通讯以及细胞稳态的调控⁵。例如，高密度脂蛋白（HDL）可将外泌miR-223递送至内皮细胞，从而抑制细胞间黏附分子1（ICAM-1）的表达及炎症反应⁶。有趣的是，miR-223也可通过细胞外囊泡从白细胞转运至肺癌细胞，促使后者获得更强的侵袭性表型⁷。因此，对来自各种体液及细胞培养基中外泌miRNA转录组的研究将极大促进我们对外泌miRNA信号传导机制的理解。

小RNA测序（smal....

方案

注意：间充质干细胞生长培养基（MSC 培养基）需按照材料表中的说明预先配制。

1. 细胞培养

注意：人源间充质干细胞可从骨髓、脂肪组织或其他来源获得¹¹。此外，也可通过供应商购买人源间充质干细胞。本实验方案中使用的骨髓间充质干细胞来源于患者骨髓，由公司提供。

1. 解冻 1 x 10⁶ 将BMSCs接种至含有20 mL MSC培养基的T175培养瓶中。在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞。₂ 每2-3天更换一次培养基，直至细胞融合度达到80%。
2. 用 5 mL 1×PBS 洗涤细胞，弃去 PBS。
3. 加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育5分钟以消化细胞。轻拍培养瓶侧面以促进细胞脱落。
4. 加入15 mL MSC培养基以灭活胰蛋白酶，使细胞从培养表面脱落，并通过上下吹打获得单细胞悬液。
5. 将细胞收集至50 mL离心管中，在300 x g条件下离心5分钟 g 离心收集细胞。
6. 用1 mL MSC培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
   注意：T175 培养瓶中人原代骨髓间充质干细胞在 80% 汇合度时数量约为 2 × 10⁶

结果

本方案中所述方法经过优化，用于从间充质干细胞（MSC）培养物中收集细胞外RNA（exRNA），以进行下一代测序。工作流程的整体示意图见左侧的图1，相应的质量控制检查点显示在右侧。

未分化（图3A）和分化后（图3B）细胞在收集当天的细胞形态如图所示。此外，还展示了诱导7天后细胞碱性磷酸酶（ALP）活性的代表性归一化水平（图3C）。此处，ALP活性约为未诱导细胞的2.5倍。

三个T175培养瓶的汇合度为100%的MSC可获得2-5 × 10⁶个外泌体¹⁰ 颗粒/mL（

讨论

本文介绍了一种用于外泌体RNA（exRNA）下一代测序的实验方案，可实现对低起始量样本进行差异表达分析。遵循特定的细胞外囊泡（EV）和exRNA分离流程至关重要，因为即使微小的改动（例如超速离心步骤或转子类型的改变）也可能影响转录组和miRNA的水平^13,14。因此，无论采用何种方法分离exRNA，在同一项实验中，所有样本均应采用相同的实验操作和生物信息学分析流程，以确保结果具有可比性。

RNA 完整性通常通过生物分析仪进行评估。然而，由于细胞外RNA（exRNA）不含全长的rRNA，其RIN值通常很低，但这并不一定反映RNA样本的质量低下。此外，exRNA的RNA浓度差异较大，且常常不准确。因此，无需通过生物分析仪评估RNA质量或进行RNA定量，而应在每次实验中使用相同体积的培养基进行后续处理。同时，将提取的RNA重悬于相同体积的重悬缓冲液中，并在建库时使用相同体积的RNA溶液。

通过将接头用量减少至标准方案.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
骨髓来源的间充质干细胞	ATCC	PCS-500-012	本方案中使用的细胞购自 ATCC
MSCGM BulletKit	Lonza	PT-3001	称为间充质干细胞生长培养基（MSC培养基）
无外泌体胎牛血清	Gibco	A2720801
exRNA收集培养基：MSCGM，但将其中的FBS替换为无外泌体FBS
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200056
T175 培养瓶	Sarstedt	833,912
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
磷酸盐缓冲液	Sigma	806552
超速离心机	贝克曼库尔特
带盖组件的聚碳酸酯瓶	贝克曼库尔特	355618
Beckman Coulter Type 60 Ti			此处使用的转子
NucleoCounter	Chemometec	NC-3000	细胞计数仪
β-甘油磷酸盐	Calbiochem	35675	成骨分化培养基的组分
地塞米松	Sigma	D4902-25MG	成骨分化培养基的组分
2-磷酸-L-抗坏血酸 三钠盐酸	Sigma	49752-10G	成骨分化培养基的组分
1α,25-二羟基维生素 D3	Sigma	D1530-1MG	成骨分化培养基的组分
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	用于步骤 4.8 的 miRNA 和总 RNA 纯化试剂盒
安捷伦 RNA 6000 Pico 试剂盒	安捷伦科技	5067-1514	基于芯片的毛细管电泳仪及用于RNA和DNA分析的芯片
安捷伦 2100 生物分析仪	安捷伦科技	G2939BA	基于芯片的毛细管电泳仪及用于RNA和DNA分析的芯片
安捷伦高灵敏度DNA试剂盒	安捷伦科技	5067-4626	基于芯片的毛细管电泳仪及用于RNA和DNA分析的芯片
KAPA文库定量试剂盒	罗氏	KK4824	此处使用的文库定量试剂盒
TruSeq Small RNA 文库制备试剂盒 - A组（24次反应）（A组：index 1-12）	Illumina	RS-200-0012	本方案中使用的小RNA文库制备试剂盒——用于步骤5
Pippin Prep	Sage Science		本方案中使用的自动DNA凝胶提取仪；也可进行手动提取
MinElute PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28004	步骤5.17中的PCR纯化
FASTX_Toolkit	冷泉港实验室		第6步中修剪低质量读段
cutadapt			第6步中的接头去除
Bowtie			步骤6中干净读段的比对
Samtools			在第6步中构建表达谱
Bedtools			在第6步中建立表达谱