本方案展示了如何从细胞培养基中纯化细胞外microRNA，用于小RNA文库构建及下一代测序。文中描述了多种质量控制检查点，帮助读者了解在处理低丰度样本（如exRNA）时的预期结果。
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方法文章
分离、测序与分析人源间充质干细胞的细胞外微小RNA
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
细胞外和循环RNA（exRNA）由机体多种细胞类型产生，存在于唾液、血浆、血清、乳汁和尿液等多种体液中。其中一类RNA是转录后调控因子——微小RNA（miRNA）。为了明确特定细胞类型所产生的miRNA，可利用体外培养系统来收集并分析来源于特定细胞亚群的exRNA。间充质干细胞分泌的因子被认为在缓解多种疾病中发挥重要作用，因此本文将其作为体外模型系统。本文描述了从培养基中收集样本、小RNA纯化及文库构建以测序分析细胞外miRNA的完整流程。由于培养基中的exRNA属于RNA起始量较低的样本，因此需要优化实验步骤。本方案提供了从培养基中进行小exRNA测序的全面操作指南，并在exRNA纯化与测序的每一步骤中设置了质量控制检查点。
引言
细胞外和循环RNA（exRNA）存在于多种体液中，并对RNase具有抗性1,2。由于其丰度高、稳定性好且易于获取，exRNA在临床评估中作为诊断和预后标志物具有重要价值3。exRNA的运输方式包括通过细胞外囊泡（EVs）、与脂蛋白（如高密度脂蛋白；HDL）结合以及与核糖核蛋白复合物（如Argonaute2复合物）结合4。
一部分外泌RNA（exRNA）为微小RNA（miRNA），这类小分子非编码RNA长约22个核苷酸，可调控转录后基因表达。外泌miRNA（ex-miRNA）已被证实参与细胞间的通讯以及细胞稳态的调控5。例如，高密度脂蛋白（HDL）可将外泌miR-223递送至内皮细胞，从而抑制细胞间黏附分子1（ICAM-1）的表达及炎症反应6。有趣的是，miR-223也可通过细胞外囊泡从白细胞转运至肺癌细胞，促使后者获得更强的侵袭性表型7。因此，对来自各种体液及细胞培养基中外泌miRNA转录组的研究将极大促进我们对外泌miRNA信号传导机制的理解。
小RNA测序（small RNA seq）是一种强大的工具，可用于研究小RNA的转录组学。该技术不仅可用于比较不同样本中已知RNA的差异表达，还可用于检测和表征新发现的小RNA。因此，它也是一种在不同条件下鉴定差异表达miRNA的可靠方法。然而，小RNA测序面临的一个难题是从外泌RNA输入量较低的体液（如脑脊液、唾液、尿液、乳汁、血清和培养基）中构建小RNA测序文库。Illumina公司的TruSeq Small RNA Library Prep方案要求约1 µg高质量的总RNA，而New England Biolabs公司的NEBNext Small RNA Library Prep Set方案则需要100 ng至1 µg的RNA8,9。通常情况下，这些样本中的总RNA含量低于常规紫外-可见光分光光度计的检测限。
来自体液的外泌体miRNA（ex-miRNA）可能是良好的预后和诊断标志物。然而，为了研究其功能作用或确定特定ex-miRNA的来源，通常会使用细胞培养系统。间充质干细胞（MSCs）已被广泛研究，因为其细胞外囊泡（EVs）已被证实可缓解多种疾病，包括心肌梗死、阿尔茨海默病和移植物抗宿主病10。本文中，我们展示了从骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）中纯化ex-miRNA的方法，以及优化小RNA文库构建、测序和数据分析的具体步骤（图1）。
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方案
注意：间充质干细胞生长培养基（MSC 培养基）需按照材料表中的说明预先配制。
1. 细胞培养
注意：人源间充质干细胞可从骨髓、脂肪组织或其他来源获得11。此外，也可通过供应商购买人源间充质干细胞。本实验方案中使用的骨髓间充质干细胞来源于患者骨髓，由公司提供。
- 解冻 1 x 106 将BMSCs接种至含有20 mL MSC培养基的T175培养瓶中。在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞。2 每2-3天更换一次培养基，直至细胞融合度达到80%。
- 用 5 mL 1×PBS 洗涤细胞，弃去 PBS。
- 加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育5分钟以消化细胞。轻拍培养瓶侧面以促进细胞脱落。
- 加入15 mL MSC培养基以灭活胰蛋白酶，使细胞从培养表面脱落，并通过上下吹打获得单细胞悬液。
- 将细胞收集至50 mL离心管中，在300 x g条件下离心5分钟 g 离心收集细胞。
- 用1 mL MSC培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
注意：T175 培养瓶中人原代骨髓间充质干细胞在 80% 汇合度时数量约为 2 × 10⁶6 细胞 - 以2,000个细胞/cm²的密度接种hMSCs2 在5个T175培养瓶中加入新鲜的MSC培养基。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。2 每2-3天更换一次培养基，直至获得5个达到90%汇合度的T175培养瓶。
2. 外泌体及RNA相关生物分子的收集
注意：EV 收集培养基需预先配制（含 10% 胎牛血清 [FBS] 和 1% 青霉素/链霉素 [P/S] 的杜氏改良伊格尔培养基 [DMEM]）。EV 收集培养基即为常规的 MSC 培养基，但需使用商品化的 EV 去除型 FBS 配制（材料表）。目的是避免来自 FBS 的牛源外泌体 RNA（exRNA）污染，因为普通 FBS 通常含有与 EVs、核糖核蛋白复合物及脂蛋白相关的 exRNA。进行小 RNA 文库构建时，需收集 5 个汇合度达到 100% 的 MSC 培养瓶所分泌的 exRNA，方可进行文库制备。
- 每瓶 T175 培养瓶用 20 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 3 次。每瓶汇合度达到 100% 的 MSCs T175 培养瓶中加入 20 mL 外泌体收集培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。
- 收集培养基，于 4 °C 条件下以 300 × g 离心 10 分钟。
- 收集上清液，于 4 °C 条件下以 2,000 × g 离心 20 分钟。
- 收集上清液，于 4 °C 条件下以 15,500 × g 离心 30 分钟，然后收集上清液。
- 将上清液转移至超速离心管中，于 4 °C 条件下以 100,000 × g 离心 90 分钟以沉淀外泌体 RNA（exRNA）。此处使用固定角转子，沉淀将附着于管壁一侧。标记管盖的一侧，并在管壁上画圆圈标示预期沉淀位置。
- 弃去上清液，将离心管倒置在吸水纸上干燥内壁，并用小片吸水纸小心吸除管内残留液体，避免接触管底。加入 200 μL PBS，通过涡旋振荡 30 秒并上下吹打 20 次重悬沉淀。
- 使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）对外泌体（EVs）和生物分子进行表征（图 2）。
注意：外泌体和生物分子可通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）或透射电子显微镜（TEM）进行检测12。 - 将外泌体和生物分子储存于 -80 °C，直至后续实验使用。
注意：若外泌体将用于功能研究，需添加 20% 甘油以防止其破裂。如有需要，可按照标准操作流程收集细胞。
3. 分化细胞的细胞外囊泡及RNA相关生物分子的收集
注意：在细胞进行分化的过程中，也可以从细胞培养基中收集细胞外囊泡（EVs）及与RNA相关的生物分子。本方案中描述的示例为成骨细胞分化，以及在分化第0天和第7天收集外泌体RNA（exRNA）。如果无需进行分化，则跳过第3节，直接进入第4节。
- 每次均需新鲜配制成骨分化培养基（含10% FBS、1% P/S、10 mM β-甘油磷酸钠、10 nM 地塞米松、50 μM 抗坏血酸-2-磷酸盐和10 mM 1.25-维生素-D3的DMEM培养基）。
- 当MSCs达到80%融合度时，将MSC培养基更换为成骨分化培养基。
- 每2–3天更换一次成骨分化培养基。
- 在分化第5天，弃去培养基，并用每瓶T175培养瓶20 mL PBS洗涤细胞3次。
- 向每瓶融合的MSCs T175培养瓶中加入20 mL含有10 mM β-甘油磷酸钠、10 nM 地塞米松、50 μM 抗坏血酸-2-磷酸盐和10 mM 1.25-维生素-D3的EV收集培养基。将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时，以在收集EVs和生物分子的同时维持分化过程。
- 在第7天收集培养基，并按照步骤2.2–2.6所述方法分离EVs和生物分子。
- 为进行质量控制，将细胞接种于96孔板或6孔板中，分别通过碱性磷酸酶（ALP）活性检测或定量聚合酶链式反应（qPCR）评估分化情况。
注意：图3为细胞成骨分化的示例。
4. RNA 提取与质量控制
- 将步骤 2.8 的样品在冰上解冻。使用 RNA 提取试剂盒（材料表）提取 RNA。
- 用 RNA 提取试剂盒（材料表）提供的离心柱，以 100 μL 无 RNase 水洗脱 RNA。
- 通过乙醇沉淀浓缩 RNA：向 100 μL 纯化的 RNA 中加入 1 μL 糖原、10 μL 2 M pH 5.5 醋酸钠和 250 μL 预冷的 99% 乙醇。
- 将样品在 -20 °C 下孵育过夜以沉淀 RNA。在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 20 分钟，收集 RNA 沉淀。
注意：由于与糖原共沉淀，沉淀呈白色。 - 吸除上清液，并用 1 mL 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。再次在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 5 分钟，收集 RNA 沉淀。
- 去除乙醇，打开 RNA 管盖，室温放置 5–10 分钟，使 RNA 沉淀空气干燥。将 RNA 沉淀重悬于 7 μL 无 RNase 水中。
- 在建库前，使用基于芯片的毛细管电泳仪，按照制造商的说明检测 RNA 的质量和浓度。
注意：RNA 的代表性片段分布见图 4。 - 如有需要，使用商业化的纯化试剂盒提取细胞 RNA（材料表）。
5. 文库构建与质量控制
注意：由于RNA投入量较低，小RNA文库使用商用试剂盒（材料表）进行构建，并进行了相应调整。文库构建过程在预冷的冰块上进行。
- 将用于0.2 mL PCR管的加热块置于冰上预冷，然后用移液器将步骤4.6中的5 μL RNA加入放置在预冷金属块上的无RNase的0.2 mL PCR管中。
- 在0.2 mL无RNase的PCR管中，用无RNase水将3’接头稀释10倍。加入0.5 μL稀释后的接头，通过上下吹打8次与5 μL RNA混合，并短暂离心，使所有液体聚集于管底。
- 将RNA与3’接头混合物置于预热的PCR仪中，在70 °C孵育2分钟，随后将样品放回预冷金属块上。
- 向RNA与3’接头的混合物中加入1 μL连接缓冲液、0.5 μL RNase抑制剂和0.5 μL T4 RNA连接酶（缺失突变体）。通过上下吹打8次混匀，并短暂离心。
- 将PCR管置于预热的PCR仪中，在28 °C孵育1小时。
- 保持PCR管仍在PCR仪中，向样品管中加入0.5 μL终止液，通过上下吹打8次混匀，继续在28 °C孵育15分钟。
- 在0.2 mL无RNase的PCR管中，用无RNase水将5’接头稀释10倍。取0.5 μL 5’接头加入另一支无RNase的0.2 mL PCR管中，将5’接头在预热的PCR仪中70 °C加热2分钟，随后将样品置于预冷金属块上。
- 向5’接头管中加入0.5 μL 10 nM ATP和0.5 μL T4 RNA连接酶，通过上下吹打8次混匀，并短暂离心，使所有液体沉至管底。
注意：应尽可能将5’接头保持在预冷金属块上。 - 向步骤5.6所得样品中加入1.5 μL 5’接头混合物，缓慢上下吹打8次以轻柔混匀。将样品在预热的PCR仪中28 °C孵育1小时。
- 在无RNase的0.2 mL PCR管中，用无RNase水将逆转录（RT）引物稀释10倍。向步骤5.9所得样品中加入0.5 μL稀释后的RT引物，缓慢上下吹打8次以轻柔混匀，并短暂离心。
- 将样品置于预热的PCR仪中，在70 °C孵育2分钟，随后将样品放回预冷金属块上。
- 向样品中加入1 μL 5×第一链缓冲液、0.5 μL 12.5 mM dNTP混合物、0.5 μL 100 mM二硫苏糖醇（DTT）、0.5 μL RNase抑制剂和0.5 μL逆转录酶。缓慢上下吹打8次以轻柔混匀，并短暂离心。
- 将样品置于预热的PCR仪中，在50 °C孵育1小时，以获得cDNA。
- 向cDNA中加入4.25 μL超纯水、12.5 μL PCR混合液、1 μL index引物和1 μL通用引物。通过上下吹打8次混匀，并短暂离心。
- 将样品放入PCR仪，并设置程序如下：98 °C预变性30秒；进行15个循环（98 °C变性10秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸15秒）；最后72 °C延伸10分钟。
注意：构建好的文库可在-20 °C保存一周。 - 通过DNA凝胶电泳分离文库，在140 bp至160 bp区间切胶（胶回收），并按照文库构建试剂盒提供的方案从凝胶中洗脱文库。
注意：本研究中，将步骤5.15所得文库加载至商用凝胶（材料表），并根据制造商说明书，使用自动化DNA片段分选仪（材料表）纯化140 bp至160 bp范围内的文库。 - 使用基于离心柱的PCR纯化试剂盒（材料表）对步骤5.16所得文库进行浓缩和洗涤，最终用10 μL无RNase水洗脱文库。
- 取1 μL纯化后的文库上样至DNA芯片（材料表），按照制造商说明书检测文库大小。
- 将1 μL纯化文库用含0.05%吐温20的10 mM pH 8.0 Tris-HCl缓冲液稀释1000倍，使用商用文库定量试剂盒通过qPCR定量文库浓度，并以试剂盒中的DNA标准品进行校准。
- 根据测序仪的要求，等量混合各文库，并在高通量测序系统上进行测序。
注意：细胞RNA文库的构建可使用相同试剂盒，按照试剂盒的标准操作流程完成。
6. 生物信息学分析流程
注意：这是一个内部流程，此处使用的程序列在材料表中。
- 去除原始序列中的低质量读段，并移除接头序列。
- 将清洁后的读段比对至不同类型的 RNA。
- 通过允许两个错配来注释 tRNA，因为高度修饰的 tRNA 序列会导致逆转录酶频繁发生碱基错掺。
- 通过将序列比对至 miRBase v21 中的人类 miRNA 并允许零个错配来注释 miRNA。由于 miRNA 可能发生非模板指导的 3'端 A 和 U 添加，对于未能比对上的序列，将其 3'端最多截去三个 A 或 T 核苷酸后，再次比对至 miRBase v21 中的人类及其他物种 miRNA，允许零个错配。
- 通过允许一个错配，将序列注释至其他相关的小 RNA（snRNA、snoRNA、piRNA 和 Y RNA）。
- 将剩余未比对上的读段比对至长 RNA 数据集（rRNA、Rfam 中的其他 RNA 以及 mRNA），以评估降解情况。
- 将序列注释至人类基因组。
- 将序列注释至细菌基因组。
- 使用以下公式对 miRNA 表达量进行标准化：(miRNA 计数 / 所有比对到 miRNA 的总读段数) × 106。
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结果
本方案中所述方法经过优化，用于从间充质干细胞（MSC）培养物中收集细胞外RNA（exRNA），以进行下一代测序。工作流程的整体示意图见左侧的图1，相应的质量控制检查点显示在右侧。
未分化（图3A）和分化后（图3B）细胞在收集当天的细胞形态如图所示。此外，还展示了诱导7天后细胞碱性磷酸酶（ALP）活性的代表性归一化水平（图3C）。此处，ALP活性约为未诱导细胞的2.5倍。
三个T175培养瓶的汇合度为100%的MSC可获得2-5 × 10⁶个外泌体10 颗粒/mL（
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讨论
本文介绍了一种用于外泌体RNA（exRNA）下一代测序的实验方案，可实现对低起始量样本进行差异表达分析。遵循特定的细胞外囊泡（EV）和exRNA分离流程至关重要，因为即使微小的改动（例如超速离心步骤或转子类型的改变）也可能影响转录组和miRNA的水平13,14。因此，无论采用何种方法分离exRNA，在同一项实验中，所有样本均应采用相同的实验操作和生物信息学分析流程，以确保结果具有可比性。
RNA 完整性通常通过生物分析仪进行评估。然而，由于细胞外RNA（exRNA）不含全长的rRNA，其RIN值通常很低，但这并不一定反映RNA样本的质量低下。此外，exRNA的RNA浓度差异较大，且常常不准确。因此，无需通过生物分析仪评估RNA质量或进行RNA定量，而应在每次实验中使用相同体积的培养基进行后续处理。同时，将提取的RNA重悬于相同体积的重悬缓冲液中，并在建库时使用相同体积的RNA溶液。
通过将接头用量减少至标准方案...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 iNANO 的 Claus Bus 先生和 Rita Rosendahl 女士提供的技术协助。特别感谢 Daniel Otzen 博士允许我们频繁使用他的超速离心机。本研究由丹麦创新基金（MUSTER 项目）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 骨髓来源的间充质干细胞 | ATCC | PCS-500-012 | 本方案中使用的细胞购自 ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | 称为间充质干细胞生长培养基（MSC培养基） |
| 无外泌体胎牛血清 | Gibco | A2720801 | |
| exRNA收集培养基：MSCGM，但将其中的FBS替换为无外泌体FBS | |||
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 培养瓶 | Sarstedt | 833,912 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma | 806552 | |
| 超速离心机 | 贝克曼库尔特 | ||
| 带盖组件的聚碳酸酯瓶 | 贝克曼库尔特 | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | 此处使用的转子 | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | 细胞计数仪 |
| β-甘油磷酸盐 | Calbiochem | 35675 | 成骨分化培养基的组分 |
| 地塞米松 | Sigma | D4902-25MG | 成骨分化培养基的组分 |
| 2-磷酸-L-抗坏血酸 三钠盐酸 | Sigma | 49752-10G | 成骨分化培养基的组分 |
| 1α,25-二羟基维生素 D3 | Sigma | D1530-1MG | 成骨分化培养基的组分 |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 用于步骤 4.8 的 miRNA 和总 RNA 纯化试剂盒 |
| 安捷伦 RNA 6000 Pico 试剂盒 | 安捷伦科技 | 5067-1514 | 基于芯片的毛细管电泳仪及用于RNA和DNA分析的芯片 |
| 安捷伦 2100 生物分析仪 | 安捷伦科技 | G2939BA | 基于芯片的毛细管电泳仪及用于RNA和DNA分析的芯片 |
| 安捷伦高灵敏度DNA试剂盒 | 安捷伦科技 | 5067-4626 | 基于芯片的毛细管电泳仪及用于RNA和DNA分析的芯片 |
| KAPA文库定量试剂盒 | 罗氏 | KK4824 | 此处使用的文库定量试剂盒 |
| TruSeq Small RNA 文库制备试剂盒 - A组（24次反应）（A组：index 1-12） | Illumina | RS-200-0012 | 本方案中使用的小RNA文库制备试剂盒——用于步骤5 |
| Pippin Prep | Sage Science | 本方案中使用的自动DNA凝胶提取仪；也可进行手动提取 | |
| MinElute PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28004 | 步骤5.17中的PCR纯化 |
| FASTX_Toolkit | 冷泉港实验室 | 第6步中修剪低质量读段 | |
| cutadapt | 第6步中的接头去除 | ||
| Bowtie | 步骤6中干净读段的比对 | ||
| Samtools | 在第6步中构建表达谱 | ||
| Bedtools | 在第6步中建立表达谱 |
参考文献
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