方法文章

人骨髓间充质干细胞细胞外微 rna 的分离、测序和分析

DOI：

10.3791/58655

⸱

2019年3月8日

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Interdisciplinary Nanoscience Centre, Aarhus University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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该协议演示了如何从细胞培养培养基中纯化细胞外微 rna, 用于小型 rna 文库构建和下一代测序。描述了各种质量控制检查点, 以使读者了解在处理低输入样本 (如 exrna) 时的预期结果。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞外和循环 rna (exrna) 是由身体的许多细胞类型产生的, 并存在于许多体液中, 如唾液、血浆、血清、牛奶和尿液。这些 rna 的一个子集是转录后的调节剂--微 rna (mirna)。为了描述特定细胞类型产生的 mirna, 体外培养系统可用于从一个细胞子集中提取和分析 exrna。骨髓间充质干细胞的分泌因子与减轻多种疾病有关, 并作为本研究的体外模型系统。本文介绍了小 rna 的采集、纯化和细胞外 mirna 序列库的生成过程。培养基中的 exrna 与细胞 rna 的不同之处在于 rna 样本较低, 这就需要优化程序。该协议为来自培养基的小 exrna 测序提供了全面的指南, 显示了 exrna 纯化和测序过程中每个步骤的质量控制检查点。

引言

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细胞外和循环 rna (exrna) 存在于各种体液中, 并对 rnase1, 2 具有耐药性。它们的高丰度、稳定性和易用性作为诊断和预后标志物 3, 对临床评估很有吸引力。外生殖器的运输方式包括细胞外囊泡 (ev), 与脂蛋白 (如高密度脂蛋白) 的联系;高密度脂蛋白) 和核糖核酸蛋白复合物 (如与 Argonaute2 复合物)4。

exrna 的一个子集是微 rna (mirna), 它们是大约22码的小非编码 rna, 调节转录后的基因表达。前 mirna 与细胞通讯和细胞稳态调节有关。例如, hdl 将前 mir-223 传递给内皮细胞, 以抑制细胞间粘附分子 1 (icam-1) 和炎症6。有趣的是, mir-223 也是由细胞外泡从白细胞转移到肺癌细胞, 编程它们采取更具侵入性的表型 7.因此, 从各种体液和细胞培养培养基的前 mirna 转录组将大大提高我们对前 mirna 信号的理解。

小 rna 测序 (小 rna seq) 是一个强大的工具, 可用....

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方案

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注: 间充质干细胞生长介质 (msc 培养基) 如材料表所示预先制备。

1. 细胞培养

注: 人骨髓间充质干细胞可从骨髓、脂肪组织或其他来源获得 11。或者, 可以通过供应商购买 hmscs。本协议中使用的骨髓间充质干细胞来自患者的骨髓, 并从一家公司购买。

  1. 将 1 x 10 6个混合努力链解冻到包含20毫升 msc 介质的 t175 瓶中。在37°c 下用5% 的 co2 培养细胞, 每 2-3天更换一次介质, 直到80% 融合。
  2. 用 1 x pbs 的5毫升清洗细胞, 并丢弃 pbs。
  3. 通过添加0.05% 的胰蛋白酶-edta 5 毫升分离细胞, 并在37°c 孵育细胞5分钟。点击烧瓶的两侧, 方便分遣。
  4. 加入15毫升的 msc 培养基来灭活胰蛋白酶, 将细胞从表面分离, 上下移液器获得单个细胞悬浮液。
  5. 将细胞收集在一个50毫升的管中, 在 300 x克的情况下旋转 5分钟, 使细胞颗粒状。
  6. 在 msc 培养基的1毫升中重新移植细胞, 并使用血细胞计对细胞进行计数。
    注: 在 t175 瓶中80% 汇合度的初级人骨髓骨髓间充质干细胞约为 2 x

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结果

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本协议中描述的方法经过优化, 可从 msc 培养中收集 exrna, 用于下一代测序。工作流的总体方案在左图1中,相应的质量控制检查点位于右侧。

未分化 (图 3 a) 和分化 (图 3A) 细胞收集当天的形态如下所示。此外, 还显示了7天诱导的细胞 alp 活性的代表性归一化水平 (图 3c)。在这里, alp 活性大约是非诱导细胞的2.5倍。

三个 t175 瓶的融合骨髓间充质干细胞产生 2-5 x 10 (图 2

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讨论

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在这里, 我们描述了一种用于下一代 exrna 测序的协议, 该协议支持从低输入样本进行差异表达式分析。坚持电动汽车和 exRNA 分离的特定协议是很重要的, 因为即使是微小的改变 (即超离心步骤或转子类型的变化) 也会影响转录组和 mirna 水平 13,14.因此, 无论 exrna 是如何分离的, 重要的是应用相同的实验和生物信息程序的所有样本在实验中能够比较的结果。

rna 完整性通常在生物分析仪上进行评估。但是, 由于 exrna 没有全长 rRNA, 它们的 rin 值很低, 但这不一定反映低质量 rRNA 样本。此外, exrna 的 rna 浓度差异很大, 而且往往不准确。因此, 与其评估 rna 质量和量化生物分析仪上的 rna, 不如每次使用相同数量的介质进行进一步处理。此外, 重新悬挂提取的 rna 在相同体积的再悬浮缓冲液中, 并使用相同的体积进行库建设。

通过将适配器的数量减少到标准协.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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我们感谢克劳斯·布斯先生和伊纳诺的丽塔·罗森达尔女士的技术援助。特别感谢丹尼尔·奥特森博士允许我们频繁使用他的超离心机。这项研究得到了丹麦创新基金 (教育部项目) 的支持。

....

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材料

骨髓 取代水 使用的罗氏 本方案中使用的 Illumina 本方案中使用的 第 映射 在

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
来源的间充质干细胞ATCCPCS-500-012本协议中使用的细胞购自 ATCC
MSCGM BulletKitLonzaPT-3001称为间充质干细胞生长培养基（MSC 培养基）
去除外泌体的 FBSGibcoA2720801
ExRNA 收集培养基：MSCGM，但 FBS 被去除外泌体的 FBS
胰蛋白酶-EDTAGibco25200056
T175 培养瓶Sarstedt833,912
青霉素-链霉素Gibco15140122磷酸
盐缓冲盐Sigma806552
超速离心机Beckman Coulter
带盖组件的聚碳酸酯瓶Beckman库尔特355618
贝克曼 库尔特 60 型 Ti转子 此处使用的
NucleoCounterChemometecNC-3000细胞计数器
&β;-甘油磷酸酯Calbiochem35675成骨分化培养基的成分
地塞米松SigmaD4902-25MG成骨分化培养基的成分
2-磷酸-L-抗坏血酸 酸性三钠盐Sigma49752-10G成骨分化培养基的成分
1&α;，25-二羟基维生素 D3SigmaD1530-1MG成骨分化培养基的组分
miRNeasy Mini KitQiagen217004miRNA 和总 RNA 纯化试剂盒，用于步骤 4.8
Agilent RNA 6000 Pico 试剂盒Agilent Technologies5067-1514基于芯片的毛细管电泳机和芯片，用于 RNA 和 DNA 分析的芯片
Agilent 2100 生物分析仪Agilent TechnologiesG2939BA用于 RNA 和 DNA 分析的基于芯片的毛细管电泳机和芯片
安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒Agilent Technologies5067-4626用于 RNA 和 DNA 分析的基于芯片的毛细管电泳机和芯片
KAPA 文库定量试剂盒此处KK4824文库定量试剂盒
TruSeq 小 RNA 文库制备试剂盒 - 套装 A （24 次反应）（套装 A：索引 1-12）RS-200-0012小 RNA 文库制备试剂盒 - 用于步骤 5
Pippin PrepSage Science自动 DNA 凝胶提取器;也可以进行手动提取
MinElute PCR 纯化试剂盒Qiagen28004PCR 纯化在步骤 5.17
中FASTX_ToolkitCold Spring Harbor Lab在步骤 6 中修剪低质量读数
cutadapt第 6 步中的接头去除
6 步中的干净读数的Bowtie
Samtools在第 6 步中制作表达谱
Bedtools第 6 步中制作表达谱

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115(2013).
  2. Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circul....

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RNA qPCR

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