脱细胞软骨来源基质支架的制备

摘要

脱细胞软骨来源的支架可作为引导软骨修复的支架材料，并可用于再生骨软骨组织。本文详细描述了脱细胞过程，并提供了在体外环境中使用这些支架的建议。

摘要

骨软骨缺损缺乏足够的内在修复能力，无法再生出功能健全的骨和软骨组织。因此，软骨研究集中于开发再生支架。本文描述了一种完全来源于天然软骨细胞外基质的支架，其来源为马属供体。该支架的潜在应用包括制备用于软骨修复的同种异体移植物、作为骨软骨组织工程的支架，以及提供用于研究组织形成的体外模型。通过脱细胞处理可去除供体细胞，但据认为保留了多种天然的生物活性信号。与合成支架相比，使用此类天然支架的主要优势在于无需对聚合物进行额外的功能化处理即可促进骨软骨组织再生。这种来源于软骨的基质支架可用于体内和体外环境中的骨与软骨组织再生。

引言

由创伤事件引起的膝关节关节软骨缺损可导致不适，尤其会对年轻且活跃人群的生活产生重大影响^1,2,3。此外，年轻时发生的软骨损伤可能加速晚年骨关节炎的发生⁴。目前，对于广泛性膝关节骨关节炎，唯一可采用的补救疗法是关节置换手术。由于软骨是一种细胞稀少、无神经支配且无血管的组织，其再生能力极为有限。因此，人们致力于探索再生医学方法，以辅助并刺激机体原有组织的再生能力。为此，支架材料被设计并用于作为细胞载体，或作为诱导性材料，促使机体自身细胞发生分化并促进组织再生⁵。

脱细胞支架在再生医学领域已得到广泛研究⁶。该技术已取得一定成功，例如在促进皮肤⁷、腹壁结构⁸和肌腱⁹再生方面。使用脱细胞支架的优势在于其天然来源，以及能够保留具有生物活性的信号分子，这些信号分子可吸引细胞并诱导其向组织修复所需的特定谱系分化^6,10<....

方案

本实验方案所用马膝关节软骨取自非骨关节炎原因死亡的马匹。组织获取已获得马主许可，并符合机构伦理规定。

注意： 本方案描述了利用脱细胞马软骨制备支架的方法，该支架可用于诸如 体外 组织培养平台或用于 体内 再生医学策略中的植入。酶处理步骤必须按照所述的时间顺序进行。

1. 从供体（尸体）关节中获取关节软骨

1. 在收获步骤之前，准备1 L软骨清洗液，其成分为无菌磷酸盐缓冲液（PBS），并添加100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和1%（v/v）两性霉素B。
2. 在整个收获过程中需佩戴手套和实验服，因为供体可能携带病原体。
3. 获取一个完整的（尸体来源的）关节用于软骨分离。
   注意： 此时关节周围的皮肤仍保持完整。本方案中使用从马匹获得的马膝关节软骨，但也可使用其他物种的其他关节。
4. 使用手术刀和外科镊子去除目标关节区域周围的皮肤。此外，如有必要，去除多余的脂肪和肌肉组织，但不得损伤下方的关节。可选步骤：将处理好的尸体转移至生物安全柜中。
5. 进行关节切开术，即分离关节，首先通过伸展和屈曲关节来确定关节的连接位置。
6. 使用手术刀和外科镊子小心地进一步去....

结果

必须通过组织学染色以及DNA定量来确认CDM支架的脱细胞效果，以检测残留DNA的含量。脱细胞不充分可能导致不良的免疫反应，从而影响体内实验的结果^15,16,17。在本项特定的脱细胞方法中，DNA含量低于检测限，检测起始值为13.6 ± 2.3 ng/mg DNA/干重（n = 3）。采用本方案实现完全脱细胞后，所获得的支架富含II型胶原（图4C），且无细胞（图4A）和糖胺聚糖（GAGs）（图4B）。作为对照，健康马软骨经Safranin-O染色（图5A）和II型胶原染色（图5B）后展示如下。<.......

讨论

关节软骨的细胞外基质非常致密，对各种酶处理具有较强的抗性。本文所述的多步去细胞化方案能够有效克服这种抗性，成功制备去细胞化基质。为实现这一目标，该过程需持续数天。目前已有多种针对不同类型组织的去细胞化方法被提出¹⁸，本文介绍的是一种适用于软骨组织去细胞化的方案。在本方案中，必须在酶处理之后进行去污剂步骤，以彻底清除所有细胞。在使用胰蛋白酶处理的最初几个步骤中，DNA 含量已显著降低，若省略这些步骤，则无法实现充分的去细胞化¹¹。

请注意，本实验方案基于马软骨组织的脱细胞化。所用酶溶液的活性被证实足以有效去除马软骨细胞。然而，尽管不同物种间软骨基质成分具有保守性，但由于天然存在的软骨细胞数量存在差异，本方案在用于其他动物软骨的脱细胞化时可能需要进行调整¹⁹。例如，较小动物的软骨通常具有更高的细胞含量，因此可能需要更强烈的脱细胞处理过程。选择马软骨制备脱细胞支架的一个特别原因在于，马与人类的软骨在厚度、细胞密度及生化组成方面表现出明显的相似性<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
尸体关节			可从当地屠宰场或兽医中心获取作为剩余材料。
无菌磷酸盐缓冲液（PBS）
青霉素-链霉素	Gibco	15140
两性霉素B	Thermo Fischer Scientific	15290026
液氮
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红	Thermo Fischer Scientific	25200072
Tris-HCl pH 7.5
牛胰脱氧核糖核酸酶I	Sigma-Aldrich	DN25
牛胰核糖核酸酶A	Sigma-Aldrich	R6513
曲拉通X-100（辛基苯基聚乙二醇）	Sigma-Aldrich	X100
木瓜蛋白酶	Sigma-Aldrich	P3125
柠檬酸三钠二水合物	Sigma-Aldrich	S4641
海藻酸钠	Sigma-Aldrich	180947
福尔马林
CaCl2
乙醇
二甲苯
石蜡
环氧乙烷灭菌	Synergy Health, Venlo, 荷兰
来自马供体的多能基质细胞/软骨细胞			间充质干细胞和软骨细胞可从作为剩余材料的供体关节中分离，这些关节来自当地屠宰场或兽医中心。
MEM α	Thermo Fischer Scientific	22561
L-抗坏血酸-2-磷酸	Sigma-Aldrich	A8960
DMEM	Thermo Fischer Scientific	41965
热灭活牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	10735086001
成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）	R & D Systems	233-FB
DNA定量试剂盒（Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂）	Thermo Fischer Scientific	P7581
1,9-二甲基亚甲基蓝氯化锌复盐	Sigma-Aldrich	341088
冷冻干燥机	SALMENKIPP	ALPHA 1-2 LD plus
分析研磨机	IKA	A 11 basic
研钵/研杵	Haldenwanger 55/0A
滚轴培养装置	CAT	RM5
离心机（适用于50 mL离心管）	Eppendorf	5810R
胶囊（圆柱形模具）	TAAB	8 mm 平头
Superlite S UV	Lumatec	2001AV
培养箱
切片机
筛子（筛孔尺寸0.71 mm）	VWR	34111229
手术刀片
手术刀柄
小勺