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脱细胞软骨来源基质支架的制备

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DOI：

10.3791/58656

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2019年1月7日

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, University Medical Center Utrecht, The Netherlands, 2Department of Veterinary Medicine, Equine Surgery, University of Utrecht, The Netherlands

本文内容

摘要

脱细胞软骨来源的支架可作为引导软骨修复的支架材料，并可用于再生骨软骨组织。本文详细描述了脱细胞过程，并提供了在体外环境中使用这些支架的建议。

摘要

骨软骨缺损缺乏足够的内在修复能力，无法再生出功能健全的骨和软骨组织。因此，软骨研究集中于开发再生支架。本文描述了一种完全来源于天然软骨细胞外基质的支架，其来源为马属供体。该支架的潜在应用包括制备用于软骨修复的同种异体移植物、作为骨软骨组织工程的支架，以及提供用于研究组织形成的体外模型。通过脱细胞处理可去除供体细胞，但据认为保留了多种天然的生物活性信号。与合成支架相比，使用此类天然支架的主要优势在于无需对聚合物进行额外的功能化处理即可促进骨软骨组织再生。这种来源于软骨的基质支架可用于体内和体外环境中的骨与软骨组织再生。

引言

由创伤事件引起的膝关节关节软骨缺损可导致不适，尤其会对年轻且活跃人群的生活产生重大影响1,2,3。此外，年轻时发生的软骨损伤可能加速晚年骨关节炎的发生4。目前，对于广泛性膝关节骨关节炎，唯一可采用的补救疗法是关节置换手术。由于软骨是一种细胞稀少、无神经支配且无血管的组织，其再生能力极为有限。因此，人们致力于探索再生医学方法，以辅助并刺激机体原有组织的再生能力。为此，支架材料被设计并用于作为细胞载体，或作为诱导性材料，促使机体自身细胞发生分化并促进组织再生5。

脱细胞支架在再生医学领域已得到广泛研究6。该技术已取得一定成功，例如在促进皮肤7、腹壁结构8和肌腱9再生方面。使用脱细胞支架的优势在于其天然来源，以及能够保留具有生物活性的信号分子，这些信号分子可吸引细胞并诱导其向组织修复所需的特定谱系分化6,10。此外，由于细胞外基质（ECM）是一种天然生物材料，而脱细胞过程通过去除细胞成分和遗传物质可避免潜在的免疫反应，因此解决了生物相容性和生物可降解性相关的问题。

当接种间充质基质细胞时，软骨来源基质（CDM）支架在体外实验中表现出显著的软骨形成潜力11。此外，这些支架在体内异位部位还显示出通过软骨内成骨形成骨组织的潜力12。由于CDM支架能够引导骨和软骨组织的形成，因此这些支架在修复软骨缺损的同时，也可能具有修复骨软骨缺损的潜力。

本文介绍了一种改编自 Yang 的实验方案 等（2010）13 用于从马膝关节软骨制备脱细胞CDM支架。这些支架富含II型胶原蛋白，不含细胞，且在脱细胞后不含有任何糖胺聚糖（GAGs）。可利用这些支架开展体外和体内（骨）软骨缺损修复实验。

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方案

本实验方案所用马膝关节软骨取自非骨关节炎原因死亡的马匹。组织获取已获得马主许可，并符合机构伦理规定。

注意： 本方案描述了利用脱细胞马软骨制备支架的方法，该支架可用于诸如 体外 组织培养平台或用于 体内 再生医学策略中的植入。酶处理步骤必须按照所述的时间顺序进行。

1. 从供体（尸体）关节中获取关节软骨

  1. 在收获步骤之前，准备1 L软骨清洗液，其成分为无菌磷酸盐缓冲液（PBS），并添加100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和1%（v/v）两性霉素B。
  2. 在整个收获过程中需佩戴手套和实验服，因为供体可能携带病原体。
  3. 获取一个完整的（尸体来源的）关节用于软骨分离。
    注意： 此时关节周围的皮肤仍保持完整。本方案中使用从马匹获得的马膝关节软骨，但也可使用其他物种的其他关节。
  4. 使用手术刀和外科镊子去除目标关节区域周围的皮肤。此外，如有必要，去除多余的脂肪和肌肉组织，但不得损伤下方的关节。可选步骤：将处理好的尸体转移至生物安全柜中。
  5. 进行关节切开术，即分离关节，首先通过伸展和屈曲关节来确定关节的连接位置。
  6. 使用手术刀和外科镊子小心地进一步去除脂肪、肌肉和肌腱的多层组织，以暴露关节区域。
  7. 切开以进入关节腔。
    注意： 关节腔内充满滑液，在正确切开时滑液可能从腔内滴出。
  8. 继续切断维持关节连接的肌腱，彻底打开关节。
  9. 检查软骨是否存在任何肉眼可见的损伤。
    注意： 如果关节软骨表面不呈现光泽和平滑外观，或存在明显水疱、裂隙或缺损，则应弃用该软骨。
  10. 使用无菌手术刀将软骨从软骨下骨上剥离。切割至软骨下骨，以同时去除软骨的深层区域（图1）。为防止软骨干燥，应定期在其表面滴加软骨清洗液。
    注意： 此时软骨片的大小无关紧要。
  11. 将软骨片收集至含有预先配制好的软骨清洗液的50 mL离心管中（图2A）。
  12. 在收集完所有目标区域的软骨后，将软骨片在液氮中快速冷冻5分钟。
  13. 将软骨片转移至50 mL离心管中，并立即在冷冻干燥机中冷冻干燥24小时。将冷冻干燥机压力设定为约0.090 mbar，冷凝器温度为-51 °C（图2B）。
  14. 将软骨片储存于室温下的干燥环境中，直至后续使用。
    注意： 在支架形成之前，溶液和软骨无需以无菌方式制备和处理。

2. 制备脱细胞软骨颗粒

  1. 将冻干的软骨切片浸入液氮中。
  2. 直接手动或使用研磨机研磨样品。手工研磨软骨切片时，使用研钵和研杵，持续研磨约45分钟，直至完全粉碎（图 2C 和 2D）。若采用自动研磨，将研磨机调至预设速度，研磨数秒至一分钟，直至速冻的软骨切片被完全粉碎。
    注意：研磨前，用液氮预冷研钵或研磨机的研磨腔。使用研磨机时，确保所有颗粒均被充分研磨，并防止颗粒残留在研磨腔底部。
  3. 使用孔径为0.71 mm的筛网对软骨颗粒进行筛分，以去除较大碎片。
  4. 将颗粒在室温下干燥保存。

3. 使用胰蛋白酶 0.25%-EDTA 进行酶法脱细胞

  1. 配制消化液，包含0.25%含EDTA的胰蛋白酶，并添加100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和1% (v/v) 两性霉素B。将该溶液储存于4 °C。
    注意：胰蛋白酶是一种可降解软骨组织中蛋白质的蛋白酶。此酶解步骤将打开致密的软骨结构。
  2. 将粉碎的软骨颗粒装入50 mL离心管中，每管装填体积约为7.5 mL。
  3. 将软骨颗粒与配制好的消化液在37 °C下总共孵育24小时，每隔4小时更换一次消化液。
    1. 首先，向每支含有软骨颗粒的50 mL离心管中加入30 mL消化液。
    2. 然后使用涡旋振荡器或移液器重悬颗粒，确保所有颗粒均暴露于酶解溶液中。
    3. 将样品在滚轴混合仪上于37 °C孵育4小时。
    4. 为更换消化液，以3113 × g离心20分钟，使软骨颗粒沉淀，弃去上清液。
      注意：每次胰蛋白酶孵育后，上清液将逐渐变得澄清。
    5. 重复步骤3.3.1–3.3.4，直至颗粒已用消化液孵育6个4小时周期。
  4. 最后一个周期结束后，离心去除上清液，并用30 mL软骨洗涤液洗涤颗粒两次。每次洗涤之间以3113 × g离心20分钟。

4. 使用核酸酶处理进行酶法脱细胞

  1. 在去离子水中配制 pH 7.5 的 10 mM Tris-HCl 溶液。
  2. 向 Tris-HCl 缓冲液中加入 50 U/mL 脱氧核糖核酸酶和 1 U/mL 核糖核酸酶 A，制备核酸酶溶液。
    注意：此步骤旨在特异性降解脱氧核糖核酸和核糖核酸。
  3. 为去除软骨颗粒中的洗涤液（步骤 3.4），在 3,113 × g 条件下离心 20 分钟，并弃去上清液。
  4. 向软骨颗粒中加入 30 mL 核酸酶溶液，并将颗粒在溶液中充分搅拌，确保所有颗粒均与核酸酶溶液接触。
  5. 将样品置于摇床上，37 °C 孵育 4 小时。
  6. 通过在 3,113 × g 条件下离心 20 分钟去除核酸酶溶液，并弃去上清液。
  7. 用不含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶 A 的 30 mL 10 mM Tris-HCl 溶液洗涤样品。重悬颗粒后，将样品在室温下置于摇床上孵育 20 小时。

5. 去垢剂脱细胞

  1. 通过将1%（v/v）辛基苯氧基乙醇-1溶解于PBS中，制备去垢剂溶液。
  2. 将软骨颗粒以3,113 × g离心20分钟，弃去上清液，去除Tris-HCl溶液。
  3. 向软骨颗粒中加入30 mL已配制的1%去垢剂溶液。轻轻重悬软骨颗粒，避免溶液产生泡沫。
    注意：此步骤可破坏细胞膜。
  4. 将样品置于滚轴混合仪上，在室温下孵育24小时。
  5. 以3,113 × g离心20分钟，去除去垢剂溶液，并弃去上清液。
  6. 为彻底去除脱细胞溶液的所有残留物，使用30 mL软骨洗涤液对软骨颗粒进行6次洗涤，每次8小时。在室温下于滚轴混合仪上进行洗涤。
    1. 每次更换洗涤液时，将悬液以3,113 × g离心20分钟，弃去上清液，加入新鲜的软骨洗涤液。
  7. 最后一次洗涤后保留洗涤液于离心管中，并将脱细胞软骨颗粒于-80 °C保存。

6. 从脱细胞颗粒制备支架

  1. 如果颗粒储存在 -80 °C，应在制备支架前将装有软骨颗粒的密闭管置于温水中解冻。
  2. 使用小勺将软骨颗粒转移至圆柱形模具中，例如直径为 8 mm、高度为 2 cm 的塑料离心管。
  3. 将软骨颗粒放入塑料模具时，需压出所有气泡，以避免支架内部产生空腔，并将模具填充至边缘。
    注意：支架成型后，从金属模具中取出支架会更加困难，可能导致支架开裂。
  4. 将含有软骨颗粒的模具在 -20 °C 冷冻 10 分钟。
  5. 将模具中的软骨支架置于冷冻干燥机中冷冻干燥 24 小时。
  6. 冷冻干燥后，从模具中取出支架（图 3），并在 30 cm 距离下用 365 nm 的紫外光（UV）交联过夜。
  7. 若需将支架用于体外细胞培养或体内植入，可使用环氧乙烷（EtO）气体对支架进行灭菌。
    注意：环氧乙烷灭菌由外部机构完成。

7. 脱细胞支架的组织学染色表征

注意：为确保完全脱细胞化并观察软骨中残留的天然成分，在将支架用于任何实验前，应进行多种组织学染色，包括苏木精和伊红（H&E）染色以确认脱细胞效果，藏红O染色以检测残留糖胺聚糖（GAG）的存在，以及I型胶原免疫组织化学染色和II型胶原免疫组织化学染色，以区分胶原成分。

  1. 用手术刀将支架切成约3毫米厚的薄片。
    注意： 如果支架被切割成更大或更小的尺寸，则需要调整脱水循环的持续时间。
  2. 将支架嵌入一滴4%（w/v）海藻酸钠中，并加入等体积含20 mM CaCl₂的3.7%未缓冲甲醛溶液以诱导交联2.
    注意： 海藻酸盐包埋使支架切片比石蜡包埋前的洗涤步骤更坚固。如果支架已接种细胞或 体内 植入后，由于细胞分泌的细胞外基质（ECM）可增强支架的机械强度，因此无需进行海藻酸盐包埋。
  3. 通过将样品置于梯度乙醇系列中进行脱水，依次使用70%、96%、96%、100%和100%乙醇，每个浓度处理一小时，随后进行两次 1 小时的二甲苯处理循环，最后在 60 °C 下进行两次 1 小时的石蜡浸透循环。
  4. 脱水后，将样品置于模具中进行石蜡包埋，并冷却样品。
  5. 用切片机将样品切成5 μm厚的切片。
  6. 染色前，将样品置于梯度乙醇中进行复水。先用二甲苯洗涤两次，每次5分钟；随后依次用100%、95%和70%乙醇各洗涤两次，每次3分钟。最后用蒸馏水洗涤三次，每次2分钟。
    注意： 若使用海藻酸钠处理用于石蜡包埋的样本，在石蜡切片复水前，须用 10 mM 柠檬酸彻底洗去海藻酸钠。
  7. 用苏木精-伊红、番红O、I型胶原和II型胶原对样本进行染色，方法如前所述11.

8. 脱细胞支架的定量分析表征

  1. 按照先前所述方法获取支架的木瓜蛋白酶消化物11。
  2. 使用基于荧光的DNA定量试剂盒检测支架中双链DNA含量，以确认去细胞化完全。遵循试剂盒制造商提供的操作步骤。以每单位支架干重所含DNA量表示结果。
  3. 采用二甲基亚甲基蓝法测定支架中残留糖胺聚糖（GAG）的含量，方法参照先前文献11。结果以每单位DNA对应的GAG含量表示。

9. 脱细胞支架的接种

  1. 将步骤6.7中灭菌的支架切成3 mm厚的片状。
  2. 将支架分别转移至6孔板的不同孔中。
  3. 用细胞培养基重新水化支架：在支架顶部加入1 mL培养基，用移液器滴加后静置30分钟使其充分浸润。可使用软骨细胞或间充质干细胞（MSC）扩增培养基。
    注意：支架重新水化所用培养基应与后续接种细胞的培养基一致。软骨细胞扩增培养基成分为含10%热灭活胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和10 ng/mL成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）的Dulbecco改良培养基（DMEM）。间充质干细胞扩增培养基成分为含10%热灭活FBS、0.2 mM L-抗坏血酸-2-磷酸、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和10 ng/mL FGF-2的最低必需培养基α（a-MEM）。
  4. 将3 × 106个细胞重悬于100 μL培养基中，此体积适用于直径8 mm、高度3 mm的每个支架。
    注意：可使用来自不同物种的多种细胞类型进行接种。若使用软骨细胞或间充质基质细胞，应按照先前所述方法分离细胞11。若使用软骨细胞，应确保其扩增不超过P1代，以尽量减少去分化的软骨细胞数量。若使用间充质基质细胞，必须按照先前所述方法检测其多向分化潜能14。
  5. 将50 μL制备好的细胞悬液滴加至预浸润的支架表面，于37 °C孵育1小时。
  6. 小心将支架翻转，向另一面滴加剩余的50 μL细胞悬液，并于37 °C继续孵育1小时。
  7. 孵育结束后，向各孔中加入3 mL培养基，在37 °C条件下培养接种了细胞的支架。操作时应轻柔处理培养板，避免细胞脱落。
  8. 根据实验所需时间培养支架，每周更换培养基2–3次。移液时应缓慢操作，并尽量远离支架位置。
  9. 接种细胞的支架培养完成后，将支架切成两半，分别用于组织学和生物化学分析。

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结果

必须通过组织学染色以及DNA定量来确认CDM支架的脱细胞效果，以检测残留DNA的含量。脱细胞不充分可能导致不良的免疫反应，从而影响体内实验的结果15,16,17。在本项特定的脱细胞方法中，DNA含量低于检测限，检测起始值为13.6 ± 2.3 ng/mg DNA/干重（n = 3）。采用本方案实现完全脱细胞后，所获得的支架富含II型胶原（图4C），且无细胞（图4A）和糖胺聚糖（GAGs）（图4B）。作为对照，健康马软骨经Safranin-O染色（图5A）和II型胶原染色（图5B）后展示如下。<...

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讨论

关节软骨的细胞外基质非常致密，对各种酶处理具有较强的抗性。本文所述的多步去细胞化方案能够有效克服这种抗性，成功制备去细胞化基质。为实现这一目标，该过程需持续数天。目前已有多种针对不同类型组织的去细胞化方法被提出18，本文介绍的是一种适用于软骨组织去细胞化的方案。在本方案中，必须在酶处理之后进行去污剂步骤，以彻底清除所有细胞。在使用胰蛋白酶处理的最初几个步骤中，DNA 含量已显著降低，若省略这些步骤，则无法实现充分的去细胞化11。

请注意，本实验方案基于马软骨组织的脱细胞化。所用酶溶液的活性被证实足以有效去除马软骨细胞。然而，尽管不同物种间软骨基质成分具有保守性，但由于天然存在的软骨细胞数量存在差异，本方案在用于其他动物软骨的脱细胞化时可能需要进行调整19。例如，较小动物的软骨通常具有更高的细胞含量，因此可能需要更强烈的脱细胞处理过程。选择马软骨制备脱细胞支架的一个特别原因在于，马与人类的软骨在厚度、细胞密度及生化组成方面表现出明显的相似性<...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢 W. Boot 在支架制备过程中提供的帮助。K.E.M. Benders 由乌得勒支大学医学中心的 Alexandre Suerman 奖学金资助。R. Levato 和 J. Malda 分别获得荷兰关节炎基金会（资助协议编号分别为 CO-14-1-001 和 LLP-12）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
尸体关节可从当地屠宰场或兽医中心获取作为剩余材料。
无菌磷酸盐缓冲液（PBS）
青霉素-链霉素Gibco15140
两性霉素BThermo Fischer Scientific15290026
液氮
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红Thermo Fischer Scientific25200072
Tris-HCl pH 7.5
牛胰脱氧核糖核酸酶ISigma-AldrichDN25
牛胰核糖核酸酶ASigma-AldrichR6513
曲拉通X-100（辛基苯基聚乙二醇）Sigma-AldrichX100
木瓜蛋白酶Sigma-AldrichP3125
柠檬酸三钠二水合物Sigma-AldrichS4641
海藻酸钠Sigma-Aldrich180947
福尔马林
CaCl2
乙醇
二甲苯
石蜡
环氧乙烷灭菌Synergy Health, Venlo, 荷兰
来自马供体的多能基质细胞/软骨细胞间充质干细胞和软骨细胞可从作为剩余材料的供体关节中分离，这些关节来自当地屠宰场或兽医中心。
MEM αThermo Fischer Scientific22561
L-抗坏血酸-2-磷酸Sigma-AldrichA8960
DMEMThermo Fischer Scientific41965
热灭活牛血清白蛋白Sigma-Aldrich10735086001
成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）R & D Systems233-FB
DNA定量试剂盒（Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂）Thermo Fischer ScientificP7581
1,9-二甲基亚甲基蓝氯化锌复盐Sigma-Aldrich341088
冷冻干燥机SALMENKIPPALPHA 1-2 LD plus
分析研磨机IKAA 11 basic
研钵/研杵Haldenwanger 55/0A
滚轴培养装置CATRM5
离心机（适用于50 mL离心管）Eppendorf5810R
胶囊（圆柱形模具）TAAB8 mm 平头
Superlite S UVLumatec2001AV
培养箱
切片机
筛子（筛孔尺寸0.71 mm）VWR34111229
手术刀片
手术刀柄
小勺

参考文献

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