一步式冷大气等离子体处理诱导神经干细胞分化 体外

摘要

本方案旨在提供关于冷大气等离子体处理神经干细胞以及通过免疫荧光检测促进其分化的详细实验步骤。

摘要

随着物理等离子体技术的发展，冷大气等离子体（CAPs）已在去污、癌症治疗、伤口愈合、根管治疗等领域得到广泛研究， 等等。，形成了一门名为等离子体医学的新兴研究领域。作为一种包含电学、化学和生物学活性物质的混合体，冷大气等离子体（CAPs）已被证明能够促进神经干细胞的分化 体外 和 在体 并且有望成为未来治疗神经系统疾病的一种新方法。更令人振奋的消息是，利用冷大气等离子体（CAPs）可能实现神经干细胞（NSCs）向特定方向的安全、一步式定向分化，用于组织移植。本文展示了使用自制的CAP射流装置促进C17.2神经干细胞系及原代大鼠神经干细胞分化的详细实验方案，并通过倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞命运。借助免疫荧光染色技术，我们发现两种神经干细胞的分化速率均较未处理组显著加快，约75%的神经干细胞选择性地分化为神经元，且主要为成熟的胆碱能运动神经元。

引言

将神经干细胞（NSCs）定向分化为特定谱系以用于组织移植，被认为是治疗神经退行性疾病和神经创伤疾病最有前景的疗法之一¹。例如，在帕金森病（PD）治疗中，尤其需要儿茶酚胺能多巴胺能神经元。然而，传统制备可用于移植的靶细胞方法存在诸多缺陷，如化学毒性、瘢痕形成等，严重限制了NSCs在再生医学中的应用²。因此，寻找一种新颖且安全的NSC分化方法十分必要。

等离子体是继固体、液体和气体之后的第四种物质状态，占整个宇宙中物质总量的95%以上。等离子体在电学上呈中性，包含自由的正负电荷粒子及中性粒子，通常在实验室中通过高压放电产生。在过去的二十年中，随着低温常压等离子体技术的发展，等离子体在生物医学领域的应用已引起全球广泛关注。得益于该技术，可在常压环境空气中产生稳定且低温的等离子体，且不形成电弧，其中包含多种活性物质，如活性氮物种（RNS）、活性氧物种（ROS）、紫外线（UV）辐射、电子、离子和电场。³. CAPs在微生物灭活、癌症治疗、伤口愈合、皮肤病治疗、细胞增殖和细胞分化方面具有独特优势^4,5,6,

方案

1. 细胞培养与预分化

1. 神经干细胞培养与预分化
   1. 准备多聚-D-赖氨酸包被的盖玻片。将无菌盖玻片（直径 20 mm）放入 12 孔板中。使用水中的 0.1% w/v 多聚-D-赖氨酸（材料表）对盖玻片进行包被，以增强细胞在盖玻片上的黏附性，具体操作如下：
      注意：每种细胞系和应用需确定最佳条件。
      1. 在无菌条件下，用 0.1% w/v 的多聚-D-赖氨酸水溶液包被盖玻片表面，轻轻摇晃以确保盖玻片表面均匀覆盖。
      2. 在 37 °C 下孵育过夜（约 12 小时）后，移除多聚-D-赖氨酸溶液，并用 1 mL 无菌水冲洗表面 3 次。
      3. 在接种细胞前，至少干燥 30 分钟。
2. 小鼠神经干细胞 C17.2 (C17.2-NSC) 培养与预分化
   1. 将 C17.2-NSCs 在含 10% 胎牛血清 (FBS)、5% 马血清 (HS) 和 1% 青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM) 中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下，在 25 cm² 培养瓶中孵育约 2–3 天。
   2. 当细胞达到 85% 汇合度时，移除培养基，用 1 mL 磷酸盐缓冲液 (PB....

结果

每天在倒置显微镜下观察等离子体处理后的细胞形态。 图2 显示了两种细胞系在分化过程中的常规倒置相差显微镜图像。与对照组和气体流动组相比，等离子体处理组表现出更快的分化速度和更高的分化比例。

经处理后培养6天的小鼠C17.2神经干细胞（NSCs）和原代大鼠神经干细胞的免疫荧光结果分别如图3和 图4所示。与对照组相比，两种细胞系中Nestin（+，绿色）表达减少，β-Tubulin III（+，红色）表达显著增加，O4（+，绿色）表达略有上升。与对照组及纯气体流处理组相比，60秒的冷大气等离子体（CAP）处理显著促进了C17.2-NSCs向神经元谱系分化。纯气体流处理对神经干细胞.......

讨论

C17.2-NSCs 是一种永生化的小鼠新生动物小脑颗粒层来源的神经干细胞系，由 Snyder 等人建立^10,11。C17.2-NSCs 可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，广泛应用于神经科学研究¹²。在我们之前的研究中，冷大气等离子体（CAPs）能够促进 C17.2-NSCs 向神经元的分化。我们还利用原代大鼠神经干细胞进行了原理验证性研究，等离子体处理对原代大鼠神经干细胞的作用与对 C17.2-NSCs 的作用在定性上相似，均表现出更强的神经元分化能力。CAPs 作为一种新型的物理化学技术，可能成为治疗阿尔茨海默病、帕金森病（PD）、脊髓损伤等神经系统疾病的一种有前景的工具。

CAP处理为增强C17.2神经干细胞和原代大鼠神经干细胞分化提供了一步法策略 体外 处理时间短且对细胞损伤小。此外，实验结果表明，神经元的定向分化率约为75%，使等离子体处理成为未来临床组织移植中一种颇具前景的方法。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盖玻片	NEST	801008
聚-D-赖氨酸	Beyotime	P0128
DMEM 培养基	HyClone	SH30022.01B	4 ℃ 保存 °C
DMEM/F12 培养基	HyClone	SH30023.01B	4℃保存 °C
N2 补充剂	Gibco	17502048	储存于 -20 °C，并避光保护
B27添加剂	Gibco	17504044	-20 ℃保存 °C并避光保护
胎牛血清	HyClone	SH30084.03	储存于 -20 °C，避免反复冻融
供体马血清	HyClone	SH30074.03	储存于 -20 °C，避免反复冻融
青霉素/链霉素	HyClone	SV30010	4 ℃ 保存 °C
胰蛋白酶	HyClone	25300054	4 ℃ 保存 °C
PBS 溶液	HyClone	SH30256.01B	4 ℃ 保存 °C
4% 多聚甲醛	Beyotime	P0098	储存于 -20 °C
TritonX-100	Sigma	T8787
正常山羊血清封闭液	Vector Laboratories	S-1000-20	4 ℃ 保存 °C
抗巢蛋白	Beyotime	AF2215	-20℃保存 °C，避免反复冻融
抗-β-微管蛋白III	Sigma Aldrich	T2200	储存于 -20 °C，避免反复冻融
抗O4	R&D Systems	MAB1326	储存于 -20 °C，避免反复冻融
抗-NF200	Sigma		储存于 -20 °C，避免反复冻融
抗ChAT	Sigma		储存于 -20 °C，避免反复冻融
抗 LHX3	Sigma		储存于 -20 °C，避免反复冻融
抗GABA	Sigma		-20 ℃保存 °C，避免反复冻融
抗5-羟色胺	Abcam，马萨诸塞州剑桥市		储存于 -20 °C，避免反复冻融
抗TH	Abcam，马萨诸塞州剑桥市		储存于 -20 °C，避免反复冻融
免疫染色一抗稀释缓冲液	Beyotime	P0103	4 ℃ 下保存 °C
Cy3标记的山羊抗兔IgG	Beyotime	A0516	储存于 -20 °C，并避光保护
Alexa Fluor 488 标记山羊	Beyotime	A0428	储存于 -20 °C并避光保护
抗小鼠 IgG
12孔板	corning	3512
25 cm² 培养瓶	corning	430639
Hoechst 33258	Beyotime	C1018	储存于 -20 °C并避光保护
封片剂	Beyotime	P0128	储存于 -20 °C，并避光保护
光学显微镜	南京江南永新光学有限公司	XD-202
荧光显微镜技术	尼康	80i
高 – 电压功率放大器	定向能	PVX-4110
直流电源	Spellman	SL1200
函数发生器	Aligent	33521A
示波器	Tektronix	DPO3034
高压探头	Tektronix	P6015A