一步式冷大气等离子体处理诱导神经干细胞分化 体外

摘要

本方案旨在提供关于冷大气等离子体处理神经干细胞以及通过免疫荧光检测促进其分化的详细实验步骤。

摘要

随着物理等离子体技术的发展，冷大气等离子体（CAPs）已在去污、癌症治疗、伤口愈合、根管治疗等领域得到广泛研究， 等等。，形成了一门名为等离子体医学的新兴研究领域。作为一种包含电学、化学和生物学活性物质的混合体，冷大气等离子体（CAPs）已被证明能够促进神经干细胞的分化 体外 和 在体 并且有望成为未来治疗神经系统疾病的一种新方法。更令人振奋的消息是，利用冷大气等离子体（CAPs）可能实现神经干细胞（NSCs）向特定方向的安全、一步式定向分化，用于组织移植。本文展示了使用自制的CAP射流装置促进C17.2神经干细胞系及原代大鼠神经干细胞分化的详细实验方案，并通过倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞命运。借助免疫荧光染色技术，我们发现两种神经干细胞的分化速率均较未处理组显著加快，约75%的神经干细胞选择性地分化为神经元，且主要为成熟的胆碱能运动神经元。

引言

将神经干细胞（NSCs）定向分化为特定谱系以用于组织移植，被认为是治疗神经退行性疾病和神经创伤疾病最有前景的疗法之一¹。例如，在帕金森病（PD）治疗中，尤其需要儿茶酚胺能多巴胺能神经元。然而，传统制备可用于移植的靶细胞方法存在诸多缺陷，如化学毒性、瘢痕形成等，严重限制了NSCs在再生医学中的应用²。因此，寻找一种新颖且安全的NSC分化方法十分必要。

等离子体是继固体、液体和气体之后的第四种物质状态，占整个宇宙中物质总量的95%以上。等离子体在电学上呈中性，包含自由的正负电荷粒子及中性粒子，通常在实验室中通过高压放电产生。在过去的二十年中，随着低温常压等离子体技术的发展，等离子体在生物医学领域的应用已引起全球广泛关注。得益于该技术，可在常压环境空气中产生稳定且低温的等离子体，且不形成电弧，其中包含多种活性物质，如活性氮物种（RNS）、活性氧物种（ROS）、紫外线（UV）辐射、电子、离子和电场。³. CAPs在微生物灭活、癌症治疗、伤口愈合、皮肤病治疗、细胞增殖和细胞分化方面具有独特优势^4,5,6,7在之前的研究中，我们证实了冷大气等离子体射流能够促进小鼠神经干细胞C17.2（C17.2-NSCs）和原代大鼠神经干细胞的分化，展现出作为神经干细胞定向分化有力工具的巨大潜力⁸尽管冷大气等离子体（CAP）促进神经干细胞（NSC）分化的机制尚未完全阐明，但已有研究证实CAP产生的NO在此过程中起关键作用。本研究旨在提供一种利用常压氦氧等离子体射流处理神经干细胞的详细实验方案 体外细胞制备与预处理、倒置显微镜下的形态学观察，以及免疫荧光染色的荧光显微镜观察。

方案

1. 细胞培养与预分化

1. 神经干细胞培养与预分化
   1. 准备多聚-D-赖氨酸包被的盖玻片。将无菌盖玻片（直径 20 mm）放入 12 孔板中。使用水中的 0.1% w/v 多聚-D-赖氨酸（材料表）对盖玻片进行包被，以增强细胞在盖玻片上的黏附性，具体操作如下：
      注意：每种细胞系和应用需确定最佳条件。
      1. 在无菌条件下，用 0.1% w/v 的多聚-D-赖氨酸水溶液包被盖玻片表面，轻轻摇晃以确保盖玻片表面均匀覆盖。
      2. 在 37 °C 下孵育过夜（约 12 小时）后，移除多聚-D-赖氨酸溶液，并用 1 mL 无菌水冲洗表面 3 次。
      3. 在接种细胞前，至少干燥 30 分钟。
2. 小鼠神经干细胞 C17.2 (C17.2-NSC) 培养与预分化
   1. 将 C17.2-NSCs 在含 10% 胎牛血清 (FBS)、5% 马血清 (HS) 和 1% 青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM) 中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下，在 25 cm² 培养瓶中孵育约 2–3 天。
   2. 当细胞达到 85% 汇合度时，移除培养基，用 1 mL 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤细胞，然后向培养瓶中加入 1 mL 新鲜胰蛋白酶 (0.25%)。静置 1 分钟后，向培养瓶中加入 1 mL 培养基，并反复吹打数次，以确保形成单细胞悬液。
   3. 使用血细胞计数板测定悬液中的细胞密度。计算所需细胞悬液体积，使最终细胞浓度为 2 × 10⁴ 个细胞/mL。
   4. 将 C17.2-NSCs 以每孔约 2 × 10⁴ 个细胞的密度接种到 12 孔板的包被盖玻片上。在显微镜下检查细胞密度。
      注意：为获得更佳结果，应在免疫荧光实验前确定最佳细胞密度。
   5. 将细胞置于 37 °C 细胞培养箱中孵育 12 小时，以促进细胞贴壁。
   6. 贴壁后，用 1 mL PBS 洗涤细胞 2 次，然后使用含 1% N2 添加剂的 DMEM/F12 分化培养基培养 48 小时，再进行等离子体处理。
3. 原代大鼠神经干细胞培养与预分化
   1. 将原代大鼠 NSC 悬液以 5 × 10⁵ 个细胞的密度接种于未包被的 T25 培养瓶中，在大鼠 NSC 生长培养基中进行培养。
      注意：原代大鼠 NSCs 的分离依据 Xie et al.⁹ 的方案进行。
   2. 在倒置显微镜下观察神经球的形成情况。确保神经球形态呈透明、球形的多细胞复合体。
   3. 当神经球直径达到 3 mm 或更大时，将神经球悬液转移至 15 mL 无菌离心管中，静置使神经球自然沉降。
   4. 小心移除上清液，保留神经球于最小体积的培养基中。
   5. 用 5 mL PBS 冲洗神经球 1 次，静置使神经球沉降，然后移除上清液，保留少量 PBS。
   6. 加入适量分化培养基，调整细胞密度至每毫升约 12–15 个神经球。原代大鼠 NSCs 的分化培养基成分为 DMEM/F12、2% B27 和 1% FBS。
   7. 将 1 mL 神经球悬液接种至 12 孔板中每个包被的盖玻片上。
      注意：轻轻摇动培养板，确保神经球均匀分布。此步骤对获得良好的免疫荧光结果至关重要。
   8. 将培养板放入培养箱中，在等离子体处理前预分化 24 小时。

2. 等离子体射流的制备

1. 选择一根内径为 2 mm、外径为 4 mm 的半开口石英管。将一根直径为 2 mm 的高压导线插入该石英管中。
2. 将带有高压导线的石英管插入一支 5 mL 注射器中，并使用固定装置将其安装在注射器中心位置。调节石英管封闭端与注射器尖端之间的距离为 1 cm。
3. 将一段长 1 m、内径为 12 mm 的硅橡胶管连接到注射器的开口端，然后依次连接至流量计和气体阀门。

3. 射流的获取

1. 按照图1所示连接电路。将电源的输出线连接至等离子体射流装置，然后将高压探头的探针连接至输出线以检测电压。将高压探头的另一端连接至示波器，以记录输出电压信息。检查整个电路，确保电源、示波器和高压探头均已接地。
2. 检查气体管路。确认气体管路已连接至等离子体射流装置，然后打开氦气（体积分数99.999%）和氧气（体积分数99.999%）的气阀，并将气体流速设置为1 L:0.01 L/min（He:O₂）。
   注意：首次开启电源前，应让气体持续流动数分钟。
3. 将脉冲幅值、频率和脉冲宽度分别设置为8 kV、8 kHz和1600 ns。再次检查电路，然后打开输出按钮以产生等离子体射流。
   警告：切勿在任何情况下触碰高压导线。

4. 神经干细胞的等离子体处理

1. 将注射器喷嘴与细胞孔板孔之间的距离设置为 15 mm。
   注意：该距离是从放置 12 孔板的平台底部开始测量。
2. 从培养箱中取出 12 孔板，将预分化细胞的培养基更换为 800 µL 新鲜的分化培养基。
3. 将细胞分为三组：未处理对照组、60 秒 He 和 O₂ (1%) 气体流动处理组，以及 60 秒等离子体处理组。
   注意：在处理条件下无明显液体损失。
4. 将 12 孔板置于等离子体射流下方，确保注射器喷嘴固定在每个孔的中心位置，并对步骤 4.3 中提到的不同组别进行相应处理。
   注意：在实验过程中，未处理对照组保持在室温下的分化培养基中，以确保处理条件的一致性。He 和 O₂ (1%) 气体流动处理组仅接受 He 与 O₂ (1%) 气体流动处理，不产生等离子体。所有处理均应设置三个重复。

5. 神经干细胞分化

1. 处理后，移除原有培养基，向每孔加入 1 mL 新的分化培养基。
2. 将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养 6 天，每隔一天更换一次培养基。
3. 每天在倒置相差显微镜下观察各组细胞的分化情况，随机选取至少 12 个视野拍照，记录形态学变化。

6. 免疫荧光染色

1. 洗涤
   1. 从细胞培养箱中取出样品，通过抽吸去除培养基，用 1 mL PBS 轻柔洗涤细胞 1 次。
      注意：细胞分化后容易脱落。为避免冲走细胞，应沿培养孔壁缓慢加入 PBS。
2. 固定
   1. 在室温下用 500 µL 4% 多聚甲醛固定细胞 20 分钟。固定后，用 1 mL PBS 轻柔洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟，以去除残留的 4% 多聚甲醛。
      注意：细胞固定的最适时间点需根据细胞类型确定。固定后，沿培养孔壁加入 1 mL PBS，将样品置于实验台静置 5 分钟。请勿使用实验室摇床，以尽量减少细胞脱落。
3. 通透处理
   1. 在室温下用含 0.2% TritonX-100 的 PBS 处理样品 10 分钟进行通透。通透后，用 1 mL PBS 轻柔洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
      注意：细胞通透的最适时间点需根据细胞类型确定。通透后，沿培养孔壁加入 1 mL PBS，将样品置于实验台静置 5 分钟。请勿使用实验室摇床，以尽量减少细胞脱落。
4. 封闭
   1. 向每个样品中加入 1 mL 含 10% 山羊血清的 PBS，室温静置 1 小时，以阻断非特异性结合。
      注意：请勿使用实验室摇床，以防细胞从载玻片上脱落。此步骤无需洗涤。
5. 一抗孵育
   1. 使用一抗稀释缓冲液稀释一抗。
      注意：为获得最佳结果，一抗的最终稀释比例需通过预实验确定。抗 Nestin（未分化干细胞）、抗 β-Tubulin III（神经元）、抗 O4（少突胶质细胞）、抗 NF200（成熟神经元）、抗 ChAT（胆碱能神经元）、抗 LHX3（运动神经元）、抗 GABA（GABA 能神经元）、抗 5-羟色胺（5-羟色胺能神经元）和抗 TH（多巴胺能神经元）的一抗稀释比例分别为 1:80、1:200、1:100、1:100、1:100、1:200、1:100、1:200 和 1:100。
   2. 向不同样品中各加入 300 µL 稀释后的一抗溶液。
   3. 将细胞样品在 4 °C 下孵育过夜。
      注意：建议在 4 °C 下孵育一抗，以降低背景信号和非特异性染色。
   4. 去除一抗溶液，并用 1 mL PBS 轻柔洗涤细胞 3 次。
6. 二抗孵育
   1. 使用含 3% 山羊血清的 PBS 稀释 Cy3 标记或 Alexa Fluor 488 标记的二抗。
      注意：为获得最佳结果，二抗的最终稀释比例需通过预实验确定。
   2. 向各样品中加入 300 µL 对应的二抗溶液以检测相应的一抗。
      注意：后续所有步骤均需避光操作，以防荧光淬灭。
   3. 将细胞样品在室温下避光孵育 2 小时。
   4. 去除二抗溶液，在室温下用 1 mL PBS 轻柔洗涤细胞 10 分钟。
7. 细胞核染色
   1. 加入 500 µL Hoechst 33258 工作液，完全浸没细胞样品。
   2. 在室温下避光孵育 8 分钟，以标记细胞核。
   3. 在避光条件下，用 1 mL PBS 轻柔洗涤细胞 3 次，每次 10 分钟。
      注意：为尽量减少细胞脱落，最佳洗涤条件需通过实验经验确定。
8. 封片
   1. 在载玻片中央滴加一滴封片剂。
   2. 用镊子取出盖玻片（带样品），小心地将样品面朝下置于封片剂上，避免产生气泡。
   3. 用吸水纸吸除多余的封片剂。
9. 荧光显微镜观察
   1. 使用配备 Hoechst 33258、Alexa Fluor 488 和 Cy3 滤光片的荧光显微镜观察样品。对每个样品随机选取至少 8–12 个视野，并用相机记录图像。

结果

CAP处理后，每天在倒置显微镜下观察细胞形态。 图2 展示了两种细胞系细胞分化的普通倒置相差显微镜图像。与对照组和气体流动组相比，等离子体处理组表现出更快的分化速率和更高的分化比例。

经处理后培养6天的C17.2-NSCs和原代大鼠NSCs的免疫荧光结果分别如图3和 图4所示。与对照组相比，两种细胞系中Nestin（+，绿色）表达减少，β-Tubulin III（+，红色）显著增加，O4（+，绿色）略有增加。与对照组及纯气体流动处理组相比，60秒CAP处理显著促进了C17.2-NSCs向神经元谱系分化。纯气体流动对NSC分化无明显影响。

讨论

C17.2-NSCs 是一种永生化的小鼠新生动物小脑颗粒层来源的神经干细胞系，由 Snyder 等人建立^10,11。C17.2-NSCs 可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，广泛应用于神经科学研究¹²。在我们之前的研究中，冷大气等离子体（CAPs）能够促进 C17.2-NSCs 向神经元的分化。我们还利用原代大鼠神经干细胞进行了原理验证性研究，等离子体处理对原代大鼠神经干细胞的作用与对 C17.2-NSCs 的作用在定性上相似，均表现出更强的神经元分化能力。CAPs 作为一种新型的物理化学技术，可能成为治疗阿尔茨海默病、帕金森病（PD）、脊髓损伤等神经系统疾病的一种有前景的工具。

CAP处理为增强C17.2神经干细胞和原代大鼠神经干细胞分化提供了一步法策略 体外 处理时间短且对细胞损伤小。此外，实验结果表明，神经元的定向分化率约为75%，使等离子体处理成为未来临床组织移植中一种颇具前景的方法。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盖玻片	NEST	801008
聚-D-赖氨酸	Beyotime	P0128
DMEM 培养基	HyClone	SH30022.01B	4 ℃ 保存 °C
DMEM/F12 培养基	HyClone	SH30023.01B	4℃保存 °C
N2 补充剂	Gibco	17502048	储存于 -20 °C，并避光保护
B27添加剂	Gibco	17504044	-20 ℃保存 °C并避光保护
胎牛血清	HyClone	SH30084.03	储存于 -20 °C，避免反复冻融
供体马血清	HyClone	SH30074.03	储存于 -20 °C，避免反复冻融
青霉素/链霉素	HyClone	SV30010	4 ℃ 保存 °C
胰蛋白酶	HyClone	25300054	4 ℃ 保存 °C
PBS 溶液	HyClone	SH30256.01B	4 ℃ 保存 °C
4% 多聚甲醛	Beyotime	P0098	储存于 -20 °C
TritonX-100	Sigma	T8787
正常山羊血清封闭液	Vector Laboratories	S-1000-20	4 ℃ 保存 °C
抗巢蛋白	Beyotime	AF2215	-20℃保存 °C，避免反复冻融
抗-β-微管蛋白III	Sigma Aldrich	T2200	储存于 -20 °C，避免反复冻融
抗O4	R&D Systems	MAB1326	储存于 -20 °C，避免反复冻融
抗-NF200	Sigma		储存于 -20 °C，避免反复冻融
抗ChAT	Sigma		储存于 -20 °C，避免反复冻融
抗 LHX3	Sigma		储存于 -20 °C，避免反复冻融
抗GABA	Sigma		-20 ℃保存 °C，避免反复冻融
抗5-羟色胺	Abcam，马萨诸塞州剑桥市		储存于 -20 °C，避免反复冻融
抗TH	Abcam，马萨诸塞州剑桥市		储存于 -20 °C，避免反复冻融
免疫染色一抗稀释缓冲液	Beyotime	P0103	4 ℃ 下保存 °C
Cy3标记的山羊抗兔IgG	Beyotime	A0516	储存于 -20 °C，并避光保护
Alexa Fluor 488 标记山羊	Beyotime	A0428	储存于 -20 °C并避光保护
抗小鼠 IgG
12孔板	corning	3512
25 cm² 培养瓶	corning	430639
Hoechst 33258	Beyotime	C1018	储存于 -20 °C并避光保护
封片剂	Beyotime	P0128	储存于 -20 °C，并避光保护
光学显微镜	南京江南永新光学有限公司	XD-202
荧光显微镜技术	尼康	80i
高 – 电压功率放大器	定向能	PVX-4110
直流电源	Spellman	SL1200
函数发生器	Aligent	33521A
示波器	Tektronix	DPO3034
高压探头	Tektronix	P6015A