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利用不连续密度梯度按荚膜含量分离细菌

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DOI：

10.3791/58679

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2019年1月7日

 ,  ,  ,  , 
1Wellcome Sanger Institute, Wellcome Genome Campus, 2Department of Medicine, University of Cambridge

本文内容

摘要

我们展示了利用不连续密度梯度根据细菌荚膜产生情况分离细菌群体的方法。该方法可用于比较不同培养物之间的荚膜含量、分离具有特定荚膜表型的突变株，或鉴定荚膜调控因子。本文描述了该检测方法的优化及操作流程。

摘要

荚膜是多种细菌的关键毒力因子，介导免疫逃逸并抵抗各种物理应激。尽管已有多种方法可用于定量和比较不同菌株或突变株之间的荚膜产量，但目前尚无广泛应用的方法可根据细菌产生荚膜的多少对其进行分选。我们开发了一种利用不连续密度梯度按荚膜含量分离细菌的方法。该方法可用于在不同培养物之间半定量比较荚膜含量、分离荚膜产量改变的突变株，以及从复杂样本中纯化产荚膜细菌。该方法还可与转座子插入测序技术联用，以鉴定参与荚膜调控的基因。本文详细演示了该方法的操作流程，包括如何为新的细菌种类或菌株优化梯度条件，以及如何构建和运行密度梯度。

引言

许多细菌种类会产生多糖荚膜，这种结构可保护细菌细胞免受各种物理应激以及免疫系统的识别和杀伤。Klebsiella pneumoniae 的感染必须依赖荚膜的产生1,2。K. pneumoniae 的荚膜可介导对抗抗菌肽的能力、抵抗补体介导的杀伤作用、阻止吞噬作用，并抑制先天免疫反应3。荚膜的过量产生与毒力增强以及社区获得性（而非医院内）感染相关4。

有多种定量和定性检测方法可用于研究荚膜的产生。 克雷伯菌 物种，这些包括弦试验5，其中用牙签触碰菌落后向上提起，测量所产生的菌丝长度，并进行黏稠度测定6，包括对培养物进行缓慢离心，随后测定上清液的光密度。这些方法操作简便、快速，但在用于经典菌株时灵敏度不足 克雷伯菌 菌株而非荚膜过表达菌株。另一种荚膜定量方法是尿糖醛酸测定法，该方法在技术上具有挑战性，且需要使用浓硫酸。1最后，可通过显微镜直接观察到荚膜（图1A在这些方法中，只有显微镜技术能够使用户观察到单一群体中不同的荚膜状态，且这些方法均无法实现荚膜菌与无荚膜菌的物理分离。

基于密度的梯度离心分离技术在细胞生物学中常用于纯化不同的真核细胞类型7，但在微生物学研究中却很少被采用。针对肺炎克雷伯菌（Klebsiella）的黏滞度检测方法基于以下观察：具有高度荚膜的细菌在离心过程中沉淀所需时间更长，我们推测这可能是由于有荚膜细胞的整体密度较低所致。本文所展示的方法旨在通过密度梯度离心，根据荚膜含量对K. pneumoniae菌群进行物理分离（图1）。该方法已成功应用于肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae），表明其同样适用于其他细菌种类。将饱和转座子突变文库与转座子插入测序技术结合进行密度梯度分离（density-TraDISort），已被用于鉴定参与荚膜合成与调控的相关基因8。类似地，该方法也可与单个菌落的随机引物聚合酶链式反应（PCR）联用，以分离无荚膜的K. pneumoniae突变株。此外，该方法还可用于快速比较不同菌群或不同条件下荚膜的产生情况，或从复杂样本中纯化有荚膜的细菌（图1B）。最后，该方法还可用于检测其他影响细胞密度的表型，例如细胞大小或聚集状态。

本文展示了如何优化新细菌物种或菌株的实验流程，并演示了构建和运行不连续密度梯度以分离高荚膜化、荚膜化和无荚膜细菌的方法。

方案

注意：在培养和处理样品时，务必遵守针对细菌菌株的任何适用风险评估。请注意，一次性设置过多梯度可能导致肌肉骨骼疾病，因为缓慢移液会对关节造成压力。应合理规划工作并采取预防措施以避免受伤。

1. 细菌菌株或突变文库的制备

  1. 将待测菌株划线接种于合适的琼脂平板上。这些平板作为实验的菌种保存平板。
    1. 在所需温度下将平板孵育过夜，以获得单菌落。本实验中, 培养 K. pneumoniae （NTUH-K2044 和 ATCC43816 菌株）在 37 °C 的 Luria 肉汤（LB）琼脂培养基上， S. pneumoniae （23F 野生型和 23F Δ每秒计数（cps）在37 °C的湿润蜡烛罐中，于血琼脂上培养。
  2. 从保存平板（步骤1.1）中挑取单个菌落，使用无菌接种环或无菌牙签接种于10 mL合适的液体培养基中。若用于随机突变体文库的筛选，则取10 µL随机突变体文库原液（TraDIS文库）接种至液体培养基中。
    1. 孵育 K. pneumoniae 在37 °C下于低盐LB培养基中振荡培养菌株， S. pneumoniae 在37 °C静置条件下，于脑心浸液（BHI）培养基中培养菌株。
    2. 将过夜培养物转移至15 mL离心管中，使用台式离心机在3,200 × g条件下离心10分钟，转子为摆动桶式，配备15 mL离心管插件及防气溶胶密封盖。
    3. 弃去上清液，将沉淀重悬于 2 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
      注意： 弃去上清液 通过 通过实验室适当的液体生物废弃物处理途径处置。离心和重悬步骤（1.2.2 和 1.2.3）的目的是浓缩细菌，以便在梯度中易于观察。如有需要，细菌培养物可直接上样至梯度。荚膜较厚的菌株可能无法形成紧密的沉淀。若发生此情况，应尽可能去除上清液，但不得移除任何细菌细胞，然后加入 1×PBS 至终体积 5 mL 并重悬沉淀。随后继续执行步骤 1.2.5。
    4. 对于非黏液型菌株，进入步骤2。
    5. 按照步骤1.2.2所述离心各管。
    6. 弃去上清液，将沉淀重悬于2 mL 1×PBS中。细胞现可直接使用。
      注意： 细菌细胞悬液的密度并非关键，但需足够浓以在梯度中可见。最低OD600 建议在600 nm处的光密度（optical density at 600 nm）为4。

2. 梯度稀释液的制备与微型梯度试验

  1. 制备梯度稀释液。
    注意： 实现良好分离效果所需的密度梯度介质（例如，Percoll）的确切浓度会因所用细菌菌株和培养条件的不同而有所差异。应首先进行小规模梯度测试，以确定可获得最佳分离效果的浓度。这些测试包括在2 mL离心管中加入500 µL单一稀释度的溶液。如果后续需要从梯度中提取细菌并进行传代培养以用于下游实验，则这些步骤应在无菌条件下操作。
    1. 将密度梯度介质与1×PBS混合，配制密度梯度稀释液。配制20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%的稀释液（例如，2 mL密度梯度介质加8 mL 1×PBS = 10 mL的20%密度梯度介质）。
    2. 将20%梯度稀释液各500 µL分装至2 mL离心管中，每种待测菌株对应一管（例如，4种菌株 = 4管，每管含500 µL 20%梯度稀释液）。
    3. 对剩余的梯度稀释液重复步骤2.1.2。
  2. 将细菌加入梯度中。
    1. 按照以下步骤，将步骤1.2.3和1.2.6中制备的100 µL细菌细胞加至每个梯度稀释液的顶部。
      1. 使用200 µL移液器吸取100 µL细胞，将移液器吸头置于离心管侧壁，刚好位于微型梯度弯月面下方。
      2. 极其缓慢地将细菌细胞加入梯度表面，使其在梯度顶部形成一层，避免界面处发生混合。
      3. 对所有待测菌株重复步骤2.2.1.1–2.2.1.2。
    2. 使用带有防气溶胶盖的固定角转子，在微量离心机中以8,000 × g 离心10分钟。
    3. 离心后，将离心管转移至试管架中，观察能够使细胞刚好保留在梯度层上方所需的最小梯度稀释度。
    4. 如果结果不明确，应在步骤2.1.1确定的浓度上下各增加5%的密度梯度介质稀释度重新进行小规模梯度测试（例如，若30%浓度的结果不明确，则应测试25%和35%的稀释度）。
      注意： 单一密度梯度介质稀释度下的典型结果见图2A。
    5. 根据步骤2.2.3–2.2.4的结果，确定用于大规模不连续梯度分离细胞的最佳梯度稀释度。

3. 主实验用细胞的制备

  1. 按照步骤1.2所述方法，接种10 mL合适的液体培养基，制备新鲜的过夜培养物。
    1. 按照步骤1.2.1所述条件，将培养物在适当条件下过夜培养。
    2. 按照步骤1.2.2所述方法，收集过夜培养物的菌体沉淀。
  2. 按照步骤1.2.3所述方法洗涤细胞。
  3. 弃去上清液，并将沉淀重悬于1 mL的1×PBS中。如果菌株具有黏液状表型且不易形成沉淀，则可将沉淀重悬于最多2 mL的PBS或残留培养基中。此时细胞已准备好用于后续实验。

4. 不连续密度梯度的制备

注意：步骤 7 中描述了使用移液管从底部（浓度最高）到顶部（浓度最低）制备梯度的另一种方法。

  1. 用移液器将1 mL最稀释的密度梯度稀释液加入到一个5 mL聚丙烯圆底管中，形成梯度的最上层（即最稀释层）。
    注意：    后续将使用针头从下方逐层加入浓度更高的梯度稀释液，以避免破坏各层结构。建议使用至少两层、最多三层、每层1 mL的梯度液，以实现良好的细菌分离效果并便于观察。
    1. 使用带1.5英寸针头的1 mL一次性注射器，吸取1 mL下一个浓度较高的密度梯度培养基稀释液至注射器中。注意避免吸入空气，因为气泡可能破坏梯度层。
    2. 将针头末端置于含有第一层的试管底部。缓慢吸取注射器内容物，以避免混合界面。
      注意：随着浓度更高的梯度稀释液的加入，两层稀释液之间的界面将逐渐上升。可通过将试管靠近光源或窗外观察界面情况。若未观察到清晰的界面，则弃去该梯度液并重新制备。
      1. 非常轻柔地将针头从梯度液中取出，以免扰动不同梯度稀释液之间的界面。将试管放置于合适的试管架中，保持直立。
    3. 若使用三种不同浓度的稀释液，请重复步骤4.1.1–4.1.2.1，使最浓的稀释液位于底部。若梯度构建成功，则应出现三层清晰分明的液层，各层之间无混合现象。

5. 将制备好的细胞加入梯度液并通过离心进行分离

  1. 将步骤 3.3 中制备的 600 µL 细胞缓慢加入离心管中梯度液的上层，注意不要混匀界面，具体操作如步骤 2.2 所述。
  2. 将试管放入试管适配器中，并称量适配器与试管的总重量，以确保配平。
    1. 将试管适配器放入台式离心机的固定角转子中。在3,000 x g条件下离心30分钟 g.
    2. 离心后，小心取出离心管，放入合适的试管架中，并对结果进行拍照记录。
  3. 按照步骤6回收用于尿糖醛酸定量或DNA提取的细菌组分。
    1. 若无需进行后续应用，则处理掉样品/梯度溶液 通过 实验室中适当的液态生物废弃物处理途径
      注意： 对新物种/菌株的细菌进行分离验证非常重要。应通过显微镜检查、糖醛酸测定（步骤8）或其他合适的定量测定方法检测密度梯度中的各个组分，以确认每种组分的荚膜表型。如果分离目的是基于聚集状态或细胞大小，则应使用独立且适当的检测方法。

6. 回收样品组分及可选的扩增培养步骤

  1. 通过移除并丢弃顶部稀释层的液体来回收梯度中的组分，如果该层中不存在细菌组分，则无需处理。
    1. 使用P200移液器去除顶部组分，将移液器吸头轻轻穿过梯度至目标组分处，吸取该组分。将收集的组分转移至1.5 mL离心管中，并做好相应标记。
    2. 继续使用P200移液器回收后续组分时，将吸头轻柔地插入梯度中至目标组分位置，将组分转移至新的1.5 mL离心管中。当获取位于梯度下部的组分时，需去除多余的梯度介质。
    3. 若需从细胞数量极少的组分中提取DNA（例如用于密度-TraDISort），可通过执行第6.2步的可选扩增培养方案对组分进行亚培养，以获得更多细胞。
      注意：由于组分是从上至下依次移取的，因此在顶部梯度中的细胞可能会少量带入下方组分中。为尽量减少此类交叉污染，操作时应格外小心避免扰动梯度，可使用细针头吸取下层组分，并在可能因交叉污染影响结果的情况下对极低丰度样本进行再次纯化。
  2. 将步骤6.1.1–6.1.2中回收的低丰度组分中的细胞转移至5 mL合适的液体培养基中。置于37 °C培养箱中培养2小时。
    1. 培养2小时后，或当样品OD600达到1时，将培养物转移至15 mL离心管中。在配备摆动转子和防气溶胶密封盖的离心机中，以3,200 x g离心10分钟，弃去上清液。
    2. 用1 mL 1x PBS重悬细胞沉淀。
  3. 在5 mL聚丙烯离心管中制备新鲜的单一浓度密度梯度。所用梯度浓度应略高于原始梯度中目标组分所在位置的浓度（例如，对于图2D所示ΔslyA突变株的纯化，应使用15%密度梯度介质）。
    注意：    此再纯化步骤为可选步骤。
    1. 将细胞加至梯度顶部，并按照步骤2.2和5.1所述条件进行离心。
    2. 从离心机中取出离心管并放入适当的支架中。拍摄梯度图像，并按照6.1–6.1.2所述方法回收目标组分用于DNA提取。
      注意：样品现已准备好进行DNA提取或其他下游应用。

7. 使用移液器从底部（浓度最高）到顶部（浓度最低）制备梯度的替代方法

  1. 使用步骤 2.2.3 中确定的梯度稀释液。用 1,000 µL 移液器将 1 mL 最浓的梯度稀释液加入一个 5 mL 离心管中。
    1. 使用 200 µL 移液器，将下一种较浓梯度稀释液 200 µL 极缓慢地加至管中液层的顶部，避免混合界面。再加入另外 200 µL，然后最后加入 600 µL。分多次加入较小体积有助于更好地控制移液速度，防止界面混合。如果界面发生混合，则弃去重做。
    2. 如果使用三种稀释液，则对第三种密度最低的梯度浓度重复步骤 7.1.1。此时离心管中应具有 2 mL 或 3 mL 的梯度液，具体体积取决于步骤 2.2.3 的结果。
    3. 转至方案的第 5 步，加入细胞并继续实验。

8. 通过尿酮酸测定法测量荚膜含量

  1. 用 PBS 稀释各回收组分，调节其 OD600 至 4.0。随后按照先前发表的方法进行尿糖醛酸的定量1。

结果

代表性结果如图2所示。预期的具体结果将取决于细菌种类、密度梯度的设置，以及使用者是检测单一菌株还是突变体混合物。大多数菌株将在梯度中迁移至单一位置，如图2A和2D所示。将该方法应用于细菌突变体文库时，会在梯度上方出现一条主要条带，一条密度较低的条带分布在梯度最上层，以及在底部出现少量无荚膜组分（图2B）。这些组分的荚膜含量可通过尿糖酸检测实验加以区分（图2B）。对各个组分进行转座子插入测序，可清晰显示特定突变体在不同梯度组分中的定位情况，如肺炎克雷伯菌K. pneumoniae ATCC43816荚膜生物合成位点所示（图2C）。K. pneumoniae NTUH-K2044和S. pneumoniae的纯培养物，以及不同荚膜生物合成或调控突变体的代表性结果如图2D所示。

细菌培养纯化示意图；用于DNA分离和测序的离心方法。
图1：基于荚膜进行细菌分离的密度梯度离心法示意图及其应用。（A）一株具有荚膜的Klebsiella pneumoniae细胞的电子显微镜图像。荚膜可见为细胞外侧的一层致密结构。（B）密度梯度离心在研究有荚膜细菌中的应用。（Bi）密度分离可用于从转座子突变文库中获得高荚膜、低荚膜及无荚膜的菌群组分，并结合转座子插入测序技术，鉴定影响荚膜生成的相关基因。（Bii）从复杂样本中纯化有荚膜的细菌。（Biii）利用基于密度的分离方法快速比较不同样本间的荚膜含量。该方法还可用于观察细菌群体中荚膜产生的异质性，如图（Biii）所示。请点击此处查看该图的放大版本。

肺炎克雷伯菌的Percoll密度梯度离心；基因位点分析图及读数计数图。
图2：代表性结果。（A）微型梯度实验的输出示例。两种不同的K. pneumoniae菌株在1 mL 15%密度梯度培养基上进行离心。高黏液型NTUH-K2044菌株保留在密度梯度培养基层上方，而ATCC43816（荚膜产生较少）则迁移至该层底部。（Bi）利用密度梯度将转座子突变文库分离为三个组分。注意，底部组分中突变体比例较低，在本图中不可见。（Bii）通过尿糖酸检测法验证顶部、中部和底部组分中荚膜含量的差异。分别收集顶部、中部及重新生长后的底部组分细胞，重悬于PBS中，调至OD600为4，随后提取荚膜多糖并测定尿糖酸含量1。（C）密度-TraDISort结果示例。染色体图谱上方的蓝色线条表示鉴定出的突变位置。缺乏荚膜的突变体表现为在输入文库中存在，但在顶部组分中耗竭、在底部组分中富集，如本图所示的荚膜生物合成位点8。（D）利用密度梯度离心比较K. pneumoniae NTUH-K2044和S. pneumoniae 23F野生型与突变株之间荚膜含量的示例。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

荚膜是多种细菌的重要毒力因子，包括K. pneumoniae3、Streptococcus pneumoniae9、Acinetobacter10和Neisseria11等菌种。尽管目前已存在多种用于细菌荚膜定量与可视化的方法，但尚无广泛应用的技术可实现荚膜菌与无荚膜菌的物理分离。本文展示了一种基于荚膜特性分离细菌群体的可靠方法，该方法可与多种上游或下游实验流程联用，具有广泛的应用潜力。

表面荚膜的存在会降低细菌细胞的密度，从而可通过密度梯度离心进行分离（图2D）。我们已在K. pneumoniae NTUH-K204412 和 ATCC4381613，以及Streptococcus pneumoniae 23F14 及其Δcps突变株15中验证了该方法。该方法以Percoll16作为密度梯度的主要成分，Percoll是一种包被的胶体二氧化硅颗粒悬浮液，具有低黏度且对细菌无毒性；原则上，其他满足上述条件的物质也可用于建立密度梯度。

在构建密度梯度时，确保不同密度的层不发生混合可能具有挑战性；如果发生混合，分离方法将无法获得清晰的结果。我们提供了两种倾注梯度的替代方法，即使用针头或移液器——两种方法均有效，选择哪种方法仅取决于个人偏好。在涉及将某种物质（无论是细菌悬液还是更稀释的梯度层）加样至梯度层上方的所有步骤中，分多次加入较小体积的液体 aliquot 可更易于形成清晰的界面，同时避免各层之间的混合。

本方案的一个局限性在于，其对其他细菌物种的效果无法保证。因此，在研究新的细菌物种或菌株时，必须使用另一种独立的荚膜定量方法来验证基于密度的分离效果。通过显微镜观察各组分中的细菌，并结合适当的荚膜染色方法，是一种可靠的验证手段，相关详细实验方案已有文献报道17。 alternatively，含有糖醛酸的荚膜（例如大肠杆菌 Escherichia coli 和 K. pneumoniae 的荚膜）可通过特异性检测方法进行定量，如图2B1所示。基于离心的黏稠度检测不适用于作为独立验证方法，因为该检测同样依赖于细菌细胞的密度。

该方法的另一个局限性在于，荚膜的产生对培养条件极为敏感，即使培养基成分、温度或通气条件发生微小变化，也可能影响本实验的结果。为尽量减少这一问题，研究人员可使用成分明确的培养基或批次间一致的复杂培养基，保持各实验间其他所有培养参数一致，并设置适当的对照菌株，以便对意外结果进行解释。某些细菌荚膜较为脆弱，在移液操作时可能从细胞表面脱落。为避免荚膜剪切，样品在梯度离心前的制备过程中，离心和重悬操作不应超过两次。若在浓缩培养物过程中仍出现荚膜丢失问题，可直接将细菌培养物加载到密度梯度中，必要时增加细菌悬液的体积以利于观察。

该方法的未来应用包括将其拓展至其他细菌种类，并将这种分离技术与不同的上游和下游技术结合使用。除了密度-TraDISort8之外，我们建议将包膜细菌的密度梯度分离用于分离具有改变荚膜的突变体、从混合培养物或复杂样品中纯化包膜细胞，以及对多个菌株的荚膜生成进行快速分析。最后，该技术还可用于研究其他细菌表型，例如聚集性。

披露

作者无财务利益需要披露。

致谢

感谢 Jin-Town Wang 和 Susannah Salter 提供菌株，以及 Parkhill 团队成员的有益讨论。本工作由惠康桑格研究所（惠康基金 206194）资助，并获得 F.L.S. 的 Sir Henry Wellcome 博士后奖学金（基金号 106063/A/14/Z）支持。M.J.D. 受惠康桑格研究所博士生奖学金资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PercollGE Healthcare17-0891-01
配备 A-4-81 转子和 500 mL 桶的离心机 5810REppendorf5810 718.007
15 mL 管适配器Eppendorf5810 722.004
固定角转子 F-34-6-38Eppendorf5804 727.002
2.6 至 7 mL 管适配器Eppendorf5804 739.000
配备 FA-45-24-11 转子的离心机 5424Eppendorf5424 000.460
2 mL 管Eppendorf0030 120.094
1.5 mL 管Eppendorf0030 120.086
5 mL 聚丙烯圆底管Falcon352063
1 mL 一次性鲁尔滑动注射器Becton Dickinson300013
AGANI 21G 绿色针头 x 1.5"TerumoAN 2138R1
P1000 移液器及吸头
P200 移液器及吸头

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