利用整体染色法观察三维白色脂肪组织结构

摘要

本研究的重点是展示全组织免疫染色与可视化技术作为一种理想的三维成像方法，用于观察脂肪组织的结构及其细胞组分。

摘要

脂肪组织是一种具有高度可塑性的重要代谢器官，能够响应环境刺激和营养状态。因此，已有多种技术被开发用于研究脂肪组织的形态学和生物学特性。然而，传统的可视化方法仅限于对组织的二维切片进行观察，无法完整呈现整个器官的三维结构。本文介绍整体染色法，这是一种免疫组织化学方法，仅需最少的处理步骤即可保持脂肪组织完整的形态结构。因此，脂肪细胞及其他细胞组分的结构得以无变形地保留，从而实现对组织最具代表性的三维可视化。此外，整体染色法还可与谱系示踪技术结合，用于确定细胞命运决定。然而，该技术在提供脂肪组织深层区域的精确信息方面存在一定局限性。为克服这一限制，可将整体染色法进一步与组织透明化技术相结合，以消除组织的不透光性，并利用光片荧光显微镜实现对整个脂肪组织解剖结构的全面可视化。因此，通过这些技术的联合应用，能够获得更高分辨率且更准确的脂肪组织结构图像。

引言

脂肪组织是能量储存的重要器官，具有动态重塑和近乎无限扩张的特性¹。除了维持能量稳态外，脂肪组织还通过分泌50多种脂肪因子在激素分泌中发挥关键作用，从而调节全身代谢功能²。脂肪组织具有复杂的结构，包含多种细胞类型，如成熟脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞以及脂肪细胞前体细胞³。近期研究表明，肥胖及其他代谢功能障碍可显著改变脂肪组织的功能及其微环境，这些改变包括但不限于脂肪细胞体积增大、炎性细胞（例如，巨噬细胞）浸润以及血管功能障碍³。

传统的形态学技术（如组织学和冷冻切片）在研究脂肪生物学时存在若干局限性，例如漫长的化学处理步骤可能导致组织收缩和结构变形^3,4。此外，这些二维技术难以观察不同类型细胞之间的细胞间相互作用，因为所获得的切片仅限于整个组织的较小区域³。与传统的荧光成像方法相比，整体染色无需额外的侵入性步骤（如包埋、切片和脱水），因此可避免抗体特异性降低的问题。因此，整体染色是一种简单且高效的脂肪组织成像方法，能够更好地保存脂肪细胞的形态 和整体脂肪组织结构⁵。因此，作为一种快速且低成本的免疫标记技术，整体染色已被建立用于保留脂肪组织的三维结构^1,6,7,8。

然而，尽管采用整体染色法能够保持脂肪组织的形态结构，该技术仍无法可视化组织脂质表面下方的内部结构。近年来的几项研究^9,10 已建立将组织透明化技术与整体免疫标记相结合的方法^1,6 ，以实现对脂肪组织内部结构的全面三维可视化。特别是近期研究^9,10,11,12 利用三维体积成像技术，成功可视化了脂肪组织中致密的神经网络和血管系统。事实上，研究脂肪组织在不同生理条件下的神经可塑性与血管可塑性，对于理解其生物学特性至关重要。基于免疫标记的溶剂清除器官三维成像（iDISCO+）组织透明化技术，包含甲醇预处理、免疫标记以及使用有机化学试剂二氯甲烷（DCM）和二苄基醚（DBE）清除组织不透光性的步骤^13,14。通过使脂肪组织完全透明，可更准确地呈现组织内部的解剖结构，例如血管和神经纤维^9,10。iDISCO+的优势在于其可兼容多种抗体和荧光报告分子^11,14，并在多个器官甚至胚胎中均取得了成功应用¹⁴。然而，其主要局限性在于实验周期较长，整个流程需要18至20天才能完成。

整体染色的另一个重要应用是结合谱系示踪系统来可视化细胞命运。谱系示踪是指在细胞中标记特定基因或标记物，该标记可传递给所有子代细胞，并在时间进程中保持稳定¹⁵。因此，这是一种用于确定细胞后代命运的强大工具¹⁵。自20世纪90年代以来，Cre-LoxP重组系统已成为在活体生物中进行谱系示踪的一种有力方法¹⁵。当表达Cre（一种DNA重组酶）的小鼠品系与另一种表达报告基因且其报告基因邻近loxP-STOP-loxP序列的小鼠品系杂交时，报告蛋白即被表达¹⁵。

对于整体染色，使用荧光多色报告基因适用于脂肪组织成像，因其对脂肪细胞内的细胞活动干扰极小¹⁶。然而，传统报告基因通常标记细胞质，难以追踪细胞质含量有限的白色脂肪细胞的谱系¹⁷。为克服这一问题，膜结合型荧光tdTomato/膜结合型eGFP（mT/mG）报告基因标记工具是理想选择。在Cre阴性细胞中表达膜靶向tdTomato¹⁸；当发生Cre介导的切除后，会转换为表达膜靶向eGFP，因此该报告基因适用于追踪脂肪细胞前体的谱系^17,18 （补充图 1）。

本文的目的是提供一种完整的全组织染色实验方案，并展示如何将其与其他技术结合，用于研究脂肪组织的发育和生理学特性。本方案中描述了两个应用实例：一是与多色报告小鼠品系联用，以鉴定脂肪细胞的不同来源；二是结合组织透明化技术，进一步可视化白色脂肪组织（WAT）中的神经分支结构。

方案

所有实验动物方案均经表型基因组学中心（TCP）动物护理委员会批准，并符合加拿大动物护理委员会的标准。小鼠维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，并可自由获取水和食物。在整体染色实验中使用了7月龄的C57BL/6J雄性小鼠。

注意：第1至第2部分按时间顺序进行，第3部分为第1部分之后的可选步骤。第2部分完成后，可进行第4部分以分析脂肪细胞大小和血管密度。

1. 材料准备与组织分离

1. 配制新鲜的1%多聚甲醛（PFA），用1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，用于组织固定。另配制0.3%非离子型表面活性剂溶于1× PBS的溶液（下文简称PBS-0.3T），用于后续组织洗涤步骤。
   注意：每份组织准备约1.5 mL的1% PFA溶液，以确保组织完全浸没。可根据组织大小适当增加或减少固定液体积。
   警告：此步骤具有危险性，PFA具有腐蚀性和毒性。操作时须佩戴个人防护装备（例如，腈类手套、实验服、防护鞋具、护目镜），并在通风橱中进行。
2. 根据批准的程序实施动物安乐死（例如，颈椎脱位和/或二氧化碳窒息法）。立即解剖获取目标脂肪组织库（例如，腹股沟白色脂肪组织或性腺周围白色脂肪组织）¹⁸。
3. 使用解剖剪在100 × 15 mm²培养皿上将组织剪切成约0.5–1 cm大小的组织块，并将其浸入装有1% PFA的微量离心管中。置于冰上保存。

2. 白色脂肪组织的整体染色

1. 解剖完成后，将置于冰上的1%多聚甲醛（PFA）中的组织样本转移至室温（RT）放置1小时，随后将组织转移至12孔或24孔细胞培养板中，以便更快地进行洗涤。
2. 在摇床上用PBS-0.3T溶液洗涤组织，室温下每次5分钟，共洗涤3次，摇床倾斜角度为22°，摇动速度为每分钟20–25次。
   注意：后续所有涉及使用摇床的步骤均采用此倾斜角度和速度。
   注意：若使用如mT/mG等多色报告小鼠品系，且无需额外抗体染色，则组织在步骤2.2后即可用于显微成像。
3. 加入0.5–1 mL封闭缓冲液（含5%动物血清的PBS-0.3T溶液），将培养板置于摇床上，室温孵育1小时。
4. 吸除封闭液，加入用PBS-0.3T溶液稀释的一抗（含1%动物血清）。
5. 将培养板置于4 °C摇床上过夜孵育。
6. 次日，在室温下用PBS-0.3T溶液洗涤组织，每次5分钟，共洗涤3次。
7. 使用适当的二抗，用PBS-0.3T溶液稀释后加入，每孔加入0.5–1 mL二抗溶液，用铝箔纸包裹培养板，于室温摇床上孵育1小时。
   注意：二抗稀释过程需避光，以防荧光淬灭。
8. 二抗孵育后，在室温下用PBS-0.3T溶液洗涤两次，每次5分钟。若无需中性脂质染色，此时可直接对样本进行成像。若需通过中性脂质染色观察脂滴，则需改用1× PBS（不含非离子型表面活性剂）洗涤两次，每次5分钟。
9. 洗涤完成后，将中性脂质染料用1× PBS按1:1500比例稀释，室温孵育30分钟。此时组织已准备好用于显微成像。如需后续成像，可将组织保存在该溶液中，置于4 °C避光保存。
   注意：成像质量随时间逐渐下降，因此最佳成像时间为1–2天内。
10. 使用镊子将组织平整地铺在24 × 60 mm²的玻璃盖玻片上，并置于倒置共聚焦激光显微镜系统下进行观察。
11. 若需用DAPI对细胞核进行染色，可加入1–2滴含DAPI的封片剂，完全浸没组织以防止干燥。
12. 为获取整装染色组织在多个焦平面的图像，应在所需放大倍数下进行Z轴层扫，深度为100–150 μm，步长为4–6 μm。

3. 使用iDISCO+进行组织透明化和免疫标记

注意：本方案基于先前已发表的方法^9,10,19。

1. 固定与甲醇预处理
   1. 在2 mL微量离心管中，将组织置于4°C下用4% PFA（溶于1×PBS）固定过夜。
      注意：在成像前的所有后续处理步骤中，均将组织保留在2 mL离心管中。
   2. 次日，在室温下于摇床上用1×PBS洗涤组织，每次1小时，共洗涤3次。
      注意：此步骤可作为暂停点，将样品在室温或 4 °C 下放置过夜。
   3. 在室温下依次使用20%、40%、60%和80%甲醇各脱水1小时。随后在室温下用100%甲醇脱水1小时，然后将组织转移至新鲜的100%甲醇中，于4 °C孵育1小时。
      注意：用蒸馏水稀释甲醇。在甲醇孵育过程中，只要组织样本完全浸没，无需将样本置于摇床中。
      警告：此步骤具有危险性，因为甲醇有毒，遇明火极易燃。请佩戴个人防护装备（例如， 佩戴腈基手套、实验服和安全护目镜，并在通风橱中操作。将甲醇存放在远离火源处，并置于易燃品安全柜中。
   4. 用5%过氧化氢（H₂O₂）漂白组织₂O₂；1 体积 30% H₂O₂ 在4 °C下，用5倍体积的100%甲醇稀释，孵育过夜。
      警告：30%过氧化氢与皮肤和眼睛接触时具有高度危险性。请佩戴个人防护装备（例如， 腈类手套、实验服、护目镜）并在通风橱中操作。
   5. 在室温下依次用80%、60%、40%和20%的甲醇与1x PBS溶液重水化组织，每步各1小时。
   6. 用含0.2%非离子型表面活性剂的1×PBS溶液在室温下于摇床上孵育洗涤两次，每次1小时。
2. 免疫标记
   注意：从免疫标记开始直至透明化完成，需将每步所用溶液加至含有组织的2 mL离心管管口，以防止组织氧化。
   1. 将组织置于含有1×PBS、0.2%非离子型表面活性剂、20%二甲基亚砜（DMSO）和0.3 M甘氨酸的溶液中，在37 °C条件下于恒温平板振荡器上孵育2天，以实现组织通透。
      注意：37 °C 透化步骤的最长孵育时间为 2 天。
   2. 在37 °C下，将组织置于含1x PBS、0.2%非离子表面活性剂、10% DMSO、5%驴血清和1% Fc阻断剂的溶液中，于恒温振荡摇床孵育2天。
      注意：封闭步骤的最长孵育时间为2天。
   3. 将组织置于含有目标一抗的溶液中，于37 °C在恒温台式轨道摇床中孵育4天，溶液成分为1x PBS、0.2%吐温-20、10 µg/mL肝素、5% DMSO和5%驴血清。
   4. 用含0.2%聚山梨酯20和10 µg/mL肝素的1x PBS在室温下于摇床上洗涤5次，每次1小时。
      注意：此步骤可作为暂停点，将样品在室温下放置过夜。
   5. 在37 °C下，将组织置于含1x PBS、0.2% polysorbate 20、10 µg/mL肝素和5%驴血清的溶液中，加入二抗，在台式轨道摇床上孵育4天。
      注意：从步骤 3.2.5 开始，所有样品均需用铝箔包裹，以防止二抗发生光漂白。
   6. 在室温下，将组织置于含1×PBS、0.2%吐温20和10 µg/mL肝素的溶液中，于摇床上振荡洗涤5次，每次2小时。
      注意：此步骤可作为暂停点，将样品在室温下放置过夜。
3. 白色脂肪组织的透明化与三维成像
   1. 将含有组织的2 mL离心管中的组织在20%、40%、60%和80%甲醇中依次孵育，每步在室温下进行1小时。随后，在室温下用100%甲醇孵育两次，每次处理一次。
      注意：此步骤可作为暂停点，将样品在室温下置于100%甲醇中过夜。
   2. 将组织置于摇床中，在室温下用2体积二氯甲烷与1体积甲醇的混合液孵育3小时。
      注意：二氯甲烷（DCM）具有挥发性。务必确保试管密封严密，以防蒸发。
      警告：此步骤具有危险性。二氯甲烷（DCM）吸入后有毒，长期接触可能引起化学灼伤。请佩戴个人防护装备（例如， 腈类手套、实验服、防护鞋具、护目镜。使用通风橱。
   3. 将组织在100% DCM中于室温振荡孵育，每次15分钟，重复两次。
   4. 在室温下用100% DBE孵育，直至成像或用于样本保存。成像前，反复倒置管子数次以混匀溶液。
      注意：用DBE完全充满离心管，以防止氧化，否则可能导致组织透明失败。在DBE孵育期间，切勿摇动离心管。
      警告：此步骤具有危险性。DBE 有毒，可引起眼睛和皮肤刺激。请佩戴个人防护装备（例如， 腈类手套、实验服、护目镜）并在通风橱中操作。
   5. 使用与有机溶剂DBE折射率相匹配的光学显微镜对整个组织样本进行成像。以所需的放大倍数和步长对整个组织进行Z轴层扫成像。

4. 使用 ImageJ 对整体染色组织图像进行数据分析的示例

注意：下载和安装说明请参见 https://imageJ.nih.gov/ij/download.html。

1. 血管密度的定量分析（补充图2）
   1. 将仅包含血管免疫染色通道的保存图像导入ImageJ。
      注意：用于定量分析的图像在染色程序和图像采集条件方面应保持一致。应使用相同的试剂，成像过程中的曝光时间、强度和放大倍数也应相同²⁰。
   2. 将图像颜色转换为黑白，以进行血管密度定量。操作方法为：在“图像”选项卡下，选择“调整”命令，然后选择“颜色阈值”选项。在“阈值颜色”显示框中，选择“暗背景”²⁰，并在“阈值颜色”下选择“B&W”。
   3. 为测量血管信号区域占背景区域的百分比，选择“分析”选项卡，然后选择“分析颗粒”命令。在“分析颗粒”显示界面中，选择“清除结果”和“汇总”选项，点击“确定”。
   4. 将“汇总”标签页下的面积百分比数值复制并粘贴到电子表格中进行分析。该面积百分比即表示血管密度。对每张独立图像重复步骤4.3.1–4.3.4。
2. 脂肪细胞大小的定量分析²¹（补充图3）
   1. 将保存的脂肪细胞图像导入ImageJ。
   2. 为设定图像比例尺，使用直线选择工具在图像上已知距离的比例尺处画一条线，以像素为单位测量其长度。在“分析”选项卡下选择“设定比例尺”命令，此前所画线段的长度将自动以像素计算。
   3. 将弹出“设定比例尺”显示框。输入已知的距离数值及长度单位。选择“全局”选项，以便将此比例尺设置应用于所有导入的图像，然后点击“确定”。
   4. 为选择面积作为测量方法，在“分析”选项卡下选择“设定测量值”命令，将出现多种测量选项的列表。选择“面积”选项，然后点击“确定”。
   5. 使用自由手绘选择工具，勾勒出每个目标脂肪细胞的轮廓。在“分析”选项卡下选择“测量（Ctrl + M）”命令，脂肪细胞的面积值将显示出来。对图像中的其他脂肪细胞重复此操作。
      注意：为确保测量结果的准确性，应使用多张图像进行定量分析。
   6. 将面积测量值复制并粘贴到电子表格中，用于进一步的数据分析。

结果

由于脂肪组织较为脆弱，涉及多个处理步骤和切片的方法可能导致脂肪组织形态的破坏³（图1A）。然而，整体染色法可有效保持脂肪细胞的形态，确保实验结果的准确解读（图1B）。

脂肪组织过度固定会导致固定剂诱导的自发荧光。如图2A所示，分别用于酪氨酸羟化酶（TH）和PECAM-1信号的绿色和红色通道染色在组织的相同区域重叠，表明由于在PFA中固定3天可能导致了自发荧光。相比之下，图2B展示了在正确固定条件下进行整体染色的代表性图像，TH染色信号出现在与PECAM-1信号不同的区域，表明该信号并非自发荧光，而是真实的阳性信号。

整体染色是基于Cre-loxP系统进行脂肪细胞谱系示踪的重要可视化工具¹⁵，其中m...

讨论

尽管组织学和冰冻切片等传统技术在观察细胞内结构方面具有优势，但整体染色为脂肪组织研究提供了另一种视角，能够对经最少处理的组织进行细胞结构的三维可视化观察。

为了成功进行整体染色，应考虑以下建议。不同脂肪组织库可能会产生不同的免疫染色结果，因此应首先确定所用脂肪组织库的类型。例如，由于棕色脂肪组织（BAT）的脂肪细胞体积较小且具有多房结构，其密度高于白色脂肪组织（WAT）²¹。BAT 密度的增加使得抗体难以穿透组织。此外，脂肪组织的大小对于实现有效的抗体染色也至关重要，因为过厚或过大的组织同样会导致抗体渗透不足。因此，在动物解剖过程中获取脂肪组织时，应选用附睾脂肪组织的远端部分，因为该区域最薄，有利于抗体充分渗透并获得一致的数据。或者，对于密度较高的组织，可使用荧光报告小鼠品系（如 mT/mG），以更清晰地观察目标标记物，从而避免抗体渗透不足的问题。随后，使用 1% 多聚甲醛（PFA）对组织进行固定，以保持蛋白质的天然分布，并确保组织通透性和抗体渗透^22,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LipidTox	Life Technologies	H34477
PECAM-1 一抗	Millipore	MAB1398Z(CH)
TH（酪氨酸羟化酶）一抗	Millipore	AB152, AB1542
DAPI 染色剂	BD Pharmingen	564907
Nikon A1R 共聚焦显微镜	Nikon		共聚焦显微镜
Ultramicroscope I	LaVision BioTec		光片荧光显微镜
Alexa Fluor 二抗	Jackson ImmunoResearch		使用波长为 488、594 和 647
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32	BioSciences	553141
二氯甲烷	Sigma-Aldrich	270997
二苄醚	Sigma-Aldrich	33630
甲醇	Fisher Chemical	A452-1
30% 过氧化氢	BIO BASIC CANADA INC	HC4060
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650
甘氨酸	Sigma-Aldrich	J7126
肝素	Sigma-Aldrich	H3393
荧光素标记凝集素试剂盒 I	VECTOR LABORATORIES	FLK-2100
F4/80	Bio-Rad	MCA497GA
含 DAPI 的 VECTASHIELD 硬封片剂	VECTOR LABORATORIES	H-1500
多聚甲醛（PFA）
磷酸盐缓冲液（PBS）
Triton-X
Tween
动物血清（山羊、驴）