三维白色脂肪组织结构的全装染色可视化

Summary

本研究的重点是展示全安装免疫染色和可视化技术作为一种理想的方法, 为脂肪组织结构和细胞成分的三维成像。

Abstract

脂肪组织是一种重要的代谢器官, 具有较高的可塑性, 对环境刺激和营养状态有反应。因此, 研究脂肪组织的形态和生物学的各种技术已经发展起来。然而, 传统的可视化方法仅限于研究二维切片中的组织, 无法捕获整个器官的3d 结构。在这里, 我们提出了全贴染色, 一种免疫组织化学方法, 保持完整的脂肪组织形态学与最小的处理步骤。因此, 脂肪细胞和其他细胞成分的结构保持没有扭曲, 实现了最具代表性的三维可视化组织。此外, 整个染色可以与血统追踪方法相结合, 以确定细胞的命运决定。然而, 这种技术有一些限制, 以提供有关脂肪组织的较深层次的准确部分的准确信息。为了克服这一限制, 可以进一步结合组织清除技术, 消除组织的不透明, 并允许使用光片荧光显微镜对整个脂肪组织解剖进行完整的可视化。因此, 结合这些技术可以获得更高的分辨率和更准确的脂肪组织结构表示。

Introduction

脂肪组织是储能的重要器官, 其特点是动态重塑和几乎无限的膨胀¹。除了能量稳态外, 脂肪组织在50多只脂肪因子的激素分泌中也起着至关重要的作用, 以调节全身代谢功能²。脂肪组织有一个多样化的结构, 包括各种细胞类型, 包括成熟的脂肪细胞, 成纤维细胞, 内皮细胞, 免疫细胞, 和脂肪细胞^{祖细胞 3}。最近的研究表明, 肥胖和其他代谢功能障碍可以显著改变脂肪组织功能和微环境, 其中包括但不限于脂肪细胞的扩大, 炎症细胞的浸润 (例如,巨噬细胞) 和血管功能障碍³。

传统的形态学技术, 如组织学和冷冻合成, 证明了在研究脂肪生物学的几个局限性, 如冗长的化学处理步骤, 这可能导致组织收缩和结构变形^{3, 4}. 我的工作是什么？此外, 这些二维技术不足以观察不同细胞类型所施加的细胞间相互作用, 因为所获得的切片仅限于整个组织³的较小区域。与传统的荧光成像方法相比, 全贴染色不需要额外的侵入性步骤, 如嵌入、切片和脱水;因此, 这避免了抗体特异性降低的问题。因此, 它是一种简单有效的脂肪组织成像方法, 具有较好的脂肪细胞....

Protocol

所有实验动物规程都得到了苯基因组学中心 (tcp) 动物护理委员会的批准, 符合加拿大动物护理委员会的标准。老鼠保持在12小时的光/黑暗循环中, 并免费获得水和食物。采用7个月大的 c57bl/6j 雄性小鼠进行全装染色试验。

注: 第1至第2节按时间顺序排列, 第3节是第1节之后的一个可选步骤。第4节可在第2部分完成后进行脂肪细胞大小和血管密度分析。

1. 材料制备和组织分离

1. 准备新鲜的1% 聚甲醛 (pfa) 稀释在1x 磷酸盐缓冲盐 (pbs) 组织固定。准备0.3% 的非离子表面活性剂, 在 1x pbs (以下简称 pbs-0.3 t) 中稀释, 用于后续的组织清洗步骤。
   注: 对于每个组织, 准备大约 1.5 ml 的 1% pfa, 以确保完全浸入。固定体积可能会增加或减少, 这取决于组织的大小。
   注意: 此步骤是危险的, 因为 pfa 具有腐蚀性和毒性。佩戴个人防护设备 (如丁腈手套、实验室外套、鞋类、安全护目镜), 并在通风罩中手柄。
2. 按照批准的程序对动物进行安乐死 (例如, 宫颈脱位和二氧化碳窒息)。立即解剖所需的脂肪组织库 (例如, 腹股沟白色脂肪组织或腹膜白色脂肪组织)¹⁸。
3. 用解剖剪刀, 将组织切割成大约 0.5-1 厘米大....

Results

由于脂肪组织的脆弱性, 涉及多个处理步骤和切片的方法^可能导致脂肪组织形态的毁容 3 (图 1a)。然而, 全贴染色可以保持脂肪细胞的形态, 确保准确解释结果 (图 1b)。

脂肪组织的过度固定会导致固定性的自体荧光。如图 2 a所示, 分别对酪氨酸羟化酶 (th) 和 pecam-1 信号进行绿色和红色通道染色, 在组织的相同区域重叠, 这表明由于 pfa 中过度固定 3天, 可能发生了自体荧光。相反,图 2b显示了在进行适当固定时的全装染色的代表性图像, 因为 th 染色的信号发生在相对于 pecam-1 信号的不同区域, 表明该信号不是自荧光的,实际上是一个积极的信号。

全贴染色是基于 cre-loxp 的脂肪细胞15谱系追踪的重要可视化工.......

Discussion

尽管传统的组织学和冷冻技术为观察细胞内结构提供了好处, 但全贴染色为脂肪组织研究提供了不同的视角, 从而实现了细胞的三维可视化最小处理组织的结构。

为了成功地进行整体染色, 应考虑以下建议。不同的脂肪组织库可以产生不同的免疫染色效果;因此, 应首先确定所使用的脂肪组织仓库的类型。例如, 棕色脂肪组织 (bat) 相对于白色脂肪组织 (wat) 密度较高, 原因是较小的多室脂肪细胞 21.这种 bat 密度的增加使得抗体难以渗透到组织中。此外, 脂肪组织的大小也是必要的适当的抗体染色, 因为太大/厚的组织也可能导致抗体渗透不足。因此, 当获得脂肪组织在动物解剖过程中, 应使用周围脂肪组织的远端部分, 因为这是最薄的区域, 可以允许足够的抗体渗透和一致的数据。或者, 对于密度较高的组织, 使用荧光记者鼠标线, 如 mt/mg, 可以让感兴趣的标记更好地可视化, 因为这样可以避免抗体渗透不足的问题。随后, 1% pfa 用于组织固定, 以保持蛋白质的自然分布, 并确保组织渗透性和抗体渗透 22.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LipidTox	Life Technologies	H34477
PECAM-1 一抗	Millipore	MAB1398Z（CH）
TH（酪氨酸羟化酶） 一抗	Millipore	AB152， AB1542
DAPI染色	BD Pharmingen	564907
尼康A1R共聚焦显微镜	尼康		共聚焦显微镜
超微显微镜 I	LaVision BioTec		光片图像荧光显微镜
Alexa Fluor 二抗	Jackson ImmunoResearch		波长 488、594 和 647 使用
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32	生物科学	553141
二氯甲烷	Sigma-Aldrich	270997
二苄醚	Sigma-Aldrich	33630
甲醇	Fisher Chemical	A452-1
30% 过氧化氢	BIO BASIC CANADA INC	HC4060
二甲基亚砜 （DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650
甘氨酸	Sigma-Aldrich	J7126
肝素	Sigma-Aldrich	H3393
凝集素试剂盒 I，荧光素标记	VECTOR LABORATORIES	FLK-2100
F4/80	Bio-Rad	MCA497GA
VECTASHIELD 硬固封固剂，含 DAPI	VECTOR LABORATORIES	H-1500
多聚甲醛 （PFA）
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）
Triton-X
吐温
动物血清（山羊、驴）