本研究的重点是展示全组织免疫染色与可视化技术作为一种理想的三维成像方法，用于观察脂肪组织的结构及其细胞组分。
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本文内容
摘要
摘要
脂肪组织是一种具有高度可塑性的重要代谢器官，能够响应环境刺激和营养状态。因此，已有多种技术被开发用于研究脂肪组织的形态学和生物学特性。然而，传统的可视化方法仅限于对组织的二维切片进行观察，无法完整呈现整个器官的三维结构。本文介绍整体染色法，这是一种免疫组织化学方法，仅需最少的处理步骤即可保持脂肪组织完整的形态结构。因此，脂肪细胞及其他细胞组分的结构得以无变形地保留，从而实现对组织最具代表性的三维可视化。此外，整体染色法还可与谱系示踪技术结合，用于确定细胞命运决定。然而，该技术在提供脂肪组织深层区域的精确信息方面存在一定局限性。为克服这一限制，可将整体染色法进一步与组织透明化技术相结合，以消除组织的不透光性，并利用光片荧光显微镜实现对整个脂肪组织解剖结构的全面可视化。因此，通过这些技术的联合应用，能够获得更高分辨率且更准确的脂肪组织结构图像。
引言
脂肪组织是能量储存的重要器官，具有动态重塑和近乎无限扩张的特性1。除了维持能量稳态外，脂肪组织还通过分泌50多种脂肪因子在激素分泌中发挥关键作用，从而调节全身代谢功能2。脂肪组织具有复杂的结构，包含多种细胞类型，如成熟脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞以及脂肪细胞前体细胞3。近期研究表明，肥胖及其他代谢功能障碍可显著改变脂肪组织的功能及其微环境，这些改变包括但不限于脂肪细胞体积增大、炎性细胞（例如，巨噬细胞）浸润以及血管功能障碍3。
传统的形态学技术（如组织学和冷冻切片）在研究脂肪生物学时存在若干局限性，例如漫长的化学处理步骤可能导致组织收缩和结构变形3,4。此外，这些二维技术难以观察不同类型细胞之间的细胞间相互作用，因为所获得的切片仅限于整个组织的较小区域3。与传统的荧光成像方法相比，整体染色无需额外的侵入性步骤（如包埋、切片和脱水），因此可避免抗体特异性降低的问题。因此，整体染色是一种简单且高效的脂肪组织成像方法，能够更好地保存脂肪细胞的形态 和整体脂肪组织结构
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方案
所有实验动物方案均经表型基因组学中心（TCP）动物护理委员会批准，并符合加拿大动物护理委员会的标准。小鼠维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，并可自由获取水和食物。在整体染色实验中使用了7月龄的C57BL/6J雄性小鼠。
注意：第1至第2部分按时间顺序进行，第3部分为第1部分之后的可选步骤。第2部分完成后，可进行第4部分以分析脂肪细胞大小和血管密度。
1. 材料准备与组织分离
- 配制新鲜的1%多聚甲醛（PFA），用1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，用于组织固定。另配制0.3%非离子型表面活性剂溶于1× PBS的溶液（下文简称PBS-0.3T），用于后续组织洗涤步骤。
注意：每份组织准备约1.5 mL的1% PFA溶液，以确保组织完全浸没。可根据组织大小适当增加或减少固定液体积。
警告：此步骤具有危险性，PFA具有腐蚀性和毒性。操作时须佩戴个人防护装备（例如，腈类手套、实验服、防护鞋具、护目镜），并在通风橱中进行。 - 根据批准的程序实施动物安乐死（例如，颈椎脱位和/或二氧化碳窒息法）。立即解剖获取目标脂肪组织库（例如，腹股沟白色脂肪组织或性腺周围白色脂肪组织）18。
- 使用解剖剪在100 × 15 mm2培养皿....
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结果
由于脂肪组织较为脆弱，涉及多个处理步骤和切片的方法可能导致脂肪组织形态的破坏3（图1A）。然而，整体染色法可保持脂肪细胞的形态完整性，确保实验结果的准确解读（图1B）。
脂肪组织过度固定会导致固定剂诱导的自发荧光。如图2A所示，分别用于标记酪氨酸羟化酶（TH）和PECAM-1信号的绿色和红色荧光通道在组织的相同区域重叠，表明由于在PFA中固定3天导致了自发荧光的发生。相比之下，图2B展示了在适当固定条件下进行整体染色的代表性图像，TH染色信号与PECAM-1信号位于不同的区域，表明该信号并非自发荧光，而是真实的阳性信号。
整体染色是基于Cre-loxP系统进行脂肪细胞谱系示踪的重要可视化工具15，.......
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讨论
尽管组织学和冰冻切片等传统技术在观察细胞内结构方面具有优势，但整体染色为脂肪组织研究提供了另一种视角，能够对经最少处理的组织进行细胞结构的三维可视化观察。
为了成功进行整体染色，应考虑以下建议。不同脂肪组织库可能会产生不同的免疫染色结果，因此应首先确定所用脂肪组织库的类型。例如，由于棕色脂肪组织（BAT）的脂肪细胞体积较小且具有多房结构，其密度高于白色脂肪组织（WAT）21。BAT 密度的增加使得抗体难以穿透组织。此外，脂肪组织的大小对于实现有效的抗体染色也至关重要，因为过厚或过大的组织同样会导致抗体渗透不足。因此，在动物解剖过程中获取脂肪组织时，应选用附睾脂肪组织的远端部分，因为该区域最薄，有利于抗体充分渗透并获得一致的数据。或者，对于密度较高的组织，可使用荧光报告小鼠品系（如 mT/mG），以更清晰地观察目标标记物，从而避免抗体渗透不足的问题。随后，使用 1% 多聚甲醛（PFA）对组织进行固定，以保持蛋白质的天然分布，并确保组织通透性和抗体渗透22,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）资助，Banting & Best糖尿病中心（BBDC）试点与可行性研究资助，H-K.S. 获得的SickKids启动基金，以及韩国国家研究基金会（NRF）由科学、信息通信技术与未来规划部资助的医学研究中心项目（2015R1A5A2009124）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 一抗 | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH（酪氨酸羟化酶）一抗 | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI 染色剂 | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R 共聚焦显微镜 | Nikon | 共聚焦显微镜 | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | 光片荧光显微镜 | |
| Alexa Fluor 二抗 | Jackson ImmunoResearch | 使用波长为 488、594 和 647 | |
| 纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| 二氯甲烷 | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| 二苄醚 | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| 甲醇 | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% 过氧化氢 | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| 肝素 | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| 荧光素标记凝集素试剂盒 I | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| 含 DAPI 的 VECTASHIELD 硬封片剂 | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| 多聚甲醛（PFA） | |||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| 动物血清（山羊、驴） |
参考文献
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflamma....
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重印与许可
