本文介绍一种具有临床相关性、高效且无需饲养层的重编程方法，利用编码重编程因子的修饰mRNA以及成熟的microRNA-367/302模拟物，将人原代成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。文中还包括评估重编程效率、扩增单克隆iPSC集落以及验证多能性标志物TRA-1-60表达的方法。
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摘要
摘要
诱导性多能干细胞（iPSCs）已被证明是研究人类发育和疾病的重要工具。要将iPSCs进一步推进为再生治疗手段，需要一种安全、高效且快速的重编程方案。本文介绍了一种具有临床相关性的分步操作流程，可利用非整合方法将人皮肤成纤维细胞高效重编程为iPSCs。该方案的核心是通过表达多能性因子（SOX2、KLF4、cMYC、LIN28A、NANOG、OCT4-MyoD融合蛋白）来实现 体外 转录的信使RNA（mRNA）通过修饰核苷酸合成（修饰mRNA）。将重编程修饰mRNA与成熟的胚胎干细胞特异性microRNA-367/302模拟物每48小时共同转染入原代成纤维细胞，持续两周。随后可分离获得的诱导多能干细胞（iPSC）克隆，并在无饲养层条件下直接扩增。为最大限度提高本重编程方案在不同成纤维细胞样本中的效率与一致性，我们优化了多个参数，包括RNA转染方案、转染时间点、培养条件和接种密度。重要的是，本方法可从大多数成纤维细胞来源高效生成高质量iPSC，包括难以重编程的疾病相关、衰老和/或衰老样样本。
引言
将体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）需要持续表达一组核心转录因子，这些因子在维持多能性中起重要作用1,2。在为临床应用制备iPSCs时，必须在处理过程中尽量减少起始细胞的突变负荷，同时在不同患者的样本中保持相对较高的iPSC生成效率。然而，大多数重编程方法（包括无整合的重编程方案）的重编程效率极低，限制了这些方法在临床上的应用价值3。较低的重编程效率还可能导致携带预先存在突变的细胞被选择性地重编程，从而增加所获得iPSCs中的突变负荷。此外，所有基于DNA的重编程方法（如基于慢病毒或附加体型质粒的方法）均存在安全性问题，即外源DNA可能随机整合到基因组中，导致有害的插入突变，并在后续分化的组织衍生物中引发多能性基因的非预期（潜在致癌性）表达4。
一种有望高效诱导体细胞重编程为多能性并降低所获诱导多能干细胞（iPSCs）突变负荷的策略，是使用含有修饰核碱基的合成加帽信使RNA（修饰mRNA）进行重编程5。通过添加胚胎干细胞（ESC）特异性的微小RNA（miRNA）-367/302家族3，可进一步提高基于修饰mRNA的重编程效率，已有研究证明这些miRNA能够更高效地重编程体细胞6,7。然而，即使加入miRNA-367/302家族，基于修饰mRNA的重编程方法在应用于新分离的患者细胞时仍常失败3。为解决该修饰mRNA重编程方法的不稳定性问题，我们近期报道了一种优化的、无整合的策略，可高效诱导人原代成纤维细胞重编程为多能状态，并同时使用编码重编程因子的修饰mRNA和成熟miRNA-367/302模拟物8。在本方法中，重编程用修饰mRNA混合物包含一种OCT4与MyoD转录激活结构域融合的修饰版本（称为M3O）9，以及另外五种重编程因子（SOX2、KLF4、cMYC、LIN28A和NANOG）。将编码多能性因子的修饰mRNA与miRNA模拟物联合使用，在该方案中表现出对重编程效率的协同增强作用。此外，还需对RNA转染程序、细胞接种密度及培养条件进行进一步优化，才能将该方法的重编程效率提升至极高水平8。
与其他许多方案不同，我们的重编程方法通常仅需数千个起始成纤维细胞。此外，许多常见的非整合策略（如使用附加体型质粒、仙台病毒或自复制RNA）需要经过多次传代，以稀释诱导生成的iPSC中的重编程载体。相比之下，修饰的mRNA和成熟miRNA模拟物半衰期较短，可被细胞迅速清除。综上所述，该方法从采集患者样本到获得可用iPSC所需的累积细胞培养时间最短，有效限制了最终iPSC中突变的积累，并提高了成本效益。
本文介绍了利用我们基于组合修饰的mRNA/miRNA方法将成人人类成纤维细胞高效重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）的详细分步操作方案8。该基于RNA的重编程方案为科研及潜在的临床应用提供了一种简便、经济且稳健的方法，用于生成无整合的iPSCs。此外，该方法适用于多种成纤维细胞系的重编程，包括难以重编程的、与疾病相关的、衰老的以及衰老相关的成纤维细胞。人类成纤维细胞重编程方案的示意图见图1。本方案具体描述了在6孔板格式中对三孔人类成人原代成纤维细胞进行重编程的操作方法。通常两个孔即可获得足量的高质量iPSC克隆。在许多情况下，仅需一个孔即可完成实验，第三个孔可用于重编程效率的分析。如需要，可按比例扩大孔数。
方案
在无RNase的条件下操作，并尽可能使用无菌技术。所有与细胞培养相关的操作均须在生物安全柜中进行，并采用无菌技术。操作人源细胞时，应遵循所在机构的生物安全标准。
1. 重编程起始制备所需的试剂与设备
- 制备编码重编程因子的修饰mRNA混合物。
- 遵循先前发表的方案10 执行 体外 转录、加帽和去磷酸化程序，用于每种编码单个重编程因子的修饰mRNA。在最终纯化步骤后，用无核酸酶水洗脱修饰mRNA，向纯化的修饰mRNA溶液中添加1 U/µL RNase抑制剂，使用分光光度计对修饰mRNA进行定量，并于-80 °C保存，最长可保存6个月。每种修饰mRNA应分装成多个 aliquot，以尽量减少冻融循环次数。
注意：其他文献中已报道过类似的修饰mRNA制备方案5,8,11. 模板用于 体外 转录可通过使用下表所列引物，从相应的质粒模板进行PCR扩增而获得 材料表 根据先前发表的方案10. 每种重编程因子（M3O9SOX2、KLF4、cMYC、NANOG、LIN28A）和 mWasabi（转染对照）可从非营利性质粒库 Addgene 获取。 - 将所有修饰后的mRNA按3:1:1:1:1:1的摩尔比混合3O：SOX2：KLF4：cMYC：NANOG：LIN28A）并加入10% mWasabi修饰mRNA作为转染效率对照。通过添加含1 U/µL RNase抑制剂的无核酸酶水，将完全修饰mRNA重编程混合物调整至终浓度为100 ng/µL。将完整的修饰mRNA混合物分装为七份，每份33 µL。将分装好的重编程混合物于-80 °C保存。
注意：每次转染每孔加入 1,000 ng 修饰的 mRNA 混合物即， 共计 3,000 ng，用于 3 个孔）。每份 33 µL 分装液用于转染 6 孔板中的 3 个孔，其中包含 3 µL 过量体积以补偿移液误差。制备七份 33 µL 分装液足以完成 6 孔板中 3 个孔的完整成纤维细胞重编程实验。
- 遵循先前发表的方案10 执行 体外 转录、加帽和去磷酸化程序，用于每种编码单个重编程因子的修饰mRNA。在最终纯化步骤后，用无核酸酶水洗脱修饰mRNA，向纯化的修饰mRNA溶液中添加1 U/µL RNase抑制剂，使用分光光度计对修饰mRNA进行定量，并于-80 °C保存，最长可保存6个月。每种修饰mRNA应分装成多个 aliquot，以尽量减少冻融循环次数。
- 制备重编程miRNA模拟物的混合物。
- 将冻干的miRNA模拟物（Syn-hsa-miR-302a-3p、Syn-hsa-miR-302b-3p、Syn-hsa-miR-302c-3p、Syn-hsa-miR-302d-3p、Syn-hsa-miR-367-3p）溶解于含有1 U/µL RNase抑制剂的无核酸酶水中，配制成5 pmol/µL（5 µM）的终浓度。每种miRNA模拟物分装成多个 aliquot，于-80 °C长期保存。
- 将所有miRNA模拟物按1:1:1:1:1的摩尔比混合，终浓度为5 pmol/µL（5 µM）。分装7份，每份14 µL。将分装的miRNA模拟物混合液于-80 °C保存。
注意：每次转染每孔加入 20 pmol 的 miRNA 模拟物混合物（即， 总共60 pmol用于3个孔）。每个14 µL分装量用于转染一块6孔板中的3个孔，并包含2 µL额外体积以补偿移液误差。制备七份14 µL分装液足以完成一块6孔板中3个孔的完整成纤维细胞重编程实验。
- 配制转染缓冲液。
- 将一瓶500 mL和一瓶100 mL的新鲜低血清培养基预温至室温 室温（RT）孵育约2小时。请勿使用水浴。
- 将pH计转移至生物安全柜中。用无核酸酶水清洗pH计的玻璃电极。根据制造商说明书校准pH计。再次用无核酸酶水清洗电极。
- 将两瓶低血清培养基转移至生物安全柜中。使用室温下的500 mL瓶调节pH值。
- 将pH计的玻璃电极插入缓冲液中，测定低血清培养基的初始pH值。插入后等待最多1分钟，然后读取pH计上的pH值。
- 向500 mL低血清培养基中加入3–4 mL 1 M NaOH，盖紧瓶盖并充分混匀。静置最多5分钟后打开瓶盖进行pH测定。将pH计的电极插入缓冲液中，等待pH计读数稳定。
- 继续逐次加入少量1 M NaOH，直至低血清培养基的pH达到8.15–8.17。在此过程中多次校准pH计。若pH值在任何阶段超过8.18，则通过添加预热的100 mL瓶中的新鲜低血清培养基（步骤1.3.1）将pH调低。
注意：基于低血清培养基的转染缓冲液的 pH 值至关重要。当转染缓冲液的 pH 值约为 8.2 ± 0.05 时，重编程可成功进行；若 pH 值高于 8.25，则可能导致失败。因此，建议在缓冲液 pH 值达到 8.15–8.17 时即停止加入 NaOH。这样可确保过滤除菌后转染缓冲液的最终 pH 值约为 8.2–8.22。 - 使用0.22 µm真空过滤系统对转染缓冲液进行过滤除菌。将除菌后的缓冲液分装至5或15 mL离心管中，尽量减少管内气穴空间。
- 将转染缓冲液分装后于 4 °C 保存，最长可储存 3 个月。定期检测分装样品的 pH 值。若 pH 值高于 8.25，则弃用该分装样品。每份分装样品仅限用于 2 次转染。 因为转染缓冲液暴露于空气会使其pH升高。
- 制备成纤维细胞扩增培养基（FEM）：在最低必需培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1x非必需氨基酸、1x谷氨酰胺补充剂、55 µM 2-巯基乙醇和1x青霉素/链霉素/两性霉素B。将FEM储存于4 °C。
- 制备重编程培养基：在 DMEM/F12（不含 HEPES）中添加 20% 去除血清替代物（KOSR）、0.5× 非必需氨基酸、0.5× 谷氨酰胺补充剂、55 µM 2-巯基乙醇、50 µg/mL 抗坏血酸、1× 青霉素/链霉素/制霉菌素、100 ng/mL bFGF 和 200 ng/mL B18R。在启动重编程时配制不含 bFGF 和 B18R 的基础培养基，并于 4 °C 保存，配制后不得超过 1 个月使用期限。每次使用前，立即向当日用量的分装培养基中加入 bFGF 和 B18R。
- 在重编程的第0天使用前，通过向步骤1.5中含20% KOSR但不含bFGF和B18R的重编程培养基中加入5%热灭活（HI）胎牛血清（FBS）来制备铺板培养基。该培养基需在使用当天新鲜配制，并在使用前立即添加bFGF和B18R。
- 在启动重编程之前，根据制造商的说明，使用手持式数字 CO₂ 测定仪校准组织培养孵育箱2 分析仪。使用低氧2 用于重编程步骤的培养箱，以确保成功生成诱导多能干细胞（iPSC）。
2. 重编程用成纤维细胞的培养
- 在重编程开始前（第 -2 天）准备成纤维细胞。
- 用 5 mL 0.1% 明胶包被一个新的 10 cm 组织培养皿。轻敲或旋转培养皿，确保整个表面被均匀覆盖。在 37 °C 下孵育 15 分钟。吸除明胶后加入 10 mL FEM。放置备用。在加入 FEM 前，切勿让包被表面干燥。
- 小心吸除成纤维细胞的旧培养基。用 5 mL DPBS 冲洗细胞一次，以去除残留的血清。加入 3 mL 胰蛋白酶-EDTA。轻轻摇动培养板，确保液体完全覆盖细胞。
- 吸去多余液体，保留约 500 µL 胰蛋白酶。避免过度吸取，以免导致成纤维细胞干燥死亡。将成纤维细胞与胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 下孵育 3 分钟。
- 从培养箱中取出培养板，轻轻但用力地轻敲培养板侧面以使细胞脱落。在显微镜下观察细胞。若细胞已脱落并悬浮，继续下一步操作；若细胞仍贴壁，再孵育3分钟。
- 用5 mL FEM快速冲洗/收集脱离的细胞，以中和胰蛋白酶-EDTA。将成纤维细胞悬液转移至15 mL锥形管中。确保细胞充分混匀。
- 轻轻混匀细胞悬液以分散较大的细胞团块，然后用血细胞计数板进行细胞计数。转移 2.5 x 105 将细胞接种至第2.1.1步中制备的明胶包被10 cm培养皿中。在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。2 加湿的常规组织培养箱
注意：细胞密度对于实现高效的重编程至关重要，因为成纤维细胞必须处于健康且快速分裂的状态。接种 2.5 x 105 细胞在大多数成纤维细胞样本中，2天后可达到40-60%的融合度。对于病变或衰老细胞，应相应调整接种量，以确保48小时后达到理想的40-60%融合度。 - 第二天（第 -1 天）更换为 10 mL 新鲜的 FEM。
- 接种成纤维细胞以启动重编程（第0天）。
- 验证待重编程的成纤维细胞密度为40–60%融合度（图2，第0天）。若细胞密度过高或过低，按步骤2.1所述传代成纤维细胞，并相应调整接种密度。继续培养2天。
- 将4 mL DPBS转移至15 mL锥形管中，加入100 µL重组人源（rh）层粘连蛋白-521，用移液器吹打混匀。
- 向6孔板的3个孔中每孔加入1 ml稀释的rhLaminin-521。将包被后的培养板于37 °C孵育2 h。
- 将6 mL FEM和4 mL铺板培养基预热至37 °C。向铺板培养基中添加bFGF，使其终浓度为100 ng/mL，再加入B18R，使其终浓度为200 ng/mL。
- 小心吸除成纤维细胞的旧培养基（步骤 2.2.1）。用 5 mL DPBS 冲洗细胞，加入 3 mL 胰蛋白酶-EDTA。轻轻摇动培养板，使胰蛋白酶-EDTA 均匀覆盖细胞。
- 吸去多余液体，保留约 500 µL 胰蛋白酶溶液，操作同步骤 2.1.3。将成纤维细胞与胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 孵育 3 分钟。从培养箱中取出培养板，轻轻但有力地敲击培养板侧壁以使细胞脱落。在显微镜下观察细胞。若细胞已脱落并悬浮，可继续后续操作；若细胞仍贴壁，再孵育 3 分钟。
- 使用5 mL FEM冲洗/收集脱落的细胞，以中和胰蛋白酶-EDTA。将成纤维细胞悬液转移至15 mL锥形管中。确保细胞充分混匀，并用血细胞计数板进行计数。取12,000个细胞，加入4 mL预热的铺板培养基（来自步骤2.2.4）中。
注意：切勿在任何步骤中对细胞进行离心。根据细胞系生长速度的快慢，可相应增加或减少接种的细胞数量。 - 从培养箱中取出包被好的培养板，吸除包被孔中稀释的rhLaminin-521溶液，注意不要让孔表面干燥。轻柔地用铺板培养基重悬细胞，每孔加入1 mL细胞悬液至包被好的孔中即， 每孔 3,000 个细胞。
- 将接种有细胞的培养板放入三气组织培养箱中，调节氧气浓度2 设定为5%（低氧）2）。将培养板放置后，通过上下移动和左右移动交替的方式，轻柔而彻底地分散细胞，重复此操作2次。细胞置于培养箱中过夜培养。切勿通过旋转培养板来混匀。
- 将4 mL重编程培养基移液至15 mL锥形管中，并置于低氧培养箱内2 将培养瓶放入培养箱中，瓶盖稍松，过夜平衡。次日再添加 bFGF 和 B18R。
3. 重编程的启动（第1天）
注意：一旦重编程启动，需持续进行每日维护，大约持续1个月。请务必提前做好相应规划。所有后续细胞培养均须在低氧条件下进行。2 37 °C、5% CO₂ 条件下2，5% O₂2 加湿三气组织培养孵育箱
- 转染前至少1小时更换铺板培养基。
- 从低氧平衡的重编程培养基中移除2 培养箱中。加入bFGF至终浓度为100 ng/mL，加入B18R至终浓度为200 ng/mL。充分混匀。
- 每次操作一个孔，使用1 mL移液器吸除用过的培养基，并更换为1 mL添加了bFGF和B18R的重编程培养基。对每个孔重复此步骤。请勿使用真空抽吸，以免过度干燥细胞，造成细胞应激，降低重编程效率。将含细胞的培养板放回低氧培养箱中2 培养箱
- 每转染使用5 µL RNAiMax转染试剂与1 µg修饰mRNA，以及每6 pmol miRNA模拟物使用1 µL转染试剂。
注意：转染时间控制在16–20小时可获得最佳效果。转染试剂用转染缓冲液稀释10倍；100 ng/µL修饰mRNA混合物稀释5倍；5 pmol/µL miRNA模拟物混合物稀释8.33倍；上述组分均在形成复合物前用转染缓冲液进行稀释。参见 表1 有关转染实验设置的概述。- 配制转染混合物时，应遵循标准实验室操作规范，尽量减少试剂暴露于RNase的风险。
- 将转染缓冲液的等分试样（步骤1.3）在室温下平衡约1 h。不得使用37 °C水浴或培养箱加热转染缓冲液。
- 从 -80 °C 中取出一份修饰后的 mRNA（33 µL）和 miRNA 模拟物（14 µL），使其升温至室温 约3-5分钟，直至解冻。切勿在37 °C条件下解冻分装样品。使用微量离心机短暂离心。
- 将转染试剂置于室温下预热约3-5分钟。切勿使用37 °C水浴或培养箱。将管盖盖紧后上下颠倒2–3次以混匀试剂。在微型离心机中短暂离心以沉降至管底。
- 将279 µL RT转染缓冲液转移至无RNase的微量离心管中。加入31 µL转染试剂，终体积为310 µL。用移液器充分混匀，切勿涡旋振荡。室温孵育1分钟。
注意：此稀释后的转染试剂体积足以与步骤 3.2.3 中的修饰 mRNA 和 miRNA 模拟物分装液同时形成复合物。 - 向33 µL修饰mRNA中加入132 µL逆转录转染缓冲液，轻轻吹打混匀：终体积为165 µL。
- 向14 µL的miRNA模拟物分装液中加入102.6 µL的RT转染缓冲液。轻轻吹打混匀：终体积为116.6 µL。
- 将步骤 3.2.5 中稀释的转染试剂 165 µL 加入步骤 3.2.6 中稀释的修饰 mRNA 中，用移液器吹打混匀：终体积为 330 µL。
- 将3.2.5步骤中稀释的转染试剂116.6 µL加入3.2.7步骤中稀释的miRNA模拟物混合液中，充分混匀（终体积为233.2 µL）。室温孵育15分钟，使转染缓冲液与修饰的mRNA和miRNA模拟物形成复合物。
- 从低氧环境中取出细胞培养板2 培养箱中。将100 µL（1 µg）复合的修饰mRNA转染混合物逐滴加入每孔，滴加时覆盖整个孔表面。通过轻柔而充分地上下、左右振荡培养板，使转染复合物分散均匀。切勿旋转混匀培养板。
- 向每孔中逐滴加入66.7 µL（20 pmol）复合好的miRNA模拟物转染混合液，滴加时覆盖整个孔表面。通过轻柔而彻底地上下、左右振荡培养板，使转染复合物分散均匀。切勿旋转混匀培养板。
- 将转染的细胞放入三气培养箱中，置于O2 设定为5%（低氧）2将培养板放置后，通过轻柔但彻底地上下、再左右振荡培养板，重新分散转染复合物。
- 将4 mL重编程培养基移入15 mL锥形管中，并置于低氧培养箱内2 将培养瓶放入培养箱中，瓶盖稍松，过夜平衡。次日再添加 bFGF 和 B18R。
| 试管 1 - RNAiMax 稀释液（第一混合液） | ||
| 试剂 | 浓度 | 体积 |
| 转染缓冲液 | 279 µL | |
| RNAiMax（稍后加入第二步） | 10x | 31 µL |
| 总计：310 µL | ||
| （室温孵育 1 分钟） | ||
| 试管 2 - 修饰 mRNA 混合液（第二混合液） | ||
| 试剂 | 浓度 | 体积 |
| 修饰 mRNA 混合液 | 100 ng/µL（5x） | 33 µL |
| 转染缓冲液 | 132 µL | |
| 总计：165 µL | ||
| （加入与试管 1 中稀释后的 RNAiMax 等体积的溶液） | ||
| 试管 3 - miRNA 模拟物混合液（第三混合液） | ||
| 试剂 | 浓度 | 体积 |
| miRNA 模拟物混合液 | 5 pmol/µL（8.33x） | 14 µL |
| 转染缓冲液 | 102.6 µL | |
| 总计：116.6 µL | ||
| （加入与试管 1 中稀释后的 RNAiMax 等体积的溶液） | ||
表1：转染混合物的制备。
4. 转染期间更换重编程培养基（第2、4、6、8、10和12天）
- 转染后16–20小时，按3.1.1–3.1.2所述更换培养基。向重编程培养基分装液中加入bFGF至终浓度100 ng/mL，以及B18R至终浓度200 ng/mL。
- 每天通过配置为观察EGFP的显微镜监测mWasabi表达情况，以确认转染质量。
注意：mWasabi在第2天应仅微弱可见，且每次额外转染后荧光强度逐渐增强。
5. 隔日转染（第3、5、7、9、11和13天）
- 按照步骤3.2所述进行转染操作。转染当天不更换培养基。
- 准备4 mL重编程培养基，置于低氧培养箱中2 将培养箱中的培养物孵育至次日换液时达到平衡。在次日之前不要添加bFGF和B18R。
6. 最终转染后需执行的操作步骤
- 从第14天至约第17天，每天更换培养基。将7 mL重编程培养基预热至37 °C，加入bFGF至终浓度为100 ng/mL。
注意：最后一次转染后不再需要 B18R。第14天之后，无需再将培养基在低氧条件下过夜平衡。2 培养箱 - 使用移液管从所有孔中移除培养基。继续避免使用抽吸法。每孔加入2 mL添加了bFGF的重编程培养基。
- 在第17天和第18天，于倒置显微镜或解剖显微镜下观察重编程后的孔板。若因重编程效率较高导致克隆彼此紧密相邻而无法手动分离，则可选择执行下述步骤7中所述的重编程孔板传代操作以分离克隆。若克隆分布稀疏且界限清晰，则按照步骤8所述方法直接从重编程孔板中手动挑选克隆，并依据标准操作流程对诱导多能干细胞（iPSCs）进行亚培养。
7. 可选步骤：使用EDTA传代重编程孔中的细胞
- 将0.5 M EDTA储存液用DPBS稀释，配制0.5 mM EDTA溶液（EDTA）。使用0.22 µm真空过滤系统对EDTA溶液进行过滤除菌。
- 配制无饲养层的多能干细胞（PSC）培养基（例如， mTeSR1）按照制造商说明书操作。将32 mL PSC培养基预热至37 °C。
- 将两块6孔板的所有孔均按照生产商说明书用适用于hESC的细胞外基质（ECM）包被。用石蜡膜密封孔板，并在室温下孵育1小时。
- 吸出预热培养板中的ECM溶液，每孔加入2 mL PSC培养基。注意勿使孔表面干燥。将培养板置于一旁备用。
- 从两个重编程的孔中吸出重编程培养基，选择细胞集落较大且形态清晰的时间点（通常为第18天）。用1 mL EDTA冲洗一次，然后吸出。
- 每孔加入 1 mL EDTA，37 °C 孵育 4 分钟。
- 轻轻将培养板从培养箱中取出，放入生物安全柜中。
注意：此时细胞可能贴壁非常松散，容易脱落。 - 小心吸去两个孔中的EDTA。向经EDTA处理的每个孔中加入3 mL预热的PSC培养基。使用细胞刮棒轻轻但彻底地将两个孔中的细胞刮下。
- 使用血清学移液管轻轻吹打细胞悬液以分散较大的细胞团块。无需将所有细胞团块完全吹散，注意保留诱导多能干细胞（iPSC）细胞簇。
注意：接种较大的细胞团块不会影响iPSC克隆的生长。如果存在过大细胞团块，只需避免将其转移至下一培养皿即可。 - 使用血清学移液管，将经EDTA处理的每个孔中的细胞均匀分配，每孔吸取0.5 mL加入至包被有ECM的6孔板的各个孔中。
注意：不要合并重编程孔中的细胞（即， 重编程后的1号孔应均匀分配至第一个6孔板中，重编程后的2号孔应均匀分配至第二个6孔板中。 - 将培养板中的细胞移回低氧环境2 培养箱。为使细胞均匀分布，轻轻前后左右晃动每块培养板，切勿旋转摇晃。每日更换PSC培养基。
8. 挑选iPSC克隆
- 将15 mL PSC培养基预热至37 °C。按照制造商说明，用适用于hESC的ECM包被一个6孔板的所有孔。用石蜡膜密封平板，并在室温下孵育1小时。
- 吸除用于收集iPSC的孔中的培养基。用1 mL EDTA冲洗一次，然后吸除。每孔加入1 mL EDTA，于37°C孵育4分钟。在细胞孵育期间，吸除预热平板中的ECM溶液，并每孔加入2 mL预热的PSC培养基。将平板放置一旁备用。
- 轻柔地将待挑取iPSC的培养板从培养箱中取出，放入生物安全柜中。
注意：此时细胞可能黏附非常松散，容易脱落。 - 小心吸除EDTA。非常轻柔地每孔加入3 mL预热的PSC培养基，注意避免使iPSC克隆脱落。
- 将培养板转移至倒置显微镜或解剖显微镜下，以便更清晰地观察克隆。准备一支带有无菌吸头的1 mL移液器。将移液器按钮完全按下，然后用吸头轻柔刮取克隆，同时缓慢吸取液体以收集克隆。在挑取iPSC克隆时，应尽量减少培养基的吸入量。
- 将克隆转移至第8.2步中已包被ECM的培养板的单个孔中，上下吹打3–4次。重复此操作，直至挑取并转移6个克隆至独立孔中。若已执行第7步中所述的可选传代操作，则每个原始孔中最多挑取2个克隆。
- 使用标准的人类干细胞冻存方案冻存所有剩余孔中的细胞。若后续需要挑取更多克隆，可解冻并重新接种冻存的细胞。
9. 诱导多能干细胞的表征
- 进行TRA-1-60染色以分析重编程效率（第18天）。
注意：3个重编程孔中有2个用于后续挑取克隆，剩余1个孔可用于TRA-1-60染色。该操作可在实验台面上进行。- 用1 mL PBS洗涤重编程孔。加入预冷甲醇于-20 °C固定细胞5 min。
- 吸除甲醇。将孔干燥约2 min，注意避免过度干燥。当细胞变为半透明/哑光色时，即表示已充分干燥。
- 用1 mL PBS轻柔振荡洗涤3次，每次5 min。在洗涤过程中，配制3 mL含3%过氧化氢的PBS溶液。
- 吸除PBS。加入2 mL稀释的过氧化物溶液，室温轻柔振荡孵育15 min。同时配制4 mL封闭液：含10%牛血清白蛋白（BSA）的PBS。
- 吸除过氧化物溶液。用1 mL PBS轻柔振荡洗涤2次，每次5 min。
- 吸除PBS，向孔中加入2 mL封闭液，室温孵育1 h。
- 用1 mL PBS轻柔振荡洗涤3次，每次5 min。
- 将一抗（抗TRA-1-60抗体）用封闭液按1:100比例稀释，并加入0.05%叠氮化钠。每孔6孔板准备1 mL抗体稀释液。将抗体稀释液加入孔中，用封口膜包裹培养板以防止蒸发，4 °C轻柔振荡过夜孵育。
注意：如有需要，一抗孵育也可在室温下进行1 h，轻柔振荡。一抗稀释液最多可重复使用5次。 - 一抗孵育后，用1 mL PBS轻柔振荡洗涤3次，每次5 min。
- 将二抗（HRP标记的抗小鼠抗体）用封闭液按1:200比例稀释。将稀释后的二抗加入孔中，室温轻柔振荡孵育2 h。
- 吸除二抗稀释液，用1 mL PBS轻柔振荡洗涤3次，每次5 min。
- 在第三次洗涤期间，按照制造商说明配制底物溶液。最后一次洗涤后，吸除PBS，加入1 mL底物溶液，孵育至显色达到理想程度（约10 min）。
- 吸除底物溶液，用去离子水轻柔振荡冲洗5 min。
- 如需计数克隆。重编程效率 =（克隆数 / 接种的成纤维细胞数）× 100%。
- 如需长期保存，吸除染色后孔中的水分，在室温下静置过夜晾干。用封口膜密封干燥后的培养板，于4 °C保存，最长可达2年，以便日后评估重编程效率。
结果
从启动成纤维细胞重编程到首次冻存诱导多能干细胞（iPSC）的冻存管，通常需要约5–6周时间（图1）。重编程方案一般可分为两个阶段：第一阶段包括成纤维细胞培养及七次转染，每48小时使用一次重编程RNA混合物；第二阶段包括iPSC克隆的分离、扩增和鉴定。
在启动实验方案之前，应确保待重编程的成纤维细胞具有良好的质量。健康的成纤维细胞应呈纺锤形、双极性且具有折光性，倍增时间约为24小时。在第-2天接种于10 cm培养皿中的250,000个细胞，至第0天时应生长至40–60%融合度（图1，第0天），细胞数量约为6–10 × 105个。对于增殖较慢的细胞，可通过在第-2天和第0天以较高密度接种来弥补。
重编程接种至6孔板中的成纤维细胞应非常稀疏（图2，第1天）。首次转染后24小时，成纤维细胞将失去梭形形态，转变为更圆润的形状（图2，第2天），并在后续重编程过程中维持该形态。mWasabi mRNA的绿色荧光在第2天应仅微弱可见，并在第4天时亮度持续增强至清晰可见。mWasabi荧光的检测能力可能取决于显微镜的灵敏度和设置。在前三次转染期间（第1–6天），细胞密度将逐渐且持续增加，第7至第8天之间会出现明显的增殖高峰。到第10天时，细胞应基本达到汇合状态（图2，第10天）。诱导性多能干细胞（iPSC）克隆最早可在第11天出现（图2，第11天）；然而，部分情况下克隆可能直至第18天才可被观察到。通常在第15–18天，会出现大而明显的iPSC克隆，与周围未完全重编程的成纤维细胞有显著区别（图2，第15天和图3，第17天）。可通过多能性标志物TRA-1-60的免疫染色评估重编程效率（图3，第17天，TRA-1-60）。根据我们的经验，大多数成纤维细胞系每孔重编程后可产生数百个克隆（图3，插图B）。
接种密度不理想是本实验方案中重编程效率降低的最常见原因，通常与病变、衰老和/或高传代的成纤维细胞相关。如果接种密度过低，在重编程结束时会出现较大的无细胞空白区域（图4C），且iPSC克隆可能无法形成（图4D）。重编程细胞在第14天时应达到非常高的汇合度（比较图4A和4B与图2第14天）。同样，如果细胞接种过密或增殖过快，重编程效率也会显著降低。
为了保持患者来源的iPSCs的均一性，从单个克隆扩增细胞系至关重要。由于本方案中的重编程效率非常高，相邻的iPSC克隆可能彼此靠近形成并相互融合生长（图3，第15–17天）。这有时使得通过机械方法分离单个克隆以进行克隆扩增变得困难。我们发现，可先对重编程后的孔进行传代，并将其稀释接种至更大的培养区域。一个合适的传代比例是将一个重编程后的6孔板中的单孔细胞均匀分配至整个6孔板中。
稀释传代后，iPSCs 以克隆形式生长，并可轻易与成纤维细胞区分（图5，第18天）。最初，iPSC 克隆可能排列较为松散，单个细胞具有相对较大的细胞质区域。在随后的4–7天内，iPSCs 增殖并形成具有明确边界的典型紧密排列克隆。克隆内的单个细胞具有较大的核质比，并可见明显的核仁（图5，第22天）。每个孔中应形成大量克隆，仅具有典型 iPSC 形态的克隆应被挑选用于扩增。
图1：人成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）。 本文展示了一种人成纤维细胞重编程的示意图方案。首先将成纤维细胞以低密度传代至6孔板中的一个孔内，随后每隔48小时进行一次转染，共进行七次。每次转染后16–20小时更换培养基。重编程获得的iPSCs通常在第18天左右首次传代，克隆样细胞集落在第26天左右进行挑取。一般而言，由成纤维细胞衍生的iPSC细胞系可在第38天左右冻存，用于长期保存。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：重编程过程中每日的代表性图像。 在传代时，成纤维细胞的融合度应约为 40–60%，以启动重编程（第 0 天，细胞接种于 10 cm 培养皿中）。第一次转染（T1）发生在第 1 天，此时细胞应非常稀疏。次日（第 2 天），细胞形态将变得更加圆润。随着实验进程推进，细胞密度持续增加，诱导性多能干细胞（iPSC）集落最早可在第 11 天开始出现（以红色圆圈标出）。至第 15 天，iPSC 克隆将变得较大且边界清晰。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：使用重编程修饰mRNA和miRNA模拟物转染后的集落形成。 在第15–17天拍摄了代表性重编程过程的低倍显微图像。在最后一次转染后，重编程的诱导多能干细胞（iPSCs）将形成边界清晰的集落，集落体积逐渐增大并变得更加致密，与未完全重编程的周围成纤维细胞明显区分。对多能性标志物TRA-1-60进行免疫染色可显示iPSCs的存在（插图A），并通过计数单个孔内所有集落来计算重编程效率（插图B，可计数的集落以绿色圆圈标出）。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：重编程过程中接种密度不足的代表性图像。（A, B）重编程第14天时成纤维细胞密度过低的示例（与图2第14天对比）。（C）重编程第17天的低倍镜图像，红色圆圈标示出大面积无细胞区域。（D）同一孔细胞经固定并进行TRA-1-60染色，以确认因细胞密度过低导致整体重编程效率较差。比例尺 = 200 µm（A, B），1 mm（C, D）。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：iPSCs初次传代后的代表性图像。 在完成重编程修饰mRNA和miRNA模拟物的转染后，重编程细胞在第17–20天进行传代。iPSCs在PSC培养基中具有生长优势，能够迅速取代任何未完全重编程的成纤维细胞。最初，iPSCs会形成集落，可能呈现松散状态且边界不清晰。数天内，细胞迅速增殖，并呈现出典型的形态特征：细胞紧密排列，核质比高，集落边界清晰。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本方案描述了一种具有临床相关性的、非整合的、基于RNA的方法，可用于将正常及疾病相关的人成纤维细胞系重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），且效率极高。迄今为止，我们尝试使用该方案进行重编程的每一个人成纤维细胞系均获得了足够数量的高质量iPSCs，可用于后续实验。所获得的iPSCs可立即转移至无饲养层的培养条件下进行扩增。
用于重编程的成纤维细胞质量：
重编程的成功率在很大程度上取决于起始成纤维细胞的质量。理想情况下，应使用代数最低的成纤维细胞以获得最高的重编程效率。第2至第4代的成纤维细胞重编程效率最佳。尽管效率降低，第5至第8代甚至衰老的成纤维细胞仍可进行重编程。有时低代数的成纤维细胞无法获得，或患者样本携带阻碍正常生长的基因突变。在此情况下，可能需要优化初始接种密度。功能受损的成纤维细胞系在RNA转染过程中通常伴随更高的细胞死亡率。因此，在重编程第10至14天时，重编程孔中的细胞会显得稀疏，并可见较大的无细胞区域。若出现此情况，则需以更高的初始成纤维细胞数量重新启动重编程流程。对于大多数成人成纤维细胞系，每孔接种3,000个细胞（6孔板规格）通常效果稳定。然而，如我们先前发表的研究8所述，将接种数量增加至5,000–10,000个（衰老细胞系可增至50,000个）可能有助于改善疾病相关样本的重编程效果。相反，若细胞过早达到汇合状态，也可能对重编程产生抵抗。若在重编程RNA转染过程中细胞增殖过快（如某些原代新生儿成纤维细胞的情况），则应以每孔500个成纤维细胞的密度启动重编程8。
转染缓冲液的处理：
转染缓冲液（用减血清培养基配制，并调节pH至8.2）的pH值对于实现本重编程方案所需的最优转染效率至关重要。因此，建议采取多项措施以正确处理转染缓冲液。我们发现，即使转染缓冲液短暂暴露于空气中，也会影响其pH值。因此，应将转染缓冲液分装至螺口容器中，并尽量减少容器内的空气空间（我们通常使用5 mL或15 mL的螺口锥形管）。为进一步减少空气暴露，建议每份转染缓冲液分装样品最多用于两次转染。最后，由于温度会影响pH值，在组装转染复合物前，必须将转染缓冲液平衡至室温（RT）。切勿将转染缓冲液加热至37 °C。
iPSC 的传代：
尽管许多先前发表的方案建议在重编程结束时挑取单个iPSC克隆，但当重编程效率非常高或克隆聚集在一起时（这在我们的方案中很常见），该操作可能难以实现。因此，如果iPSC克隆彼此靠近，我们建议首先传代细胞，以分散重编程后的iPSC，然后再手动挑取克隆。执行这一早期传代步骤具有多个优势。分散后的克隆拥有更充足的生长空间，从而形成比原始孔中更大、更适合挑取的克隆，显著提高从单个克隆建立iPSC细胞系的成功率。我们还发现，成纤维细胞在共培养中尽管已被稀释，但额外的培养时间似乎可提升挑取所得iPSC克隆的整体质量。未完全重编程的成纤维细胞可能提供支持性的旁分泌因子，有助于iPSC的进一步稳定，并促进其向无饲养层细胞培养条件的顺利过渡。此外，成纤维细胞在mTeSR1培养基中培养时，其增殖能力相比iPSC具有选择性劣势。因此，在3–4次传代后，污染的成纤维细胞群体将迅速被稀释至可忽略的水平。
ROCK 抑制剂（如 Y-27632）常用于人诱导多能干细胞（iPSC）的常规培养。我们发现，某些 iPSC 系长期或频繁使用 Y-27632 培养可能对细胞整体质量产生不利影响。当采用集落传代方法（如使用 EDTA）时，iPSC 分离后无需添加 Y-27632 即可维持其存活率。我们已在所有人 iPSC 的分离、扩增及常规培养过程中完全取消在培养基中添加 Y-27632。
方案的局限性：
该RNA介导重编程方法的一个局限性在于制备重编程试剂的初始成本较高且过程复杂。尽管制备mRNA试剂的各项前期操作均为常规实验步骤，且已有文献报道（如PCR、体外转录、DNase处理、加帽、去磷酸化、纯化），但综合来看，mRNA试剂的制备过程相对耗时，技术难度不容忽视。本方案的另一主要挑战是需要每48小时转染细胞一次，这增加了重编程操作的劳动强度。如果仅需对少量患者样本进行重编程，这些因素可能成为限制条件。然而，如果首要目标是获得具有临床相关性的诱导多能干细胞（iPSCs）或实现极高的重编程效率，则所述的RNA介导重编程方法是理想选择。
综上所述，上述基于RNA的高效重编程方法依赖于待重编程体细胞类型转染效率的优化，具体方法见我们之前发表的文章8。本研究中提供的RNA转染方案已针对人原代成纤维细胞进行了高度优化，但也可根据其他细胞类型进行调整，以提高多种体细胞的重编程效率。
披露
I.K. 和 G.B. 是一项名为 "细胞重编程的方法与组合物"的专利申请的共同发明人，专利申请号为 PCT/US2016/063258。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院（T32AR007411-33）和科罗拉多大学皮肤疾病研究核心中心（P30AR057212）提供的经费支持。同时，我们感谢大疱性表皮松解症（EB）研究合作组织、EB医学研究基金会、治愈EB慈善机构、营养不良性大疱性表皮松解症研究协会（DEBRA）国际组织、比利时博杜安国王基金会的Vlinderkindje基金以及盖茨前沿基金的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PCR用质粒模板 | |||
| pcDNA3.3_KLF4 | Addgene | 26815 | |
| pcDNA3.3_SOX2 | Addgene | 26817 | |
| pcDNA3.3_c-MYC | Addgene | 26818 | |
| pcDNA3.3_LIN28A | Addgene | 26819 | |
| pCR-Blunt_hM3O | Addgene | 112638 | |
| pCR-Blunt_hNANOG | Addgene | 112639 | |
| pCR-Blunt_mWasabi | Addgene | 112640 | |
| 体外转录修饰mRNA及miRNA模拟物in vitro | |||
| 正向引物 | Integrated DNA Technologies | TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG | |
| 反向引物（订购为ultramer，4nmol规格） | Integrated DNA Technologies | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA | |
| (ARCA加帽) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G | New England Biolabs | S1411S | |
| Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix | Agilent | 600850-51 | |
| 5-甲基胞苷-5'-三磷酸 | Trilink Biotechnologies | N-1014 | |
| 南极磷酸酶 | New England Biolabs | M0289L | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| MEGAscript T7 转录试剂盒 | ThermoFisher Scientific | AM1334 | |
| 假尿苷-5'-三磷酸 | Trilink Biotechnologies | N-1019 | |
| Riboguard RNase抑制剂 | Lucigen | RG90910K | |
| RNA Clean & Concentrator | ZymoResearch | R1019 | |
| Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA模拟物 | Qiagen | MSY0000684 | |
| Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA模拟物 | Qiagen | MSY0000715 | |
| Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA模拟物 | Qiagen | MSY0000717 | |
| Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA模拟物 | Qiagen | MSY0000718 | |
| Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA模拟物 | Qiagen | MSY0000719 | |
| 水（无核酸酶，未经DEPC处理） | Fisher | AM9937 | 用于稀释修饰mRNA和miRNA模拟物 |
| 成纤维细胞培养与重编程 | |||
| 0.1%明胶溶于H2O | StemCell technologies | #07903 | |
| Stericup-GV 无菌真空过滤系统 | EMD Millipore | SCGVU05RE | 用于无菌过滤转染缓冲液和DPBS中的0.5 mM EDTA |
| 2-巯基乙醇 | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| 6孔板（组织培养处理） | Corning | 3516 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| 胎牛血清 | Fisher | 26-140-079 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子（FGF Basic） | ThermoFisher Scientific | phg0263 | |
| GlutaMax补充剂 | ThermoFisher Scientific | 35050061 | 用于培养基配制的谷氨酰胺补充剂 |
| 热灭活胎牛血清 | Gibco Technologies | 10438026 | |
| KnockOut血清替代物 | ThermoFisher Scientific | 10828010 | |
| Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂 | ThermoFisher Scientific | 13778500 | 本方案已针对Lipofectamine RNAiMAX转染试剂优化 |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 11095080 | |
| MEM非必需氨基酸 | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | ThermoFisher Scientific | 31985070 | 低血清培养基，用于调节pH至8.2配制转染缓冲液，500 mL |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | ThermoFisher Scientific | 31985062 | 低血清培养基，用于调节pH至8.2配制转染缓冲液，100 mL |
| 10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | 用无核酸酶水稀释配制1 M溶液，用于pH调节 |
| 水（无核酸酶，未经DEPC处理） | Fisher | AM9932 | 用于稀释NaOH和清洗pH计 |
| 青霉素/链霉素/两性霉素B混合液（Pen/Strep/Fungizone） | GE Healthcare | SV30079.01 | |
| 人重组层粘连蛋白-521（rhLaminin-521） | ThermoFisher Scientific | A29248 | 浓度为100 µg/mL，用作重编程过程的基质 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Life Technologies | 14190144 | |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA（含酚红） | Life Technologies | 2520056 | |
| 痘苗病毒B18R（CF） | ThermoFisher Scientific | 34-8185-86 | |
| iPSC培养 | |||
| Corning Matrigel hESC认证基质 | Corning | 354277 | 用于iPSC培养的细胞外基质（ECM） |
| EDTA，0.5 M储存液 | K&D Medical | RGF-3130 | 在DPBS中稀释至0.5 mM，过滤除菌，用于iPSC传代 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | 多能干细胞（PSC）培养基，可使iPSC相对于成纤维细胞具有生长优势 |
| 抗体与检测 | |||
| 兔抗小鼠（HRP偶联） | Abcam | ab97046 | |
| Tra-1-60（小鼠抗人） | Stemgent | 09-0010 | |
| 过氧化氢（30%） | LabChem | LC154301 | 用PBS稀释至3% |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Fisher | BP9703100 | |
| 磷酸盐缓冲盐水（PBS） | Hyclone | SH30258.02 | 以10x形式提供，稀释至1x使用 |
| VECTOR NovaRED 过氧化物酶底物试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4800 | |
| 特殊设备 | |||
| 描述 | 备注 | ||
| 生物安全柜 | |||
| 常规加湿组织培养孵育箱 | 使用数字计、fyrite或等效设备校准CO2 ，平衡孵育箱至5% CO2、37 °C。 | ||
| 三气加湿组织培养孵育箱 | 使用数字计、fyrite或等效设备校准CO2 ，平衡孵育箱至5% CO2、5% O2、37 °C。用于重编程过程。 | ||
| pH计 | 分辨率必须达到小数点后两位。如可能，专用于RNA实验。 | ||
| 倒置显微镜 | 配置为可观察EGFP以监测转染效率。 |
参考文献
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
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- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Judson, R. L., Babiarz, J. E., Venere, M., Blelloch, R. Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency. Nature Biotechnology. 27 (5), 459-461 (2009).
- Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
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- Hirai, H., et al. Radical acceleration of nuclear reprogramming by chromatin remodeling with the transactivation domain of MyoD. Stem Cells. 29 (9), 1349-1361 (2011).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. , e51943(2014).
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