补体成分C1q是一种在组织微环境中高表达的促炎分子，可与细胞外基质相互作用。本文介绍 一种检测结合于透明质酸的C1q如何影响细胞黏附的方法。
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方法文章
补体蛋白C1q与透明质酸在促进细胞黏附中相互作用的评估
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
越来越多的研究表明，肿瘤微环境在肿瘤生长和转移过程中发挥着主动作用。通过不同的信号通路，肿瘤细胞能够通过分泌刺激因子、趋化因子和细胞因子，有效招募基质细胞、免疫细胞和内皮细胞。反过来，这些细胞可通过释放促生长信号、代谢物以及细胞外基质成分，改变微环境的信号特性，从而维持肿瘤细胞的高增殖活性和转移能力。在此背景下，我们发现补体成分C1q在多种人类恶性肿瘤中局部高表达，当其与细胞外基质中的透明质酸（hyaluronic acid）相互作用时，显著影响从人类肿瘤标本中分离出的原代细胞的行为。本文描述 了一种检测与透明质酸（HA）结合的C1q如何影响肿瘤细胞黏附的方法，揭示了细胞外基质关键组分（此处为HA）的生物学特性可被生物活性信号所调控，进而促进肿瘤进展。
引言
肿瘤微环境（TME）影响癌症的发生与发展，因其可为细胞存活、生长和侵袭提供有利的生态位。识别TME中的新关键因子可能有助于发现用于靶向治疗的新型分子工具。TME包含一个复杂且动态的非恶性细胞网络，例如内皮细胞、成纤维细胞以及免疫系统细胞，这些细胞嵌入在由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和透明质酸等组成的周围细胞外基质（ECM）中。肿瘤细胞和非肿瘤细胞均可合成并分泌ECM成分，同时释放细胞因子、趋化因子、生长因子以及炎症和基质重塑相关的酶类，共同改变TME的物理、化学及信号特性。在这些组分中，透明质酸（HA）已被证实对肿瘤生物学具有关键作用。尽管HA化学结构简单，但其与HA结合分子（hyaladherins）共同以分子大小和浓度依赖的方式调控血管生成、免疫系统应答以及ECM的重塑1。
补体（C）系统也是局部肿瘤微环境（TME）的一部分，近年来受到越来越多的关注。补体系统包含一组可溶性和膜结合蛋白，参与针对非自身细胞、有害宿主成分以及病原体的第一道防御反应。在功能上，补体系统连接了先天性和适应性免疫系统的两个效应分支，以促进直接杀伤靶细胞或引发炎症反应2。补体激活可通过破坏癌细胞或抑制其增殖来抑制肿瘤生长，但越来越多的研究表明，补体系统也可能具有促肿瘤活性，例如维持慢性炎症、促进免疫抑制性微环境的形成、诱导血管生成以及激活与癌症相关的信号通路3。在此背景下，补体系统经典激活途径的第一个识别分子C1q，已被发现可在不依赖补体激活的情况下，在肿瘤微环境中发挥重要功能4。研究表明，多种人类恶性肿瘤可在局部表达C1q，后者除了促进血管生成和转移外，还可促进癌细胞的黏附、迁移和增殖5。有趣的是，C1q可与细胞外基质（ECM）的主要成分之一透明质酸（HA）相互作用。
我们开发了一种从肿瘤组织中分离原代癌细胞的技术。此外，我们构建了一种能够模拟肿瘤微环境的基质，特别是C1q与高分子量透明质酸之间的相互作用。C1q与透明质酸结合后可诱导肿瘤细胞的黏附。
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方案
在获得意大利的里雅斯特大学医院机构审查委员会对伦理问题的批准并取得患者的知情同意后，收集了患者的组织样本。
1. 肿瘤细胞的分离与培养（第1天）
- 从恶性胸膜间皮瘤（MPM）实体标本中分离人源间皮瘤细胞。使用刀具将组织精细切割成约 2–3 mm2 大小的碎片，加入 5 mL 消化液（由 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）添加 0.5 mM Ca2+/Mg2+、0.5% 胰蛋白酶和 50 µg/mL DNase I 组成），于 4 °C 过夜孵育。
- 肿瘤细胞分离与培养（第 2 天）
- 过夜孵育后，将消化后的组织置于 37 °C 培养箱中，轻轻振荡孵育 30 分钟。
- 离心（250 × g）后弃去消化液，加入 5 mL 含 3 mg/mL I 型胶原酶的 Medium 199（以 HBSS 配制），继续在 37 °C 轻轻振荡孵育 30 分钟。
- 加入 10% 经热灭活的胎牛血清（FBS）以终止酶反应。用 5 mL 移液管极其轻柔地重悬细胞，确保大部分细胞从组织中释放。随后将细胞悬液通过 100 µm 孔径滤膜过滤。
- 将细胞接种至 12.5 cm2 培养瓶中，在 37 °C 条件下使用人内皮细胞无血清培养基（HESF）进行培养，培养基中添加 10% FBS，并补充 EGF（10 ng/mL）、碱性 FGF（20 ng/mL）和 1% 青霉素-链霉素。
注意：每 2–3 天更换一次新鲜培养基。
2. HA 涂层（第1天）
- 将高分子量透明质酸（1.5 kDa）用双蒸水重悬，配制成浓度为 1 mg/mL 的溶液6。
- 用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（0.1 M，pH 9.6）将透明质酸储备液轻轻吹打混匀，稀释至 50 µg/mL 。
- 每孔加入 100 µL 稀释后的透明质酸储备液，于 4 °C 过夜包被 96 孔板。
注：透明质酸由意大利的里雅斯特大学生命科学系 Ivan Donati 教授惠赠7。
3. C1q 包被（第 2 天）
- 经过过夜孵育后，用真空抽吸法吸除处理过的孔中的液体，并用每孔100 µL的Dulbecco磷酸盐缓冲液（dPBS）洗涤96孔板。
- 将C1q（25 µg/mL或剂量反应实验中不同浓度）或BSA（作为阴性对照）与固定在塑料表面的HA结合：在含0.5% BSA和0.7 mM Ca2+/Mg2+的100 µL dPBS中，加入上述蛋白至终浓度为25 µg/mL，4 °C下过夜孵育。
- 用真空抽吸法吸除孔内液体，并用每孔100 µL的dPBS洗涤96孔板。
4. 使用 FAST DiI 进行细胞标记
- 将 1 × 105 个肿瘤细胞重悬于 500 µL 含 10 µg/mL 荧光染料 FAST DiI 的 dPBS 中。在 37 °C、5% v/v CO2 培养箱中孵育 15 分钟进行标记，每隔 5 分钟手动混匀一次。
- 为去除过量的 FAST DiI，加入 10 mL dPBS，轻轻吹打混匀，然后在 250 × g 条件下离心 7 分钟。将细胞沉淀重悬于 1 mL 含 0.1% BSA 的人内皮细胞无血清培养基中（HESF + 0.1% BSA）。
5. 细胞在HA/C1q基质上的黏附（第1天）
- 用真空抽滤法抽去包被了不同基质的孔板中的液体（这些孔板在步骤3.2中完成包被）。
- 将100 µL标记的细胞悬液加入包被的孔中，于37 °C、5% v/v CO₂条件下孵育35分钟2 培养箱
- 吸除上清液以去除非贴壁细胞。用含0.5% BSA、0.7 mM Ca的dPBS洗涤一次。2+ 和 0.7 mM Mg2+.
- 通过每孔加入 200 µL 的 10 mM Tris-HCl（pH 7.4）+ 0.1% v/v SDS 裂解贴壁细胞，并立即使用荧光读板仪（激发波长 544 nm，发射波长 590 nm）读取 96 孔板，定量依据为通过裂解不同数量标记细胞所绘制的标准曲线。
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结果
透明质酸（HA）是一种带负电荷的高分子量多糖，由重复的（β,1-4）-D-葡萄糖醛酸-（β,1-3）-N-乙酰-D-葡萄糖胺二糖单元组成（图1B）7。为检测HA在96孔板上的结合情况及其固定效率，采用生物素标记的透明质酸（bio-HA）进行实验。将不同浓度的bio-HA（范围从10 µg/mL至1 mg/mL）重悬于100 mM、pH 9.6的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中，于4 °C孵育过夜。
经过充分洗涤后，使用碱性磷酸酶标记的链霉亲和素检测结合在96孔板上的生物素化透明质酸（bio-HA），并以pNPP（1 mg/mL）作为底物对链霉亲和素的信号进行定量。采用酶标仪在405 nm波长下读取吸光值。bio-HA能够以剂量依赖的方式结合至96孔板（数据未显示）；50 µg/mL浓度达到饱和平台期，因此在本研究的实验中采用该浓度。
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讨论
我们描述 一种简便的方法，用于研究补体成分C1q如何通过与透明质酸相互作用，调控从人类肿瘤组织中分离出的原代细胞的行为。透明质酸（HA）和C1q在生理和病理条件下均大量存在于组织微环境中，参与多种细胞生物学过程。例如，已有研究表明，C1q存在于胎盘微环境中，在胎盘形成过程中促进绒毛外滋养层细胞对母体蜕膜的侵袭8。C1q也沉积于皮肤伤口愈合部位，促进组织再生和修复所必需的血管生成过程10。此外，C1q已在多种不同肿瘤组织中被发现4。高分子量透明质酸是血管生成和细胞增殖的天然屏障，而最近的研究证据表明，C1q除了在补体激活中的经典作用外，还能作为细胞外基质（ECM）分子发挥作用，促进细胞迁移。
本研究的新颖之处在于发现C1q与透明质酸（HA）的结合显著改变了肿瘤细胞与HA之间的相互作用。为建立该方法，我们设置了多个关键检测步骤。首先，我们使用生物素标记的HA确保了足量的HA已结合至培养板和ELISA板的塑料表面。Alcian蓝染色结果...
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披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
我们感谢Ivan Donati提供透明质酸（HA），感谢Leonardo Amadio和Gabriella Zito（IRCCS妇产科） "布尔洛·加罗福洛"，意大利的里雅斯特）以及安德里亚·罗曼诺（Andrea Romano，意大利的里雅斯特卡廷纳拉医院临床解剖与病理组织学操作单位）在组织样本采集方面的协助。我们还感谢尼科洛·莫罗西尼（Nicolò Morosini）在视频制备过程中的帮助，以及亚历克斯·科波拉（Alex Coppola）担任配音。本研究工作得到了意大利母幼健康研究所（IRCCS）资助项目的资助 "布尔洛·加罗福洛"意大利的里雅斯特（RC20/16）以及里雅斯特储蓄银行基金会向 R. Bulla 提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 µ微孔滤膜 | BD Falcon | 352360 | |
| 两性霉素B溶液（fungizone） | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | 免疫学科学 | GRF-15595 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| I型胶原酶 | 沃辛顿生化公司，商号 | MX1D12644 | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | 罗氏 | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | 免疫学科学 | GRF-10544 | |
| FAST DiI | 分子探针，Invitrogen，Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| 胎牛血清 | Gibco 赛默飞世尔科技 | 10270-106 | |
| 纤连蛋白 | 罗氏 | 11051407001 | |
| 细胞培养瓶 | 康宁 | 430639 | 无菌，带通气孔 |
| 庆大霉素溶液 | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| 汉克’Hanks 平衡盐溶液 (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | 添加EDTA、葡萄糖、青霉素-链霉素、庆大霉素和两性霉素B |
| 高分子量透明质酸 | Ivan Donati 教授惠赠 | ||
| 人内皮细胞无血清培养基 | Gibco 赛默飞世尔科技 | 11111-044 | 添加EGF（5 ng/mL），碱性成纤维细胞生长因子（10 ng/mL），以及 1% 青霉素–链霉素（Sigma-Aldrich） |
| 氯化镁 | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Hank's 平衡盐溶液的 199 培养基’盐 | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| 延时显微镜技术 | 尼康 | BioStation IM-Q 成像系统 | |
| Titertek Multiskan ELISA 阅读仪 | 流式实验室 | ||
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T4674 |
参考文献
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- Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
- Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346(2016).
- Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23(2015).
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- Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).
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