Method Article

猪全血表达编码和非编码 rna 类的鉴定

DOI:

10.3791/58689

⸱

November 28th, 2018

 ,  , 
1Virus and Prion Research Unit, National Animal Disease Center, USDA, Agricultural Research Service, 2ORAU/ORISE

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里, 我们提出了一个协议优化的处理编码 (mrna) 和非编码 (ncrna) 全球减少 rna-seq 库从一个单一的全血样本。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

创新且日益强大的下一代测序技术的出现为研究与所感兴趣的生物过程相关的潜在基因表达的能力开辟了新的途径。这些创新不仅使研究人员能够从编码影响细胞功能的基因的 mrna 序列中观察表达, 而且还可以观察到仍未翻译但仍具有调控功能的非编码 rna (ncRNA) 分子。尽管研究人员有能力观察 mrna 和 ncrna 的表达, 但研究的习惯是关注其中的一种。然而, 当研究对 mrna 和 ncrna 表达感兴趣时, 由于图书馆准备工作的差异, 很多时候它们使用单独的样本来检查编码或非编码 rna。这可能会导致需要更多的样品, 这可能会增加时间、消耗品和动物压力。此外, 它可能会导致研究人员决定只为一种分析准备样本, 通常是 mrna, 从而限制可以调查的生物问题的数量。然而, ncrna 跨越多个类, 具有影响 mrna 表达的调节作用。由于 ncrna 对基本的生物过程和感染过程中的紊乱很重要, 因此, 它们可能会成为有吸引力的治疗目标。这份手稿演示了一个改进的协议, 用于从一个完整的血液样本生成 mrna 和非编码 rna 表达库, 包括病毒 rna。优化该协议, 提高 rna 纯度, 增加结扎恢复甲基化 rna, 并省略大小选择, 以允许捕获更多的 rna 物种。

Introduction

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下一代测序 (ngs) 已成为研究生物有机体基因组水平变化的有力工具。ngs 方法的样品制备可以根据生物体、组织类型以及更重要的是研究人员渴望解决的问题而有所不同。许多研究转向 ngs 作为研究健康和患病个体 1、2、3、4等国家之间基因表达差异的一种手段。测序是在整个基因组的基础上进行的, 研究人员可以在某个时间点捕获特定遗传标记的大部分 (如果不是全部的话) 基因组信息。

观察到的最常见的表达标记是信使 rna (mrna)。rna-seq 准备库的最常用的过程是通过使用一系列纯化、碎裂和结扎5、6 来优化 mrna 分子恢复的。但是, 有关如何执行协议的决定在很大程度上取决于样本类型和对所述示例提出的问题。在大多数情况下, 总 rna 被提取;然而, 并不是所有的 rRNA 分子都有兴趣, 在 mrna 表达研究等情况下, 过度丰富的 rRNA 物种, 如核糖体 rRNA (rrna) 需要删除, 以增加可检测的转录与 mrna 相关的数量。去除丰富的 rrna 分子最流行和最广泛使用的方法是减少被称....

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Protocol

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动物规程得到了国家动物疾病中心 (usda-ars-nadc) 动物护理和使用委员会的批准。

1. 猪血样本收集

  1. 将血液样本收集到 rna 管中。收集约2.5 毫升或更多, 如果有较大的收集管可用。

2. 猪血样的加工

  1. 在室温 (15-25) 下, 以 5, 020 x克离心血液管10分钟。如果在离心前在室温下处理冷冻样品孵育管至少2小时。
  2. 去除上清液, 在颗粒中加入8毫升的无 rnase 水。关闭并旋涡颗粒, 直到它明显溶解。在室温下以 5, 020 x克离心样品管 10分钟, 以回收颗粒。丢弃所有上清液并保存颗粒。

3. 总 rna 和小 rna (mirna 分离试剂盒) 的有机提取

  1. 从步骤2.2 中将300μl 的裂解结合缓冲液移入颗粒, 开始总 rna 提取。
  2. 涡流并将混合物转移到新的标记 1.5 ml 离心管中。从试剂盒中加入30μl 的均质添加剂。将管子旋涡, 放在冰上10分钟。
  3. 取出试管, 从试剂盒中加入300μl 的酸性苯酚: 氯仿试剂。涡流管混合。在室温下以 10, 000 x g 离心5分钟。
  4. ....

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Results

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我们研究中的代表性样本是球蛋白和核子耗尽的全血样本。该协议的代表性结果包括一个全球枯竭的库样本, 其 rna 完整性数 (rin) 高于 7 (图 1a) 和26-280 纳米浓度比率在2或以上 (图 1b 和 1c)。样品结果的验证是使用分光光度计进行的, 以给出每个文库和基于芯片的电泳的最终浓度, 给出 rin 数以及一个峰值图, 显示哪些分子 (mrna 或 ncrna) 是根据在池和排序之前在库样本中插入大小。目前的研究重点是 mrna 和小的 ncrna。对于 mrna 文库, 代表性的结果是电泳峰值在 ~ 280 bp (图 1d)。对于小 nrna, 代表性结果由 ~ 40-400 bp (图 1e)

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Discussion

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该协议中优化的第一个关键步骤包括增加的球蛋白耗尽步骤, 这使得从全血样本中获得高质量的读数成为可能。在测序研究中使用全血的最大限制之一是样本中的大量读数, 这些读数将映射到全球分子, 并减少可映射到其他感兴趣的分子的读数.因此, 在优化样本类型的协议时, 我们需要加入一个全局损耗步骤, 以确保通过测序实现尽可能高的 mrna 和非编码 rna 捕获。根据 choi等人的程序, 所有样本都已耗尽, 以考虑到使用猪特异性血红蛋白 a 和 b (hba 和 hbb) 寡核苷酸的大量球蛋白转录体, 2014年14.另一个关键的步骤是使用一个核子消耗提取试剂盒, 它可以从我们的样品中去除不需要的 rna 分子, 同时保留实验感兴趣的多腺苷酸非编码和病毒 rna 分子。我们的库测序19。此外, 我们还能够使用单个样本, 通过去除小 rna 富集和大小选择步骤, 创建编码 (mrna) 和非编码 (小的和长) 的 rna 库。通过这样做, 我们能够最大限度地提高用于汇集的 rna 等价物, .......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

在本文中提及商品名称或商业产品仅用于提供特定信息, 并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部是一个机会平等的提供者和雇主。

Acknowledgements

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这项工作主要得到了美国农业部 nifa afri 2013-67015-21236 的支持, 部分得到了美国农业部 nifa afri 2015-66015-23216 的支持。这项研究得到了美国能源部 (美国能源部) 之间机构间协议任命的由橡树岭科学和教育研究所 (orise) 管理的农业研究服务研究参与方案的部分支持。美国能源部) 和美国农业部。orise 由橡树 ridge 相关大学根据指定经营实体合同号管理。de-ac05-6or2310。

我们要感谢 kay faaberg 博士的 hp-prrs 感染克隆, susan Brockmeier 博士为参与实验的动物提供了帮助, sue ohlendorf 博士为编写手稿提供了秘书协助。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PAXgene TubesPreAnalytix762165
分子生物学级水ThermoFisher10977-015
mirVana miRNA 分离试剂盒ThermoFisherAM1560
Rneasy MinElute 纯化试剂盒QIAGEN74204
100% 乙醇Decon Labs， Inc.2716
0.2 mL 薄壁管ThermoFisher98010540
1.5 mL RNase/DNase - 无 RNase -任何供应商
Veriti 96 孔热循环仪ThermoFisher4375786R
珠蛋白还原寡核苷酸 （α 1）任何供应商序列 GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
珠蛋白还原寡核苷酸 （α 2）任何供应商序列 TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
珠蛋白还原寡核苷酸 （β 1）任何供应商序列 AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
珠蛋白还原寡核苷酸 （β 2）任何供应商序列 GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X 寡核苷酸杂交缓冲液
-Tris-HCl，pH 7.6Fisher ScientificBP1757-100-KCl
Millipore Sigma60142-100ML-F
10X RNase H 缓冲液
 -Tris-HCl， pH 7.6Fisher ScientificBP1757-100
 -DTTThermoFisherY00147
 -MgCl2PromegaA351B
 -分子生物学级水ThermoFisher10977-015
RNase HThermoFisherAM2292
SUPERase-INThermoFisherAM2694Rnase抑制剂
EDTAMillipore SigmaE7889
离心机任何供应商
 2100电泳生物分析仪仪器安捷伦科技G2938C
安捷伦RNA 6000纳米试剂盒安捷伦科技5067-1511
捷伦高灵敏度DNA 试剂盒Agilent Technologies5067-4626
TruSeq 链式总 RNA 文库制备试剂盒，含 Ribo-Zero IlluminaRS-122-2201mRNA 试剂盒;人/小鼠/大鼠套装 A （48 个样本，12 个索引）
TruSeq 链式总 RNA 样品制备指南Illumina提供在线
RNAClean XP 微珠BeckmanCoulterA63987
AMPure XP 微珠MicroAmp
光学 8 管ThermoFisherN80105800.2 mL 薄壁管
MicroAmp 光学 8 管 ThermoFisherN801-0535
RNase/DNase - 无试剂储液槽任何供应商
SuperScript II 逆转录酶ThermoFisher18064-014
MicroAmp 光学 96 孔板ThermoFisherN8010560根据需要使用这些来代替 .3 mL 板
MicroAmp 光学胶膜ThermoFisher4311971
用于 Illumina 的 NEBNext 多重小 RNA 文库制备套装®（第 1 组） New England BiolabsE73005小 RNA 试剂盒
NEBNext 多重小 RNA 文库制备套装，用于 Illumina®（第 2 组） New England BiolabsE75805小 RNA 试剂盒
QIAQuick PCR 纯化试剂盒QIAGEN28104
96S 超级磁板ALPAQUAA001322
微量安

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
  2. Coble, D. J., et al.

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