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方法文章

猪全血中表达的编码与非编码RNA类别鉴定

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DOI：

10.3791/58689

⸱

2018年11月28日

 ,  , 
1Virus and Prion Research Unit, National Animal Disease Center, USDA, Agricultural Research Service, 2ORAU/ORISE

本文内容

摘要

本文介绍了一种优化的实验方案，可从单份全血样本中制备编码（mRNA）和非编码 （ncRNA）珠蛋白富集的RNA测序文库。

摘要

创新且日益强大的新一代测序技术的出现，为研究与特定生物学过程相关的基因表达机制开辟了新的途径。这些技术进步不仅使研究人员能够检测编码细胞功能相关蛋白的mRNA序列的表达，还能检测不翻译为蛋白质但具有调控功能的非编码RNA（ncRNA）分子。尽管研究人员具备同时检测mRNA和ncRNA表达的能力，但传统上大多数研究通常仅聚焦于其中一类。然而，当研究同时关注mRNA和ncRNA表达时，由于文库构建方法的差异，往往需要使用不同的样本分别分析编码RNA和非编码RNA。这可能导致需要更多的样本，从而增加实验时间、耗材成本以及实验动物的应激负担。此外，研究人员可能因此选择仅针对其中一类分子（通常是mRNA）进行建库，从而限制了可探索的生物学问题的数量。然而，ncRNA包含多个具有调控功能的类别，能够影响mRNA的表达。由于ncRNA在基本生物学过程中发挥重要作用，且在感染过程中这些过程的失调与疾病密切相关，因此ncRNA可能成为极具潜力的治疗靶点。本文介绍了一种改进的实验方案，可从单份全血样本中同时构建mRNA和非编码RNA（包括病毒RNA）的表达文库。该方案经过优化，提高了RNA纯度，增强了甲基化RNA的连接效率，并省略了 片段大小筛选步骤，从而能够捕获更多种类的RNA分子。

引言

下一代测序（NGS）已成为研究生物体基因组水平变化的有力工具。NGS 方法的样品制备可根据生物体种类、组织类型，以及更为重要的研究者希望解决的科学问题而有所不同。许多研究已采用 NGS 来分析不同状态个体（如健康与患病个体）之间基因表达的差异1,2,3,4。测序在全基因组范围内进行，使研究者能够在某一时间点捕获特定遗传标记的全部或绝大部分基因组信息。

最常观察到的表达标志物是信使RNA（mRNAs）。用于制备RNA-seq文库的最常用方法经过优化，通过一系列纯化、片段化和连接步骤来富集mRNA分子5,6。然而，具体实验方案的选择在很大程度上取决于样本类型以及针对该样本所提出的研究问题。在大多数情况下，首先提取总RNA；然而，并非所有RNA分子都是研究关注的对象，在mRNA表达研究等情形中，像核糖体RNA（rRNA）这类丰度过高的RNA种类需要被去除，以提高与mRNA相关转录本的可检测数量。目前最常用且广泛采用的去除高丰度rRNA的方法是去除带有polyA尾的RNA转录本，即所谓的polyA耗竭法7。该方法适用于mRNA表达分析，因为它不会影响mRNA转录本。然而，在关注非编码RNA或病毒RNA的研究中，polyA耗竭法也会同时去除这些分子。

许多研究选择专注于RNA序列文库构建，以检测mRNA表达（编码RNA）或特定类别的小分子或大分子非编码RNA。尽管已有其他类似我们的方法8可实现双样本制备，但在样本充足的情况下，多数研究仍倾向于从独立样本中分别制备文库用于不同分析。对于本研究这类项目，常规方法通常需要采集多个血液样本，从而增加实验耗时、耗材消耗以及动物应激。本研究的目标是利用动物全血，仅凭每头猪单份全血样本（2.5 mL），即可识别并定量分析健康猪与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）攻毒猪之间表达的各类mRNA和非编码RNA9,10。为实现这一目标，我们需要优化常规的RNA提取与文库构建流程，以从单一样本中获得适用于mRNA和非编码RNA（ncRNA）表达分析的高质量数据11。

这促使人们需要一种能够同时进行mRNA和非编码RNA分析的实验方案，因为现有的标准试剂盒和RNA提取及文库构建方法主要针对mRNA，通常包含poly-A富集或去除步骤12。这一步骤将导致无法从样本中回收非编码RNA或病毒转录本。因此，亟需一种优化的方法，能够在不进行poly-A去除的前提下实现总RNA的提取。本文所提出的方法已针对全血样本类型进行了优化，可用于构建适用于大小不同的mRNA和非编码RNA（ncRNA）的测序文库。该方法经过优化，可实现对所有可检测的非编码RNA进行分析，同时保留病毒RNA以供后续研究13。总体而言，我们优化后的文库制备方案使得从单份全血样本中同时研究多种RNA分子成为可能。

采用该方法的总体目标是建立一种能够从一份全血样本中同时收集非编码RNA和mRNA的技术流程。这使得我们能够在研究中为每只动物仅使用一份样本即可获得mRNA、ncRNA以及病毒RNA9。最终，这种方法可在不增加动物使用成本的前提下促进更多科学发现，并更全面地反映每个个体样本的基因表达情况。所描述的方法不仅可用于分析基因表达的调控因子，还支持利用单份全血样本开展mRNA与非编码RNA表达之间的相关性研究。本研究采用该方案检测了9周龄雄性商用猪在病毒感染后基因表达的变化及潜在的表观遗传调控因子。

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方案

动物实验方案已获得美国农业部农业研究局国家动物疾病中心（USDA-ARS-NADC）动物护理和使用委员会的批准。

1. 猪血液样本的采集

  1. 将血液样本采集至RNA专用采血管中。若使用较大规格的采集管，采集量应为约2.5 mL或更多。

2. 猪血液样本的处理

  1. 将血液管在5,020 x g下离心 g 室温（15–25 °C）孵育10分钟。若处理冷冻样本，将试管于室温孵育 最低值 离心前2小时
  2. 移去上清液，向沉淀中加入 8 mL 无 RNase 水。盖紧管盖并涡旋振荡，直至沉淀完全溶解。将样品管在 5,020 x g 室温下静置10分钟以回收沉淀。弃去全部上清液，保留沉淀。

3. 总RNA和小RNA的有机提取（miRNA提取试剂盒）

  1. 从步骤2.2的沉淀中开始总RNA提取，用移液器加入300 µL裂解结合缓冲液。
  2. 涡旋混匀后，将混合物转移至新标记的1.5 mL离心管中。加入试剂盒中的30 µL匀浆添加剂。涡旋振荡管子，并置于冰上孵育10分钟。
  3. 取出管子，加入试剂盒中的300 µL酸性酚:氯仿试剂。涡旋振荡以充分混匀。在室温下以10,000 x g 离心5分钟。
  4. 小心吸取上层水相（300–350 µL）至新的离心管中。记录该体积，用于下一步操作。

4. 总RNA提取步骤

  1. 根据水相回收量（300–350 µL），向水相中加入1.25倍体积的100%乙醇（约375 µL）。使用移液器混匀样品。
  2. 为每个样品设置新的收集管，并装入过滤柱。将约675 µL裂解液/乙醇混合物移入过滤柱中。
    注意：单次加入过滤柱的液体体积不得超过>700 µL。若体积较大，应分次加入。
  3. 在10,000 × g 条件下短暂离心（约15–20秒），使液体通过滤膜。切勿使用更高转速离心。
  4. 弃去穿滤液，如有必要，将剩余的裂解液/乙醇混合物分次加入，继续离心，直至全部上样。保留同一过滤柱和收集管用于下一步操作。
  5. 向过滤柱中加入700 µL试剂盒中的洗涤液1，短暂离心（约10秒）使液体通过滤膜。弃去穿滤液，保留同一过滤柱和收集管。
  6. 加入500 µL洗涤液2/3，离心使液体通过过滤柱。弃去穿滤液。重复洗涤步骤一次。
  7. 在同一收集管中，再额外离心60秒，以去除过滤柱中残留的液体。随后将过滤柱转移至新的收集管中。
  8. 向过滤柱中心加入100 µL预热（95 °C）的无核酸酶水，于台式离心机最大转速离心约20–30秒。
    注意：RNA存在于洗脱液中，可直接用于后续实验，或储存于-20 °C及以下。本步骤未进行小分子RNA的富集。

5. 珠蛋白去除（基于针对猪全血样本优化的方案）14,15

注意：进行珠蛋白减少的目的是避免文库中映射到珠蛋白基因的读段过多，从而降低可用于映射到其他更感兴趣基因的读段数量14,15。

  1. 珠蛋白还原寡核苷酸杂交
    1. 通过将提取的样品加入到一个0.2 mL薄壁无核酸酶反应管中，进行RNA变性（6 µg RNA样品，最大体积7 µL），并在热循环仪中70 °C孵育2分钟。首次变性步骤后立即冰浴对保持RNA最佳质量至关重要。无需进行DNase处理。
    2. 在管子冷却的同时，准备400 µL的10倍珠蛋白还原寡核苷酸混合液：每种HBA寡核苷酸（5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3' 和 5'-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA-3'）各取100 µL，浓度为30 µM；每种HBB寡核苷酸（5'- AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3' 和 5'- GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3'）各取100 µL，浓度为120 µM，每反应最终浓度为7.5 µM HBA 寡核苷酸和30 µM HBB 寡核苷酸。同时配制10倍寡核苷酸杂交缓冲液：100 mM Tris-HCl，pH 7.6；200 mM KCl。
    3. 配制杂交混合液：6 µg RNA样品（最大体积7 µL），加入2 µL上述400 µL 10倍珠蛋白还原寡核苷酸混合液（终浓度为2倍），1 µL 10倍寡核苷酸杂交缓冲液（终浓度为1倍），再用无核酸酶水补足至终体积10 µL。
    4. 将热循环仪设为70 °C孵育5分钟，立即降温至4 °C，随后进行RNase H消化步骤。
  2. RNase H消化
    1. 将10倍RNase H（10 U/µL）用1倍RNase H缓冲液稀释至1倍RNase H。
      注：RNase H缓冲液为10倍浓度，使用前需用1倍RNase H缓冲液稀释至1倍。
    2. 配制RNase H反应混合液：2 µL 10倍RNase H缓冲液，1 µL RNase抑制剂，2 µL 1倍RNase H，以及5 µL无核酸酶水，总体积为10 µL。
    3. 将珠蛋白还原杂交后的样品与10 µL RNase H反应混合液充分混匀，在37 °C消化10分钟，随后冷却至4 °C。
    4. 向每个样品中加入1.0 µL 0.5 M EDTA以终止消化反应，并立即进入纯化步骤。
  3. RNase H处理后的总RNA纯化
    1. 根据制造商说明书，使用基于二氧化硅膜的洗脱纯化试剂盒对RNase H处理后的RNA进行纯化。预混缓冲液：对于温和洗涤缓冲液，加入44 mL 100%乙醇。
    2. 不要将样品转移至新管。加入80 µL无RNase水和350 µL裂解缓冲液。向稀释后的RNA中加入250 µL 100%乙醇，并用移液器充分混匀。
      注：不要离心。立即进入步骤5.3.3。
    3. 将700 µL样品转移至置于2 mL收集管中的洗脱滤芯，以收集穿流液。在≥ 8,000 x g条件下离心15秒。弃去穿流液。
    4. 将洗脱滤芯转移至新的2 mL收集管中。向滤芯中加入500 µL温和洗涤缓冲液，在≥ 8,000 x g条件下离心15秒，以洗涤滤芯膜。弃去穿流液。在步骤5.3.5中重复使用该收集管。
    5. 使用同一样品管，向滤芯中再加入500 µL 80%乙醇。此次在≥ 8,000 x g条件下离心2分钟。收集洗脱柱用于下一步，弃去穿流液和收集管。
    6. 将上一步的洗脱滤芯放入新的2 mL收集管中。打开滤芯盖子，在最大转速下离心5分钟，以干燥离心柱膜并防止乙醇残留。弃去穿流液和收集管。
      注：为避免损坏，请将盖子倾斜，使其朝向与转子旋转方向相反。
    7. 取干燥后的滤芯，放入新的1.5 mL收集管中。向滤芯膜中心加入14 µL无RNase水，确保液体直接加至膜中心。在最大转速下离心60秒，以洗脱RNA。
  4. 评估珠蛋白还原后RNA样品的质量（步骤6）。随后进行mRNA样品制备（步骤7）和小RNA文库构建（步骤8）16,17。
    注：珠蛋白还原后的RNA样品可暂存于-20 °C，但长期保存建议存放于-80 °C。

6. RNA 的评估

  1. 使用分光光度计测定RNA浓度。检测260 nm和280 nm波长处的吸光度比值。RNA纯度较高的样品其比值约为2或更高，较低的比值表明存在一定程度的污染。仪器利用该比值计算RNA浓度，单位为ng/µL。
  2. 通过在合适的芯片上使用1 µL（100 ng）样品来评估RNA质量。最终产物的RIN值应约为2或更高，mRNA单端测序文库在约280 nt处应出现峰；小RNA文库在143处的峰对应于miRNA。

7. 用于mRNA和长链非编码RNA文库的链特异性总RNA样本制备。16

  1. 注意： 将洗脱缓冲液和rRNA去除磁珠置于室温。预先标记0.2 ml薄壁PCR管（也可使用PCR板）。实验步骤依据试剂盒说明书进行16.
    1. 从 4 µL 去除珠蛋白的 RNA 开始。每管加入 6 µL 无核酸酶水、5 µL rRNA 结合缓冲液和 5 µL rRNA 去除混合液（1st 移液混匀后盖上管盖。将离心管放入配备100 °C加热盖的PCR仪中，68 °C孵育5分钟。取出后室温静置60秒。
    2. 通过涡旋重悬rRNA去除磁珠；将35 µL磁珠加入新的(2nd) PCR管中，并从第1个样本开始用移液器加样st 2中的珠子上的试管nd 管。孵育 2nd 将PCR管在室温下放置3分钟，然后置于磁力架上7分钟。
      注意： 通过移液充分混匀每个样品，以实现最佳的rRNA去除效果。升高或降低试管架可能有助于加快分离过程。
    3. 将上清液从2nd PCR管与匹配的3号rd 将PCR管置于磁力架上，静置至少60秒。仅当磁珠未完全吸附至管壁时，重复转移至新的PCR管。
    4. 涡旋混匀样本纯化磁珠；向每份样品中加入99 µLrd PCR管中，室温静置15分钟。置于磁力架上5分钟，确保磁珠移至管壁侧边。用移液器吸除上清液。
    5. 保持 3rd 将管子置于磁力架上。加入200 µL 70%乙醇，注意不要晃动磁珠。静置至少30秒，用移液器吸弃上清液。重复该步骤。
    6. 将样本置于磁力架上，室温静置干燥15分钟。将试剂盒洗脱缓冲液于600 × g离心5秒。 g. 取出离心管，加入11 µL洗脱缓冲液，充分混匀。室温下在实验台上孵育2分钟，然后置于磁力架上至少5分钟。
    7. 从3中转移8.5 µL上清液rd 到一个新的（4th) PCR管中，加入8.5 µL试剂盒中的Elute/Prime/Fragment High混合液，充分混匀。盖紧管盖，置于预热过热盖的PCR仪中，94 °C孵育8分钟，然后保持在4 °C。取出后短暂离心。
  2. 合成第一条链cDNA
    1. 将试剂盒中的第一链合成混合液置于室温下解冻，随后以600 × g离心 g 5秒。将50 µL逆转录酶转移至第一链合成混合液中。逆转录酶可按1:9的比例加入第一链合成反应体系。
    2. 将8 µL反转录酶/第一链合成混合液用移液器加入含有样本的第4个管中。盖紧管盖并离心600 x g 5秒。放入预热至100 °C的PCR仪中，运行程序：25 °C孵育10分钟，42 °C孵育15分钟，70 °C孵育15分钟，然后置于4 °C保存。每孔终体积约为25 µL。立即进行下一步操作。
  3. 合成第二链 cDNA
    1. 将末端修复试剂（ERR）和第二链合成混合液（SSM）恢复至室温，于600 × g离心5秒。按1:50比例将ERR与重悬缓冲液混合。打开4th 将5 µL稀释后的ERR和20 µL SSM加入管中；用移液器充分混匀。最终体积约为50 µL双链cDNA。
    2. 盖上盖子，在PCR仪中于16 °C孵育1小时。循环结束后，取下盖子，置于实验台上静置至室温。
  4. ds cDNA 纯化步骤
    1. 首先通过涡旋振荡混合固相可逆固定化（SPRI）顺磁性磁珠。将90 µL磁珠转移至4中的样品th将管（双链cDNA）混匀，最终体积为140 µL。室温静置15分钟，然后置于磁力架上孵育约5分钟。从每孔中移除约135 µL上清液，每孔应剩余5 µL。
    2. 将离心管置于磁力架上，加入200 µL 80%乙醇洗涤。静置30秒后，移除并弃去上清液。重复洗涤步骤一次。将离心管继续留在磁力架上静置15分钟，使其充分干燥。
    3. 将重悬缓冲液在 600 x g 室温放置5秒后，从支架上取下离心管。向管中加入17.5 µL重悬缓冲液并混匀。室温孵育2分钟，然后转移至磁力架上静置5分钟。
    4. 将含有双链 cDNA 样品的上清液 15 µL 移液至一组新的（5th0.2 mL 薄壁管。请立即进行下一步操作，或密封后于 -15 °C 至 -25 °C 保存，保存时间不超过 7 天。
  5. 腺苷酸3'末端
    1. 用移液器将2.5 µL室温重悬缓冲液加入样本管中，然后加入12.5 µL解冻的A尾化反应混合液。通过移液操作充分混匀。
      ​注意：未使用加A尾对照。
    2. 盖上盖子，放入预热至100 °C的PCR仪中孵育。先在37 °C下运行30分钟，然后在70 °C下运行5分钟，期间保持加热盖开启。最后让PCR仪在4 °C下静置。
  6. 连接接头引物
    1. 将RNA接头管和终止连接缓冲液混合物置于室温。每管均以600 x g离心 g 5 秒。将连接反应混合物置于冰箱中保存，直至使用。应事先了解用于加标签的样本混合安排。
    2. 向每个样品管中加入 2.5 µL 重悬缓冲液和 2.5 µL 连接反应混合液。然后向每个样品管中移液 2.5 µL 合适的 RNA 接头。接头的选择应根据所选试剂盒的制造商说明书进行。
    3. 重悬并涡旋混合，280 × g 离心1分钟 g在30 °C下于热循环仪中孵育10分钟。向样品中加入5 µL终止连接缓冲液以终止反应，并充分混匀。
    4. 开始纯化：将SPRI顺磁性磁珠涡旋混匀60秒。向每管中加入42 µL磁珠，充分混匀后室温孵育15分钟。
    5. 将离心管转移至磁力架上，静置至液体变澄清（约5分钟）。液体澄清后，移除并弃去79.5 µL上清液。保持离心管在磁力架上，加入200 µL 80%乙醇进行洗涤。静置至少30秒，然后移除并弃去上清液。重复洗涤步骤一次。继续将离心管置于磁力架上约15分钟，以充分干燥。洗涤过程中切勿扰动磁珠。
    6. 向样本管中加入 52.5 µL 重悬缓冲液，混匀至磁珠完全重悬。室温孵育 2 分钟。将样本管放回磁力架，静置至液体澄清（约 5 分钟）。
    7. 静置后，用移液器轻轻吸取50 µL上清液至新的（6th) 管中。加入50 µL涡旋混匀的SPRI磁珠，室温孵育15分钟。
    8. 将样品置于磁力架上，静置至液体变澄清（约5分钟）。弃去上清液95 µL，每管保留5 µL。
    9. 将离心管置于磁力架上，加入200 µL 80%乙醇洗涤。静置30秒后，移除并弃去上清液。重复洗涤一次。将离心管在磁力架上干燥15分钟。
    10. 加入22.5 µL重悬缓冲液，混匀至磁珠完全悬浮。室温孵育2分钟，然后置于磁力架上直至液体变澄清（约5分钟）。用移液器将20 µL样品转移至新的PCR管中（7th).
  7. 将所需的试剂盒组分恢复至室温。从试剂盒中取 5 µL PCR 引物混合液和 25 µL PCR 预混液加入样本中（7th 含有索引样本的PCR管。混合样本并盖紧管盖。
    1. 将试管放入预热的热循环仪中。运行程序：98 °C 预变性 30 s，然后进行15个循环：98 °C 变性 10 s，60 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 30 s，最后72 °C 延伸 5 min。4 °C 保存。
  8. 向样本管中加入50 µL充分混匀的SPRI磁珠，用移液器吹打混匀。室温孵育15分钟。
    1. 将离心管置于磁力架上，孵育至液体变澄清（约5分钟）。弃去上清液95 µL，每管保留5 µL。
    2. 将离心管置于磁力架上，加入200 µL 80%乙醇洗涤。静置至少30秒，然后移除并弃去上清液。重复此洗涤步骤一次。继续置于磁力架上静置15分钟，以充分干燥。
    3. 加入32.5 µL重悬缓冲液，混匀至磁珠完全重悬。室温孵育2分钟，然后置于磁力架上直至液体变澄清（约5分钟）。用移液器将每管中的30 µL样品转移至新的PCR管中。
    4. 使用适当的芯片重复步骤 6.1 和 6.2 以评估 DNA 的数量和质量，然后进入混合样本步骤（步骤 9）。

8. sncRNA 的小RNA文库构建。17

注意：实验步骤依据生产商说明书17。

  1. 使用约 220 ng - 1.1 µg/µL 的珠蛋白减少型 RNA 样品（4 µL）开始小 RNA 文库制备。
  2. 接头连接
    1. 通过充分混合 1 µL 接头、2 µL 无核酸酶水和 4 µL 珠蛋白减少型 RNA 样品来连接 3'-接头。在 70 °C 下孵育 2 分钟，然后立即置于冰上。
    2. 加入 10 µL 2x 连接缓冲液和 3 µL 连接酶混合物，混匀后在 16 °C 下孵育 18 小时。
      ​注意：对于关注甲基化 RNA 物种（如 piwi RNA）的研究，建议在较低温度 16 °C 下将样品孵育时间延长至 18 小时。较长的孵育时间可提高连接效率，这是由于在 3' 接头连接阶段存在特定类型的修饰所致。
    3. 向连接反应混合物中加入 1 µL 反转录引物（溶于 4.5 µL 无核酸酶水中），以防止过量 3' 接头形成接头二聚体。
    4. 在预热的热循环仪中孵育，程序设置为：75 °C 5 分钟，37 °C 15 分钟，25 °C 15 分钟，最后保持在 4 °C。
    5. 将每份样品中预稀释的 5'-接头 1 µL 在热循环仪中于 70 °C 变性 2 分钟，然后立即置于冰上。
    6. 加入 1 µL 变性后的 5'-接头、1 µL 10x 5' 连接缓冲液和 2.5 µL 5' 连接酶。混匀后在 25 °C 下孵育 1 小时。
  3. cDNA 合成与扩增
    1. 通过移液将 30 µL 已连接 5′/3′-接头的 RNA、8 µL 第一链缓冲液、1 µL RNase 抑制剂和 1 µL 反转录酶充分混合。在 50 °C 下孵育 60 分钟。随后立即进行 PCR 扩增，或在 70 °C 下加热灭活 15 分钟后于 -20 °C 保存。
    2. 向 40 µL 反转录反应产物中加入 50 µL PCR 主混合液、2.5 µL RNA PCR 引物、2.5 µL 指定的 RNA PCR 引物索引（index），并用无核酸酶水补足至总体积 100 µL。通过移液混匀。在热循环仪中运行 PCR，循环条件如下：94 °C 初始变性 30 秒；进行 11 个循环（94 °C 15 秒，62 °C 退火 30 秒，70 °C 延伸 15 秒）；最后在 70 °C 延伸 5 分钟；样品可在 4 °C 下暂存于热循环仪中。
    3. 注意：添加索引的目的是用于样品混合（pooling）。
  4. 样品纯化
    1. 从 DNA 纯化试剂盒中取 500 µL 结合缓冲液（5 M Gu-HCl，30% 异丙醇）加入 100 µL PCR 扩增产物中，以促进样品有效结合至离心柱膜上。
      注意：若结合缓冲液含有 pH 指示剂，请检查混合液颜色是否为黄色。
    2. 将 600 µL 样品与结合缓冲液的混合液移入置于 2 mL 收集管中的滤柱内，在台式离心机中以 17,900 x g 离心 30-60 秒，弃去穿滤液。
    3. 用试剂盒提供的洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5，80% 乙醇）0.75 mL 洗涤滤柱（仍置于同一收集管中），在台式离心机中以 17,900 x g 离心 30-60 秒，弃去穿滤液。再额外离心 60 秒以干燥滤柱。
    4. 将滤柱转移至一个新的 1.5 mL 收集管中。加入 30 µL 洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.5），静置 60 秒，然后在台式离心机中以 17,900 x g 离心 60 秒。
  5. 使用合适的 DNA 芯片重复步骤 6.1 和 6.2 以评估样品质量。随后进入样品混合步骤（步骤 9）。

9. 测序样本混合

  1. 根据制造商说明16,17，通过设置并标记新离心管（或96孔PCR板）来混合带有条形码且已通过质控的样本，用于容纳mRNA或ncRNA样本。将每个条形码标记的10 nM文库中的13 µL转移至对应的离心管（或新板中的对应孔）。提交混合后的样本进行测序时，若样本将在同一芯片上运行，务必选择相似的读长。

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结果

本研究中的代表性样本为珠蛋白和核糖体RNA耗竭的全血样本。该实验方案的代表性结果为获得珠蛋白耗竭的文库样本，其RNA完整性指数（RIN）高于7。图1a）以及260/280 nm浓度比值达到或高于2（图1b 和 1c）。使用分光光度计对样本结果进行验证，以确定每个文库的最终浓度，同时采用基于芯片的电泳测定RIN值，并生成峰图，显示在文库样本混合与测序前根据插入片段大小所捕获的分子（mRNA或ncRNA）类型。本研究仅关注mRNA和小分子ncRNA。对于mRNA文库，代表性结果为电泳图谱中约280 bp处的峰图1d）。对于小的非编码RNA，代表性结果包括大小约为100-400 bp的多个峰图1e），其中约1...

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讨论

该方案得以优化的第一个关键步骤是增加了珠蛋白耗竭步骤，这使得从全血样本中获得高质量的测序读长成为可能。在测序研究中使用全血的最大限制之一是样本中会有大量测序读长比对到珠蛋白分子上，从而减少能比对到其他目标分子上的读长数量。18因此，在优化适用于我们样本类型的实验方案时，需要加入珠蛋白耗竭步骤，以通过测序实现尽可能高的mRNA和非编码RNA捕获效率。所有样本均采用针对猪特异性的血红蛋白A和B（HBA和HBB）寡核苷酸，根据Choi所述方法进行珠蛋白耗竭处理，以消除高水平珠蛋白转录本的影响。 等, 201414另一个关键步骤是使用了核糖体耗竭提取试剂盒，该试剂盒能够去除样本中不需要的RNA分子，同时在文库中保留实验关注的聚腺苷酸化的非编码RNA和病毒RNA分子，用于后续测序19此外，我们通过去除小RNA富集和片段大小选择步骤，能够利用单个样本同时构建编码（mRNA）和非编码（小片段和长片段）RNA文库。通过这一改进，我们最大限度地增加了可用于文库合并的RNA等分量，并确保送测样本的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

本文提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，并不构成美国农业部的推荐或认可。美国农业部为平等机会提供者和雇主。

致谢

本工作主要由美国农业部国家食品与农业研究所农业与食品研究计划（USDA NIFA AFRI）项目2013-67015-21236资助，部分由USDA NIFA AFRI项目2015-67015-23216资助。本研究部分得到了农业研究局科研参与项目的资助，该项目由橡树岭科学与教育研究所（ORISE）通过美国能源部（DOE）与美国农业部之间的跨部门协议管理。ORISE由橡树岭联合大学根据DOE合同编号DE-AC05-06OR2310进行管理。

我们感谢 Kay Faaberg 博士提供高致病性 PRRSV 感染性克隆，感谢 Susan Brockmeier 博士在实验所用动物方面的协助，以及 Sue Ohlendorf 在手稿准备过程中提供的秘书工作支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PAXgene 采血管PreAnalytix762165
分子生物学级水ThermoFisher10977-015
mirVana miRNA 提取试剂盒ThermoFisherAM1560
RNeasy MinElute 纯化试剂盒QIAGEN74204
100% 乙醇Decon Labs, Inc.2716
0.2 mL 薄壁管ThermoFisher98010540
1.5 mL 无 RNase/DNase 管任意供应商
Veriti 96 孔梯度 PCR 仪ThermoFisher4375786R
珠蛋白还原寡核苷酸（α 1）任意供应商序列 GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
珠蛋白还原寡核苷酸（α 2）任意供应商序列 TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
珠蛋白还原寡核苷酸（β 1）任意供应商序列 AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
珠蛋白还原寡核苷酸（β 2）任意供应商序列 GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X 寡核苷酸杂交缓冲液
-Tris-HCl，pH 7.6Fisher ScientificBP1757-100
-KClMillipore Sigma60142-100ML-F
10X RNase H 缓冲液
 -Tris-HCl，pH 7.6Fisher ScientificBP1757-100
 -DTTThermoFisherY00147
 -MgCl2PromegaA351B
 -分子生物学级水ThermoFisher10977-015
RNase HThermoFisherAM2292
SUPERase-INThermoFisherAM2694RNase 抑制剂
EDTAMillipore SigmaE7889
微量离心机任意供应商
 2100 电泳生物分析仪Agilent TechnologiesG2938C
Agilent RNA 6000 Nano 试剂盒Agilent Technologies5067-1511
Agilent 高灵敏度 DNA 试剂盒Agilent Technologies5067-4626
TruSeq 链特异性总 RNA 文库构建试剂盒（含 Ribo-Zero ）IlluminaRS-122-2201mRNA 试剂盒；人/小鼠/大鼠 Set A （48 个样本，12 个索引）
TruSeq 链特异性总 RNA 样本制备指南Illumina可在线获取
RNAClean XP 磁珠BeckmanCoulterA63987
AMPure XP 磁珠BeckmanCoulterA63880
MicroAmp 光学 8 管条ThermoFisherN80105800.2 ml 薄壁管
MicroAmp 光学 8 管条盖ThermoFisherN801-0535
无 RNase/DNase 试剂储液槽任意供应商
SuperScript II 逆转录酶ThermoFisher18064-014
MicroAmp 光学 96 孔板ThermoFisherN8010560根据需要替代 0.3 mL 板使用
MicroAmp 光学密封膜ThermoFisher4311971
NEBNext 多重小 RNA 文库构建试剂盒（适用于 Illumina®，Set 1） New England BiolabsE73005小 RNA 试剂盒
NEBNext 多重小 RNA 文库构建试剂盒（适用于 Illumina®，Set 2） New England BiolabsE75805小 RNA 试剂盒
QIAQuick PCR 纯化试剂盒QIAGEN28104
96S 超强磁力板ALPAQUAA001322

参考文献

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RNA mRNA RNA RNase H
猪全血中表达的编码与非编码RNA类别鉴定
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