方法文章

使用手动分选与双细胞剔除法对荧光标记小鼠神经元进行单细胞RNA测序 体外 具有绝对计数测序的转录组分析（DIVA-Seq）

DOI：

10.3791/58690

⸱

2018年10月26日

 , 
1Cold Spring Harbor Laboratory

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了手动分选单个荧光标记神经元的步骤，随后进行 体外 基于转录的mRNA扩增技术用于高深度单细胞RNA测序

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单细胞RNA测序（RNA-seq）现已成为检测基因表达的常用工具。市面上可获得的单细胞RNA测序平台会无差别地处理所有输入细胞。有时会在上游使用荧光激活细胞分选（FACS）来分离特定标记的目标细胞群体。FACS的一个局限性在于需要大量输入细胞，并且其中被显著标记的细胞比例需足够高，这使得从鼠脑中收集和分析稀有或稀疏标记的神经元群体变得不切实际。本文介绍一种从新鲜解离的小鼠脑组织中手动收集稀疏荧光标记单个神经元的方法。该方法可实现高纯度捕获单个标记神经元，并可进一步与后续分析流程整合。 体外 一种基于转录的扩增方案，可保留内源性转录本的比例。我们描述了一种利用独特分子标识符（UMIs）生成单个mRNA计数的双线性扩增方法。经过两轮扩增，可实现每个单细胞中高程度的基因检出。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单细胞RNA测序（RNA-seq）已彻底改变了转录组学研究。尽管可采用多种技术（如液滴法）进行大规模单细胞RNA测序1,2，微流控技术3，纳米网格4和微孔5，大多数方法无法分选表达遗传编码荧光蛋白的特定细胞类型。为了分离特定的细胞群体，通常采用荧光激活细胞分选（FACS）以单细胞模式对标记细胞进行分选。然而，FACS存在一些限制，并需要精细的样品处理步骤。首先，通常需要大量的起始细胞（每毫升常需数百万个细胞），其中相当一部分细胞>15–20%）含有标记细胞群。其次，细胞制备可能需要多次密度梯度离心步骤，以去除胶质成分、碎片及可能堵塞喷嘴或流动池的细胞团块。第三，流式细胞分选（FACS）通常需对活/死细胞染色进行染色与脱色步骤例如， 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、碘化丙啶（PI）和Cytotracker染料），这些步骤会额外耗时。第四，对于双色分选（例如DAPI与绿色/红色荧光蛋白GFP/RFP），通常需要两个样品和一个对照，除目标小鼠品系外，还需处理一个未标记的样品。第五，为预防流式细胞分选仪（FACS）样品管路堵塞，通常在分选前和分选过程中需多次进行过滤。第六，在大多数常用的FACS系统中，必须预留时间用于初始化和稳定液流，并进行液滴校准。第七，在正式样品采集之前，通常需依次运行对照样品，以设置补偿矩阵、排除双联体、设定门控参数 等等。 用户可提前自行完成第六步和第七步，或同时寻求技术人员的协助。最后，在流式分选后，通常需要采取一些步骤以确保每个孔中仅存在标记的单个细胞；例如，可通过高内涵筛选系统（如快速微孔板成像仪）检查样品。

为避免上述步骤，实现对少量单个荧光标记神经元的快速、靶向测序，我们描述了一种手动分选方法，随后进行两轮高灵敏度的扩增 体外 扩增方案，称为具有绝对计数测序的双重体外转录法（DIVA-Seq）。RNA扩增和cDNA文库构建步骤改编自Eberwine 等6 和 Hashimshony 等7，但进行了一些修改以适应细胞体积较小的小鼠中间神经元；此外，我们还发现该方法同样适用于兴奋性锥体神经元。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有涉及动物实验的操作均已获得纽约冷泉港实验室动物护理与使用委员会（IACUC #16-13-09-8）的批准。

1. 荧光标记小鼠神经元的手动分选

  1. 使用拉针仪将玻璃微毛细管（参见材料表）拉制成出口直径为10–15 µm的微电极，拉制参数设置如下：加热温度：508，拉力：空白，速度：空白，时间：空白。
  2. 使用合适的管路连接件，将一段长度为120–150 cm的柔性硅胶管（内径约0.8 mm）连接至一个0.2 µm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜注射过滤器和一个双向管路阀。
  3. 准备500 mL冰冷（4 °C）的人工脑脊液（ACSF，表1），并通过气石向其中通入含5%二氧化碳的平衡氧气气体15分钟，或直至溶液完全澄清，以实现氧合。
  4. 在150 mL烧杯中配制100 mL含活性阻断剂混合物的ACSF（表1）。
  5. 在150 mL烧杯中配制100 mL含1 mg/mL Streptococcus IV型蛋白酶的ACSF（表1）。
  6. 在150 mL烧杯中配制100 mL含1%胎牛血清（FBS）的ACSF，并通过气石持续通入含5%二氧化碳的平衡氧气进行氧合。
  7. 通过使用小剪刀打开安乐死小鼠的颅骨，并用精细镊子取出完整大脑，避免损伤皮层。
    注：可根据需要使用任意品系、年龄和性别的小鼠。切勿冷冻大脑，且不得对注射过病毒或其他有害/传染性试剂的小鼠进行手动分拣。
  8. 在整个切片过程中，将大脑置于冰冷且充分氧合的ACSF中，并始终保持气石连接含5%二氧化碳的平衡氧气供气。
  9. 将大脑固定于振动切片机的夹持装置上，以300 µm厚度切取冠状面或矢状面切片。根据需要收集足够数量的切片，以获得至少约10–50个标记细胞，最多可达数百个细胞。将切片置于置于烧杯内的棉网切片架上，使其完全浸没于氧合ACSF中。
  10. 将新鲜切片转移至含有含活性阻断剂ACSF的烧杯中，在室温下封闭15–20分钟。持续使用气石通氧。
  11. 将切片转移至含有蛋白酶溶液ACSF的烧杯中，在室温下进行温和消化：P4-14阶段动物消化20–30分钟，P28-56阶段动物可延长至45–60分钟。持续通氧。
  12. 将切片重新移回含活性阻断剂ACSF的烧杯中，于室温下洗涤5–10分钟以去除蛋白酶。持续通氧。
  13. 将单个切片转移至盛有含1% FBS ACSF的100 mm培养皿中，置于室温下。在荧光解剖显微镜下，显微解剖含有至少10–50个细胞（最多数百个）的目标区域和皮层层。可使用精细镊子，或在木制手柄（牙签状）上安装22–28 G注射针头进行显微解剖操作。
  14. 使用巴斯德吸管，将显微解剖所得组织块转移至含有约0.8 mL含1% FBS ACSF溶液的2 mL微量离心管中。
  15. 在室温下对微量离心管中的组织进行吹打解离。通过在明火上滚动，制备三支出口直径依次减小的长颈巴斯德吸管。依次使用每支吸管各吹打约10次，从最大直径开始，至最小直径结束。
  16. 将解离后的细胞悬液滴加至盛有氧合ACSF的100 mm培养皿中（如需要，可在培养皿底部薄层涂布5 mm厚、按1:10比例稀释的1%琼脂或透明硅胶化合物）。置于室温保存。
  17. 静置约5–7分钟，待细胞逐渐沉降后，在解剖显微镜下观察GFP/RFP信号。
    注：单个细胞、碎片及小团块在明场（BF）下可见。
  18. 使用连接柔性硅胶管（内径0.4–0.8 mm）的毛细吸管（来自步骤1.1），每次吸取10–15个GFP/RFP阳性细胞，并将其转移至盛有新鲜氧合ACSF的100 mm培养皿中。
  19. 用舌头堵住管路阀末端，将毛细吸管靠近目标细胞。解除封堵后利用毛细作用吸入细胞，随即再次封堵以防止过多液体进入吸管。在解剖显微镜荧光成像下，轻柔吹气将细胞释放至盛有新鲜氧合ACSF的100 mm培养皿中。目标共收集约100–150个细胞。
  20. 根据碎片情况，重复步骤1.19一次或两次，并将总共约50–75个细胞转移至新的100 mm培养皿中，确保在明场微分干涉差（DIC）显微镜下观察时杂质（如碎片）尽可能少。
  21. 最后，每次使用一支新的微毛细吸管，在不超过0.5 µL的液体体积中挑选单个细胞，并将其吹出至含有1 µL样本收集缓冲液及引物N10B1-N10B96（表2）的单个0.2 mL微量离心管（或八联排0.2 mL微量离心管条）中。将吸管尖端折断于微量离心管内，以确保细胞保留在收集缓冲液中。随后丢弃吸管。
  22. 将微量离心管置于干冰上速冻，并长期储存于-80 °C冰箱中，直至进行RNA扩增处理。

2. 第一轮RNA扩增

注意：以下步骤适用于单排八联的 0.2 mL 离心管。可根据需要按比例放大反应体系。

  1. 合成 cDNA 的第一条链（第一轮）。
    1. 将步骤 1.22 中的条带在 70 ˚C 加热 5 分钟，随后置于 4 ˚C 5 分钟；重复两次。
    2. 在冰上配制逆转录酶（RT）主混合液/第一链合成主混合液，成分如下（见材料表）：10x 第一链缓冲液（2 µL）、dNTP 混合液（4 µL）、RNase 抑制剂（1 µL）和酶（1 µL）。
    3. 将条带短暂离心（台式离心机），使所有液体沉至管底。保持在冰上。
    4. 向上述各管中加入 1 µL RT 主混合液/第一链合成主混合液（细胞收集所得样本缓冲液总量 1 µL + RT 1 µL = 每管 2 µL）。用移液器充分混匀。短暂离心使全部内容物沉至管底，并保持在冰上。
    5. 将上述管子在空气恒温箱中 42 °C 孵育 2 小时。立即置于冰上以终止反应，并进入第二链合成步骤。
  2. 合成 cDNA 的第二条链（第一轮）。
    1. 在冰上于 1.5 mL 管中按以下顺序配制第二链主混合液（80 µL）：无核酸酶水（63 µL）、10x 第二链缓冲液（10 µL）、dNTP 混合液（4 µL）、DNA 聚合酶（2 µL）和 RNaseH（1 µL）。充分涡旋混匀，然后离心使液体沉至管底，保持在冰上。
    2. 启动热循环仪，运行以下程序以预冷仪器，准备进行步骤 2.2.3（热盖关闭；16 °C 孵育 2 小时，4 °C 保持），并在 16 °C 暂停。
    3. 向每管条带中加入 80 µL/条带（或 10 µL/管）第二链主混合液，并保持在冰上。将条带转移至热循环仪，恢复上述已启动的 16 °C 孵育步骤。在 16 °C 孵育 2 小时。
    4. 第二链合成完成后，将管子置于冰上，进入下一步 cDNA 纯化步骤。
  3. 纯化双链 cDNA（第一轮）。
    注意：所有离心步骤均在室温下以约 8,000 x g 进行。切勿超过 16,000 x g，以免损坏滤柱。
    1. 开始将 100 µL 无核酸酶水在干式加热块中加热至 50–55 °C，以备后续使用。切勿超过 58 °C，以防 cDNA 部分变性。
    2. 向 1.5 mL 管中加入 250 µL cDNA 结合缓冲液。检查缓冲液中是否有沉淀，若有则将缓冲液在 37 °C 温育 10 分钟以重新溶解沉淀。
    3. 将单个 8 孔条带中的 cDNA 转移至 cDNA 结合缓冲液中。在此步骤中合并细胞，用于后续流程（8 个细胞合并至 1 管）。通过移液 2–3 次并轻弹管壁 3–4 次充分混匀。离心使内容物沉至管底。
    4. 将 cDNA 滤柱牢固插入洗涤管（来自体外转录（IVT）试剂盒）。将上述混合液加至滤膜中心。以 8,000 x g 离心约 1 分钟，或直至液体完全通过滤膜。弃去穿滤液，更换洗涤管。
    5. 向柱中加入 500 µL IVT 试剂盒中的洗涤缓冲液。
      注意：请确保此前已在洗涤缓冲液中加入乙醇。
    6. 以 8,000 x g 离心约 1 分钟，或直至液体完全通过滤膜。弃去穿滤液，再以 8,000 x g 离心约 1 分钟，以排空滤柱。
    7. 将 cDNA 滤柱转移至 cDNA 洗脱管（1.5 mL 无核酸酶管）。向滤膜中心加入 8.5 µL 预热的无核酸酶水。静置 2 分钟，然后以 8,000 x g 离心约 1.5 分钟。
    8. 再次用 8.5 µL 预热的无核酸酶水洗脱，并立即进入第一轮 IVT 步骤。
      注意：双链 cDNA 回收体积约为 16 µL。
  4. 进行体外转录（IVT）反应，由 cDNA 合成扩增 RNA（aRNA）（第一轮）。
    1. 将杂交空气恒温箱设定为 37 °C。
    2. 在冰上按以下顺序配制 IVT 主混合液：向步骤 2.3.8 中洗脱的 16 µL 双链 cDNA 中加入 4 µL T7 ATP 溶液（75 mM）；4 µL T7 CTP 溶液（75 mM）；4 µL T7 GTP 溶液（75 mM）；4 µL T7 UTP 溶液（75 mM）；4 µL T7 10x 反应缓冲液；以及 4 µL T7 酶混合液。充分混匀，短暂离心，置于冰上保存。
    3. 向每管含 16 µL cDNA 的样品中加入 24 µL IVT 主混合液。轻轻且彻底地移液混匀。在 37 °C 孵育 14 小时。
      注意：若孵育时间<12 小时，将严重影响产量。
    4. 加入 60 µL 未经二乙基焦碳酸盐（非 DEPC）处理的无 RNase 水，使总体积达到 100 µL，以终止 IVT 反应。
  5. 纯化 aRNA。
    注意：所有离心步骤均在室温下以约 8,000 x g 进行。切勿超过 16,000 x g，以免损坏滤柱。
    1. 开始将约 200 µL 无核酸酶水在干式加热块或 PCR 仪中加热至 50–55 °C，以备后续使用。切勿超过 58 °C，以防 aRNA 部分变性。
    2. 将 aRNA 转移至 1.5 mL 无核酸酶管中。向每个 aRNA 样品中加入 350 µL aRNA 结合缓冲液。向每管加入 250 µL 100% 乙醇，并通过移液 3 次混匀（切勿涡旋混匀或离心）。
    3. 立即轻轻将混合液加至 RNA 纯化柱的滤膜中心。以 8,000 x g 离心约 1 分钟，或直至混合液完全通过滤膜。弃去穿滤液，重复使用废液收集管。
      注意：加入乙醇后 RNA 将开始沉淀。
    4. 向每个滤柱中加入 650 µL 洗涤缓冲液。以 8,000 x g 离心约 1 分钟，或直至全部缓冲液通过。弃去穿滤液，再额外离心约 1 分钟以去除残留洗涤缓冲液。
    5. 将滤柱转移至新的 aRNA 收集管。向滤膜中心加入 100 µL 预热（50–55 °C）的无核酸酶水。静置 2 分钟，然后以 8,000 x g 离心约 1.5 分钟，或直至液体完全进入收集管。

3. 第二轮扩增

  1. 合成第一链 cDNA（第二轮）。
    1. 将步骤 2.5.5 中的 aRNA 转移至一个 200 µL 微离心管中，并将 100 µL 洗脱液在真空浓缩仪中浓缩至 10 µL。不加热，运行真空浓缩仪 65 分钟。用一个 200 µL 管中的 10 µL 水进行对比，以估算浓缩后的体积。
    2. 将杂交用空气恒温箱预热至 42 °C。
    3. 向 aRNA 中加入 IVT 试剂盒中的 2 µL 随机六聚体引物，短暂涡旋混匀，然后离心收集管壁液体。
    4. 将微离心管置于热循环仪中，在 70 °C 孵育 10 分钟，随后置于冰上。
    5. 在 200 µL 微离心管中配制以下反转录主混合液（第一链）：2 µL 10x 第一链合成缓冲液、4 µL dNTP 混合物、1 µL RNase 抑制剂和 1 µL ArrayScript 酶。轻轻涡旋充分混匀，离心收集管壁液体，置于冰上备用。
    6. 向每个微离心管中加入 8 µL 上述 RT 主混合液（第一链）。将各管放入 42 °C 空气恒温箱中孵育 2 小时。
    7. 向上述反应体系中加入 1 µL RNaseH。用移液器吹打 2–3 次并轻弹管壁 3–4 次以充分混匀，离心收集管壁液体。在 PCR 仪中于 37 °C 孵育 30 分钟。孵育结束后，立即进入第二链合成步骤。
  2. 合成 cDNA 第二链（第二轮）。
    1. 向每个 cDNA 样品中加入 3 µL T7-RA5 引物（工作稀释浓度为 25 ng/µL，表 2）和 2 µL 无 RNase 水。充分混匀后离心收集管壁液体。
    2. 在热循环仪中于 70 °C 孵育 10 分钟。将反应体系置于冰上。
    3. 在冰上配制第二链 RT 主混合液：58 µL 无核酸酶水、10 µL 10x 第二链缓冲液、4 µL dNTP 混合物和 2 µL DNA 聚合酶。涡旋充分混匀后离心收集管壁液体，保持在冰上。
    4. 向步骤 3.2.2 中的每根管中加入 74 µL 上述混合液。用移液器吹打 2–3 次并轻弹管壁 3–4 次以充分混匀，然后离心收集管壁液体。保持在冰上暂存。
    5. 通过关闭热盖加热功能，将热循环仪预冷至 16 °C。将各管放入热循环仪中于 16 °C 孵育 2 小时。
    6. 第二链合成完成后，将各管置于冰上以进行 cDNA 纯化步骤，或于 -20 °C 冻存。
      注：建议在冻存前进行 cDNA 纯化。
  3. 进行 cDNA 纯化（第二轮）。
    注：所有离心步骤均在室温下以约 8,000 x g 进行。切勿超过 16,000 x g，以免损坏滤柱。
    1. 开始将无核酸酶水在干式加热块中加热至 50–55 °C 以备后续使用。切勿超过 58 °C，以防 cDNA 部分变性。
    2. 将 cDNA 转移至 1.5 mL 无核酸酶离心管中。向每管中加入 250 µL cDNA 结合缓冲液。检查缓冲液中是否有沉淀，如有则将缓冲液于 37 °C 温育 10 分钟以重新溶解。用移液器吹打 2–3 次并轻弹管壁 3–4 次以充分混匀。离心收集管壁液体。
    3. 将 cDNA 滤柱牢固插入洗涤管中。将上述混合液加至滤膜中心。在 8,000 x g 下离心约 1 分钟，或直至液体完全通过滤膜。弃去穿滤液，更换洗涤管。
    4. 加入 500 µL 洗涤缓冲液。确保此前已在洗涤缓冲液中加入乙醇。在 8,000 x g 下离心约 1 分钟，或直至液体完全通过滤膜。
    5. 弃去穿滤液，在 8,000 x g 下再次离心约 1 分钟以排空滤柱。将 cDNA 滤柱转移至 cDNA 洗脱管中。
    6. 向滤膜中心加入 8.5 µL 预热的无核酸酶水。静置 2 分钟后，在 8,000 x g 下离心约 1.5 分钟。再用额外的 8.5 µL 预热无核酸酶水进行第二次洗脱。
      注：双链 cDNA 的回收体积约为 16 µL。
    7. 立即进入第二轮体外转录（IVT）步骤，或将 cDNA 在 -20 °C 冻存过夜。
  4. 通过体外转录（IVT）进行第二轮 aRNA 合成。
    1. 将杂交用空气恒温箱设定为 37 °C（设定点为 36 °C）。
    2. 在冰上按以下顺序配制 IVT 主混合液：向步骤 3.3.7 中洗脱得到的 16 µL 双链 cDNA 中加入 4 µL T7 ATP 溶液（75 mM）；4 µL T7 CTP 溶液（75 mM）；4 µL T7 GTP 溶液（75 mM）；4 µL T7 UTP 溶液（75 mM）；4 µL T7 10x 反应缓冲液；以及 4 µL T7 酶混合物。充分混匀，短暂离心收集管壁液体，置于冰上暂存。
    3. 向每根含有 16 µL cDNA 的管中加入 24 µL IVT 主混合液。轻轻吹打充分混匀内容物。在 37 °C 孵育 14 小时。
      注：若孵育时间 < 12 小时，将严重影响产量。
    4. 加入 60 µL 未经 DEPC 处理的无 RNase 水，使总体积增至 100 µL，以终止 IVT 反应。
  5. 进行 aRNA 纯化（第二轮）。
    注：所有离心步骤均在室温下以约 8,000 x g 进行。切勿超过 16,000 x g，以免损坏滤柱。
    1. 开始将约 200 µL 无核酸酶水在干式加热块或 PCR 仪中加热至 50–55 °C 以备后续使用。切勿超过 58 °C，以防 aRNA 部分变性。
    2. 将 aRNA 转移至 1.5 mL 无核酸酶离心管中。向每个 aRNA 样品中加入 350 µL aRNA 结合缓冲液。向每管中加入 250 µL ACS 级 100% 乙醇，并用移液器吹打 3 次混匀（切勿涡旋混匀或离心）。
      注：加入乙醇后 RNA 将开始沉淀。
    3. 立即将混合液轻轻加至 RNA 纯化柱的滤膜中心。在 8,000 x g 下离心约 1 分钟，或直至液体完全通过滤膜。弃去穿滤液，废液收集管可重复使用。
    4. 向每个滤柱中加入 650 µL 洗涤缓冲液。在 8,000 x g 下离心约 1 分钟，或直至缓冲液完全通过滤膜。弃去穿滤液，再额外离心约 1 分钟以去除残留洗涤缓冲液。
    5. 将滤柱转移至新的 aRNA 收集管中。向滤膜中心加入 100 µL 预热的无核酸酶水。静置 2 分钟后，在 8,000 x g 下离心约 1.5 分钟，或直至液体完全通过。
    6. 取 2 µL 分装至离心管中，用于分光光度计（260 nm 波长）和生物分析仪检测，以评估 aRNA 产量和质量。
      注：浓度必须至少达到 5 ng/µL，否则应弃用该样品。样品可在 -80 °C 保存约 1 年。避免反复冻融。
    7. 按照制造商说明书使用生物分析仪检测样品，以观察 aRNA 产物的正确分布情况（图 2）。

4. 扩增RNA的片段化与纯化

  1. 在冰上混合以下组分（总体积 40 µL，合并两管非重叠样本条形码的 aRNA）：36 µL aRNA（总量 200 ng）和 4 µL RNA片段化缓冲液。在 94 °C 下孵育 90 秒。
  2. 立即将混合物转移至冰上，并加入 4 µL RNA片段化终止缓冲液。加入 56 µL 无核酸酶水，将体积调整至 100 µL。
  3. 加入RNA纯化试剂盒（见材料表）中的 350 µL RLT 缓冲液，通过移液充分混匀。加入 250 µL 乙醇，移液充分混匀，然后将样品转移至RNA纯化离心柱中。在 8,000 × g 下离心 15 秒。
  4. 将离心柱转移至新的收集管中，加入 500 µL RPE 缓冲液，在 8,000 × g 下离心 15 秒。弃去穿流液。加入 500 µL 80% 乙醇，在 8,000 × g 下离心 2 分钟。
  5. 将离心柱转移至新的收集管中，打开柱盖，在最大转速下离心 5 分钟。
  6. 将离心柱转移至新的收集管中，加入 16 µL 无核酸酶水进行洗脱，在最大转速下离心 1 分钟。

5. 文库构建

注意：如果所使用的条形码无重叠，此时可将体外转录产物（IVTs）混合。磷酸酶处理时间为 40 分钟，多聚核苷酸激酶处理时间为 1 小时。

  1. 在0.7 mL的PCR管中，向16 µL片段化的aRNA加入4 µL以下混合液：2 µL 10x碱性磷酸酶缓冲液、1 µL Antarctic碱性磷酸酶和1 µL重组核糖核酸酶抑制剂（例如，RNaseOUT）。在PCR仪中按照以下程序孵育：37 °C孵育30分钟，65 °C孵育5分钟，然后保持在4 °C。
  2. 向第5.1步的0.7 mL PCR管中加入30 µL以下混合液：17 µL无核酸酶水、5 µL 10x碱性磷酸酶缓冲液、5 µL ATP（10 mM）、1 µL重组核糖核酸酶抑制剂和2 µL PNK。在PCR仪中37 °C孵育60分钟，然后保持在4 °C。
  3. 对经碱性磷酸酶和PNK处理的aRNA进行柱纯化。
    1. 加入50 µL无核酸酶水将体积调至100 µL。加入350 µL RLT缓冲液并充分混匀。加入250 µL乙醇（EtOH），用移液器反复吹打混匀，然后将样品转移至RNA纯化离心柱中。
    2. 在8,000 × g下离心15秒。将离心柱转移至新的收集管中，加入500 µL RPE缓冲液。
    3. 在8,000 × g下离心15秒。弃去穿流液，加入500 µL 80%乙醇（EtOH）。
    4. 在8,000 × g下离心2分钟。将离心柱转移至新的收集管中，打开管盖，在最大转速下离心5分钟。
    5. 将离心柱转移至新的收集管中，加入14 µL无核酸酶水洗脱，以最大转速离心1分钟，回收约10 µL洗脱液。弃去离心柱。使用真空浓缩仪将体积浓缩至5 µL，时间约为10分钟。
  4. 使用商业试剂盒连接3'接头（见材料表）。
    1. 用无核酸酶水将TruSeq试剂盒中的3'接头（RA3）稀释3倍，并将分装样品储存于-20 °C。
    2. 向5 µL经碱性磷酸酶和PNK处理的RNA中加入1 µL稀释后的3'接头。在70 °C孵育2分钟，然后立即置于冰上，以防止形成二级结构。
    3. 加入4 µL以下混合液：2 µL 5x HM连接缓冲液（HML）、1 µL核糖核酸酶抑制剂和1 µL T4 RNA连接酶2（截短型）。将PCR管置于预热的PCR仪中，在28 °C孵育1小时（仪器不加热或打开盖子）。
    4. 保持反应管在PCR仪中，加入1 µL终止液（STP），轻轻吹打整个液体6–8次以充分混匀。继续在PCR仪中28 °C孵育15分钟，然后将PCR管置于冰上。
    5. 加入3 µL无核酸酶水，使总体积达到12 µL。取6 µL用于后续步骤，剩余6 µL储存于-80 °C。
  5. 进行逆转录反应。
    1. 在PCR管中混合以下组分：6 µL接头连接后的RNA和1 µL RNA逆转录引物（RTP）。在70 °C孵育2分钟，然后立即置于冰上。
    2. 加入5.5 µL以下混合液：2 µL 5x第一链缓冲液、0.5 µL 12.5 mM dNTP混合液、1 µL 100 mM DTT、1 µL核糖核酸酶抑制剂和1 µL逆转录酶。将PCR管置于预热的PCR仪中，在50 °C孵育1小时，然后置于冰上（样品可保存于-20 °C）。
  6. 进行11–15个循环的PCR扩增，以富集5'和3'引物连接产物。
    1. 向每个逆转录反应体系中加入35.5 µL以下混合液：8.5 µL超纯水、25 µL PCR混合液（PML）和2 µL RNA PCR引物（RP1）。向每个反应体系中再加入2 µL带有唯一索引的RNA PCR引物（RPIX，X = 1至24）。
    2. 在PCR仪中使用以下扩增程序进行扩增：98 °C预变性30秒；进行12–15个循环（98 °C变性10秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸30秒）；72 °C最终延伸10分钟；然后保持在4 °C。

6. PCR 产物纯化与片段筛选

  1. 将 AmpureXP 磁珠在室温下预热。涡旋振荡磁珠直至充分分散，然后向 50 µL PCR 反应液中加入 50 µL（PCR 产物与磁珠体积比为 1:1）。反复吹打混合最多十次，确保充分混匀。
  2. 室温孵育 15 分钟。将管子置于磁力架上至少 5 分钟，直至液体变澄清。小心移除并弃去 95 µL 上清液。
  3. 加入 200 µL 新鲜配制的 80% 乙醇。孵育至少 30 秒，然后在不扰动磁珠的情况下移除并弃去上清液。重复此步骤一次。
  4. 将磁珠在空气中干燥 15 分钟或直至完全干燥。用 32.5 µL 重悬缓冲液重悬磁珠。用移液器将全部液体吹打上下十次，确保充分混匀。
  5. 室温孵育 2 分钟。将管子置于磁力架上 5 分钟，直至液体变澄清。转移 30 µL 上清液至新管中。加入 20 µL 无核酸酶水，使总体积达到 50 µL。
  6. 使用固相可逆固定（SPRI）磁珠对 PCR 产物进行片段大小选择。
    1. 向步骤 6.5 中制备的管中加入 0.7 倍体积（35 µL）的 SPRI 磁珠，并通过移液充分混匀。室温孵育 5 分钟。
    2. 将管子置于磁力架上，等待 5 分钟或直至磁珠完全分离。小心移除上清液，避免扰动磁珠。
    3. 加入 200 µL 新鲜配制的 85% 乙醇。等待 30 秒后移除乙醇。将磁珠在空气中干燥 10 分钟。
  7. 加入 20 µL 无核酸酶水。将管子重新置于磁力架上，等待 5 分钟，然后用移液器小心移取液体部分，避免触碰或扰动磁珠。将 DNA 储存于 -20 °C。

7. 文库数量与质量的测定

  1. 使用分光光度计在260 nm波长下检测DNA浓度（预期浓度至少为~5–10 ng/µL）。
  2. 使用高灵敏度DNA芯片在生物分析仪上对每个样本取1 µL进行检测，以分析片段大小分布（预期主峰位于300–400 bp（见图3））。

8. 样品提交

  1. 混合不重叠的测序PCR条形码（1:1比例）。例如，根据RNA测序核心实验室对总上样量的要求，将含有RPI-1和RPI-2、RPI-3和RPI-4的样本PCR产物按相等的纳克量混合。
  2. 混合后，将总体浓度调整为5 ng/µL，总体积至少为10 µL，或按照测序平台核心实验室的建议进行调整。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

采用上述方案，对GABA能神经元进行人工分选（图1）并扩增RNA，然后构建cDNA文库（图2）并在高深度下进行测序8扩增的RNA（aRNA）产物大小在200–4,000 bp之间，峰值分布略高于500 bp（图3A）。经磁珠纯化的cDNA文库通过第二轮磁珠纯化进一步进行片段大小筛选，去除小于200 bp的较小片段（图3B 和 3C）且在约350 bp处出现峰值。片段过短会导致空读（无mRNA插入片段，仅有接头和引物序列），而片段过长则会占据测序芯片上更多空间，从而降低总读长产出。测序后，我们通常获得4.8 × 105 中位数，或 6.9 x 105 每个细胞的平均比对读段数（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

手动分选方案适用于对小鼠脑中稀疏标记的神经元群体或极为稀少的细胞群体进行有监督的RNA测序，这些细胞群体通常难以通过现有的高通量细胞分选和扩增方法进行研究。经流式细胞分选（FACS）的细胞通常会受到鞘液和样品管路压力的影响，压力范围约为9–14 psi，具体数值取决于喷嘴尺寸和期望的事件速率。此外，细胞在从喷嘴喷出后可能猛烈撞击收集管或涂有样品缓冲液的孔板表面，从而造成冲击应力。而在手动分选过程中，由于细胞通过毛细作用被吸入移液管，并通过轻柔吹出及简单折断玻璃移液管尖端的方式释放，因此不会受到上述高压影响。DIVA-Seq方案适用于细胞体积较小（<8 µL）且起始材料量低的细胞进行RNA扩增，能够稳定地检测到大量基因（8–10 K），结合深度测序，可实现对细胞身份背后细胞功能分子图谱的精细重建8,13,14。由于该方法具有细胞收集纯度高、基因检测灵敏度高以及能够进行绝对分子计数等优势，因此在高深度和高精度研究细胞状态及疾病病理生理机制方面具有重...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助（Z.J.H. 获得 5R01MH094705-04 和 R01MH109665-01）、冷泉港实验室 Robertson 神经科学基金（Z.J.H. 获得）以及 NARSAD 博士后奖学金（A.P. 获得）的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ERCC RNA 加标对照混合液赛默飞世尔科技货号 4456740
SuperScript III赛默飞世尔科技货号 18080093
RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂赛默飞世尔科技货号 10777019
RNA片段化缓冲液New England Biolabs货号 E6105S
RNA MinElute试剂盒Qiagen货号 74204
南极磷酸酶New England Biolabs货号 M0289
多核苷酸激酶New England Biolabs货号 M0201
T4 RNA连接酶2，截短型New England Biolabs货号 M0242
Ampure Xp 磁珠  珠粒贝克曼库尔特货号 A63880
SPRIselect 大小选择磁珠赛默飞世尔科技货号 B23317
DL-AP5Tocris货号 0105
CNQXTocris货号 1045
TTXTocris货号 1078
灰色链霉菌蛋白酶Sigma-Aldrich货号 P5147
Message Amp II 试剂盒赛默飞世尔科技货号 AM1751
碳合气Airgas货号# UN3156
Sylgard 184Sigma-Aldrich货号 761036
Illumina TrueSeq smallRNA 试剂盒Illumina货号 RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico 芯片安捷伦Cat# 5067-1513
生物分析仪高灵敏度DNA芯片安捷伦Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100安捷伦
配备荧光和明场照明及微分干涉差（DIC）光学系统的解剖显微镜。  （徕卡型号 MZ-16F）LeicaModel MZ-16F
玻璃微量移液管：硼硅酸盐毛细管，500支/包。外径=1 mm，内径=0.58 mm，壁厚=0.21 mm，长度=150 mm。沃纳仪器型号 GC100-15，货号 30-0017
毛细管移液器拉制仪Sutter Instruments CoP-97
振动切片机Thermo MicromHM 650V
振动切片机组织冷却装置Thermo MicromCU 65

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  3. Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
  4. Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228(2017).
  5. Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883(2016).
  6. Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
  7. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  8. Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
  9. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
  10. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
  11. Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
  12. Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
  13. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101(2016).
  14. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  15. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

DIVA Seq UMI

相关文章