寨卡病毒在原代人细胞中抗体依赖性增强作用的定量分析

摘要

我们描述了一种利用人血清、原代人细胞以及实时定量聚合酶链式反应进行感染定量的方法，用于评估针对登革病毒的预存免疫对寨卡病毒感染的影响。

摘要

寨卡病毒（Zika virus）作为一种黄病毒属新发病毒，其感染与吉兰-巴雷综合征及婴儿小头症等神经系统并发症相关，已引发严重的公共卫生安全问题。在诸多风险因素中，抗体依赖性增强作用（antibody-dependent enhancement, ADE）构成最显著的威胁，因为寨卡病毒（ZIKV）的近期再次暴发主要发生在人群既往已暴露于其他密切相关黄病毒（尤其是登革病毒，DENV）并处于预存免疫状态的地区。本文介绍一种用于定量评估人血清中抗登革病毒（DENV）抗体对寨卡病毒（ZIKV）在原代人细胞或细胞系中感染效果影响的实验方案。

引言

在蚊媒传播的病毒性疾病中，寨卡病毒感染是临床上最为重要的疾病之一¹。该感染由黄病毒属的寨卡病毒（ZIKV）引起，在大多数情况下以埃及伊蚊（Aedes aegypti）为主要传播媒介^1,2。然而，已有研究报道在某些寨卡病毒暴发疫情中，白纹伊蚊（Aedes albopictus）亦可作为主要传播媒介³。尽管许多感染者无明显症状，最常见的临床表现仍为发热、头痛和肌肉疼痛²。目前尚无针对寨卡病毒感染的特效治疗方法或疫苗，临床上主要采取支持性治疗。近年来南美洲暴发的寨卡病毒疫情导致了大量重症病例，并使胎儿神经发育障碍——小头症（microcephaly）的发生率上升约20倍²。由于南美洲是登革病毒（DENV）和西尼罗病毒等多种虫媒病毒的流行区域，因此亟需研究机体对其他黄病毒的既往免疫是否会影响寨卡病毒感染的严重程度和疾病进程。

在漫长的进化过程中，病毒发展出多种策略以提高其感染能力，从而劫持宿主细胞的生物机制并抑制抗病毒反应。其中最引人注目的策略之一是病毒利用宿主的先天免疫抗体，通过抗体依赖性增强（ADE）现象来促进自身复制⁴。登革病毒（DENV）所有四种血清型的ADE效应已被广泛研究，并证实可提高病毒滴度并加重疾病结局^5,6,7。在先前的一项体外研究中，我们已证明在人原代免疫细胞中，由于既往存在的DENV免疫，寨卡病毒（ZIKV）的复制显著增强⁸。我们还建立了一种相关的体外方法，用于定量评估既往存在的DENV抗体在原代细胞中增强ZIKV复制的能力。

我们开发的实验方案采用人血清样本，在具有生物学相关性的细胞或寨卡病毒（ZIKV）可感染的组织来源细胞中，通过TCID-50或蚀斑减少中和试验（PRNT）检测登革病毒（DENV）的中和能力。

方案

本研究中使用的血清样本来自哥伦比亚一个队列的人类受试者。样本采集已获得哥伦比亚南美洲帕姆普洛纳大学（Universidad de Pamplona）和洛斯波蒂奥斯医院（Los Potios Hospital）伦理审查委员会（IRB）的批准。⁸样本为匿名提供，研究人员无法获取患者信息。血清样本经检测确定登革病毒（DENV）血清型，并进一步确认其可中和DENV感染。 体外 作为对照，使用来自美国的健康个体（HC）的血清样本。

注意：本方案可用于研究在表达 Fcγ 受体的任何人类细胞类型中寨卡病毒（ZIKV）复制的抗体依赖性增强（ADE）效应。该方案包括三个部分（图1）。

1. 细胞接种与感染设置

注意：本研究使用人原代巨噬细胞或U937髓单核细胞系（ATCC-CRL-1593.2）。细胞培养于添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中，在37 °C、含5%二氧化碳（CO₂）的培养箱中孵育。所有操作均在生物安全二级（BSL-2）生物安全柜中的无菌条件下进行。

1. 接种 3 × 10⁴ 每孔加入100 µL培养基，在无菌平底96孔板中接种细胞，并置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养₂.
2. 接种细胞后，将血清样本在室温下解冻，并进行10倍系列稀释（即，1/10，1/100，1/1,000，1/10,000）的稀释液，将样品与无血清培养基混合。将稀释后的样品分装至无菌的96孔板中。使用不含血清的病毒作为额外对照。
3. 将ZIKV毒株在37 °C水浴中解冻1 - 2分钟，随后迅速转移至冰上，以备后续使用。
4. 向血清等分试样中加入0.1感染复数（MOI）当量的ZIKV毒株MR766。
   注意： 确保稀释倍数保持恒定，总体积约为 200 µL，足以进行每个处理组的三复孔实验。保留三个未感染的孔，作为后续分析的阴性对照。
5. 将添加病毒的血清稀释液置于含5% CO₂的37 °C培养箱中孵育₂ 孵育1小时，以使登革病毒抗体与寨卡病毒颗粒形成复合物（为方便起见，下文简称 "免疫复合物").
6. 吸弃平底96孔板中已接种细胞的培养基，用无菌的1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）洗涤细胞。
7. 将50 µL免疫复合物加入每孔中，置于含5% CO₂的37 °C培养箱中孵育₂ 2小时。
8. 孵育2小时后，使用多通道移液器吸出含有免疫复合物的培养基，并用1×PBS洗涤细胞2次，以彻底去除免疫复合物及未结合的病毒颗粒。
9. 向每孔加入100 µL含10% FBS的新鲜完全培养基，将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育₂ 48 小时。

2. RNA 提取

1. 从培养箱中取出96孔板，并将其转移至生物安全柜中。
2. 吸除培养基，用1× PBS洗涤细胞2次，随后进行RNA提取。
   注意： RNA提取可采用任意合适的方法（参见材料表）。
3. 每孔加入含10% β-巯基乙醇的250 µL细胞裂解缓冲液。用移液器反复吹打至少5次，同时用枪头刮擦孔底以加速裂解过程。
4. 将细胞裂解物转移至新的、已标记的无菌1.5 mL离心管中。
5. 加入等体积的70%乙醇（250 µL）。上下吹打4–5次，直至混合液变得澄清。
6. 将混合液（约500 µL）转移至标记好的硅胶膜柱（置于2 mL收集管中），在15,000 × g 条件下离心30秒。弃去穿流液，将柱子保留在同一收集管中。
7. 向每个柱子中加入700 µL洗涤缓冲液1，在15,000 × g 条件下离心30秒。弃去穿流液，将柱子保留在同一收集管中。
8. 向每个柱子中加入500 µL洗涤缓冲液2，在15,000 × g 条件下离心30秒。弃去上清液。重复此步骤2次。
9. 将柱子转移至新的2 mL收集管中，在15,000 × g 条件下离心2分钟。确保硅胶膜柱完全干燥，无残留的洗涤缓冲液2中的乙醇。
10. 弃去2 mL收集管，将柱子放入新的、无菌且已标记的1.5 mL回收管中。
11. 在每个柱子中央加入预热（42 °C）的30 µL无RNase水，在15,000 × g 条件下离心1分钟。
12. 收集洗脱的RNA，并使用分光光度计在260 nm波长下定量样品。
    注意： 理想情况下，通过计算260 nm与280 nm处吸光度值的比值来评估RNA纯度。纯化后RNA的260/280比值理想范围为1.8–2.0。

3. 定量实时聚合酶链式反应

注意： 定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）可使用任何SYBR Green预混液进行，该预混液通常包含SYBR Green I染料、Taq DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTPs）以及被动参照染料。任何具备SYBR Green检测功能的qPCR仪均可用于实施反应并获取数据。本实验采用了一步法RT-PCR试剂盒，其中含有SYBR Green I、ROX参比染料、Taq DNA聚合酶、dNTPs以及逆转录酶的复合物（参见 材料表). 本研究中用于定量ZIKV基因组水平的包膜区引物为ZIKV-qF（CCGCTGCCCAACACAAG）和ZIKV-qR（CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT）。作为对照，检测人β-2-微球蛋白（B2M）并用于ZIKV表达水平的标准化（内参基因）。本研究中用于定量B2M基因表达的引物序列为B2M-qF（CTCCGTGGCCTTAGCTGTG）和B2M-qR（TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT）。每份样本的ZIKV基因和B2M基因均需设置三个技术重复。逆转录PCR的实验步骤简述如下。

1. RT-PCR 反应体系的建立
   1. 每份样品使用 100 ng RNA。
   2. 每个反应中加入特定基因的正向和反向引物各1 µL，引物储备液浓度为10 µM。
   3. 每个样本加入 0.25 µL 逆转录酶混合液。
   4. 每次单独反应中加入 12.5 µL 的 SYBR Green 混合液。
   5. 加入最多 25 µL 水。除 RNA 外，将上述所有试剂配制成预混液，分装至 96 孔 PCR 板中，最后加入 RNA。
   6. 用透明胶带密封板孔。
   7. 将培养板在1,000 x g条件下离心 g 1分钟以混匀试剂。
   8. 将培养板放入qPCR仪中。
2. RT-PCR 扩增曲线
   注意： 使用所示的RT-PCR程序 表1.
   1. 在50 °C下孵育样品10分钟，以确保互补DNA（cDNA）的合成。
   2. cDNA合成后，在95 °C下激活Taq DNA聚合酶5分钟。
   3. 进行40个循环的变性（95 °C，10 s）以及引物退火和延伸（60 °C，30 s）。
   4. 在最后添加熔解曲线步骤（65°C）。
3. 数据分析
   1. 通过点击用于运行qPCR仪器程序中的熔解曲线选项卡来监测熔解曲线，理想情况下，特定基因的所有样本应呈现单一峰形，以确认仅存在单一扩增产物，并且当算法将2视为100%扩增效率时，扩增值应高于1.6（扩增值根据qPCR仪器所使用的算法而有所不同）。为获得最佳结果，在熔解曲线程序中应采用0.5 °C的温度递增值，每步至少保持10秒的恒温时间。
   2. 在确认存在单一扩增产物且扩增效果良好后，首先点击定量数据标签，获取每个样本的定量循环值（Ct/Cq值），并导出至Microsoft Excel。
   3. 使用电子表格，根据 Ct 值计算每个样本的平均值。接着，在公式栏中点击并选择平均值。每个样本（重复）的平均 Ct 值将用于后续分析。
   4. 接下来，使用公式 ΔCt = 目标基因的平均 Ct 值 - 内参基因的平均 Ct 值 计算 ΔCt（本例中，ΔCt = ZIKV 基因的平均 Ct 值 - B2M 基因的平均 Ct 值）。
   5. 计算 ΔΔCt 以对数据进行归一化处理（本例中，ΔΔCt = ZIKV 样本的 ΔCt - B2M 样本的 ΔCt）。
   6. 通过输入公式 2^-(ΔΔCt) 计算每个经归一化的 ΔΔCt 值对应的基因表达倍数变化。用于统计分析的倍数变化结果可参照先前研究中的方法获得^9,10.

结果

在图1中，逐步以示意图形式展示了执行ADE实验方案的全部步骤。该图是由于既往存在登革病毒（DENV）免疫而引发寨卡病毒（ZIKV）ADE效应的完整流程示意图。图2展示了人血清样本如何被分为三组：经登革病毒感染确认的样本称为DENV感染组，经登革病毒抗体确认的样本称为DENV暴露组，而无登革病毒中和抗体或RNA的健康个体血清则称为健康对照（HC）组。（图2）

将所有血清样本与寨卡病毒（ZIKV）孵育形成复合物后，用于感染巨噬细胞。感染后48小时，提取RNA并进行qRT-PCR分析。图3所示的代表性实验表明，含有登革病毒（DENV）血清型1至4抗体的大多数血清均能在不同程度上增强ZIKV的复制。与血清型1和3相比，含有D...

讨论

登革病毒（DENV）抗体的交叉反应性导致其他DENV血清型的抗体依赖性增强（ADE），这阻碍了有效疫苗的开发¹¹。寨卡病毒（ZIKV）属于同一科，即黄病毒科（Flaviviridae），与其他黄病毒尤其是DENV具有较高的同源性¹²。ZIKV和DENV中和抗体的主要靶标均为包膜蛋白，该蛋白在两种病毒之间具有极高的结构和四级序列同源性^13,14,15。已有研究表明，对DENV或ZIKV的预先免疫可增强另一种病毒的感染能力^8,16。

在 ADE 实验中，有多种不同的方法用于量化病毒的感染性，包括蚀斑实验¹⁷、使用荧光染料标记抗体进行细胞内病毒抗...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清	GEMINI	100-106
iCycler	BioRad	785BR02188	型号 CFX96 光学模块
Microfuge 18 离心机	Beckman Coulter	367160
Nanodrop-1000	Thermoscientific	1072
Quantifast SYBR-One step RT-PCR 试剂盒	Qiagen	204154	用于一步法 RT-qPCR
RNeasy RNA 提取试剂盒	Qiagen	74106	用于 RNA 提取
RPMI 培养基	Gibco	11875093