我们提出了一种利用在田间自然光照条件下拍摄的自然色彩（RGB）数码照片来统计硬粒小麦和大麦穗数的实验方案。该方法仅需对相机参数进行少量调整，并在一定的环境条件限制下，即可在多个生长阶段获得精确且一致的结果。
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摘要
摘要
穗密度，即每平方米的穗数（ears/m2），是许多谷类作物育种项目（如小麦和大麦）中的核心关注点，是估算籽粒产量的重要农艺产量构成因素。因此，一种快速、高效且标准化的穗密度评估技术将有助于改进农业管理，提高收获前产量预测的准确性，甚至可在其被定义为重要性状时作为作物育种的工具。目前的手动穗密度评估方法不仅费力且耗时，而且尚无任何官方标准化的操作规程，无论采用单位长度法、样方法，还是基于收获后植株密度与单株穗数进行推算的方法均如此。本文详细提出了一种自动穗数计数算法，该算法仅需在田间自然光照条件下获取天底方向（天底位）的自然彩色（红、绿、蓝 [RGB]）数字图像，即可实现穗密度的估算，从而支持高通量、标准化的测量。研究利用2014/2015和2015/2016作物季期间在西班牙不同地理区域开展的硬粒小麦和大麦田间试验（包括灌溉和雨养条件），获得了具有代表性的结果。该三阶段操作流程包括：作物生育期与田间条件规划、图像采集规范，以及包含三个步骤的计算机算法：（i）采用拉普拉斯频率滤波器去除低频和高频伪影，（ii）使用中值滤波器降低高频噪声，（iii）通过局部极大值峰值进行分割与计数以获得最终结果。需根据相机分辨率、焦距以及相机与作物冠层之间的距离对算法代码进行微调。结果表明，该算法在硬粒小麦和大麦中均表现出较高的成功率（高于90%）以及算法计数结果与人工图像计数之间的强相关性（R2值为0.62–0.75）。
引言
据报告，2017/2018年度全球谷物使用量较前一年增长1%1。根据最新的谷物产量和人口消费预测，全球谷物储备需要以更快的速度提高产量，以满足不断增长的需求，同时适应气候变化日益加剧的影响2。因此，通过改进作物育种技术提高谷类作物产量成为重要研究方向。本研究选取地中海地区两种最重要且广泛种植的谷物作为示例，即硬粒小麦（Triticum aestivum L. ssp. durum [Desf.]）和大麦（Hordeum vulgare L.）。硬粒小麦在地中海盆地的南部和东部边缘地区种植最广，按年产量3700万吨计算，其为全球第十大重要作物3；而大麦按年产量1.446亿吨计，是全球第四大粮食作物4。
遥感与近端图像分析技术在推动田间高通量植物表型分析（HTPP）的发展中正日益成为关键工具，这些技术不仅提供了更灵活的手段，而且通常还能更精确、一致地获取目标作物的生物生理性状信息，例如光合作用活性和生物量评估、收获前产量预测，甚至在性状遗传力方面也有所提升，如资源利用与吸收效率5,6,7,8,9。传统上，遥感主要依赖于来自航空平台的多光谱、高光谱和热成像传感器，用于田间尺度的精准农业或微区尺度的植物表型研究10。尽管普通商用数码相机仅测量可见光反射，但其空间分辨率极高，过去常被忽视，而近年来随着创新性图像处理算法的不断进步，这些相机逐渐受到重视，因为新算法能够充分利用其所提供的丰富颜色和空间细节信息。当前农业图像分析领域的许多最新进展越来越依赖于超高分辨率（VHR）RGB图像（因其可测量红、绿、蓝三色可见光反射率）所提供的数据解读，包括作物监测（长势、物候、病害评估与识别）、分割与量化（出苗率、穗密度、花与果实计数），甚至基于新型运动结构（structure from motion）工作流程实现完整的三维重建11。
提高谷物生产力最关键的改进点之一是更高效地评估产量，而产量由三个主要组分决定：单位面积穗数（即每平方米的穗数，ears/m2）、每穗籽粒数和千粒重。单位面积穗数可在田间通过人工测定获得，但该方法费时费力，且缺乏统一的标准操作流程，容易引入显著误差。由于作物结构复杂、植株间距小、重叠程度高、背景干扰因素多以及存在芒等结构，实现麦穗自动计数具有较大挑战性。近期研究通过使用三脚架支撑的黑色背景结构获取高质量作物图像，在麦穗计数方面取得了较好的结果12。该方法有效避免了强光和阴影的影响，但此类装置在田间应用中操作不便，存在明显局限性。另一项研究开发了一种基于全自动表型分析系统的自动麦穗计数算法，该系统采用刚性电动龙门架，在不同氮素条件下对五个无芒普通小麦（Triticum aestivum L.）品种组成的试验群体进行穗数测定，取得了较高的准确性13。Fernandez-Gallego 的近期工作14进一步优化了该流程，实现了更快、更便捷的数据采集，采用超高清RGB彩色图像，并结合更先进但仍完全自动化的图像分析方法。在田间条件下实现高效、高质量的数据采集，强调需要建立简化的标准化操作流程，以保证数据的一致性和高通量获取能力；同时，图像处理算法创新性地采用拉普拉斯滤波器和频域滤波器去除图像中干扰成分，随后通过检测局部极大值进行分割计数（不同于以往研究中依赖完整轮廓分割的方法，该策略可减少因麦穗重叠导致的计数误差）。
本研究提出了一种利用市售数码相机获取的图像，在田间条件下自动量化麦穗密度的简易系统。该系统利用田间自然光照条件，因此需考虑一些相关的环境因素，如一天中的拍摄时间及云层覆盖情况，但总体而言仍易于实施。该系统已在硬粒小麦和大麦的实例中得到验证，理论上也可扩展应用于普通小麦——后者除麦穗形态相似外，通常无芒，但尚需进一步实验加以证实。在本文所介绍的数据采集方案中，通过手持相机或使用独脚架将数码相机置于作物上方，即可获取天底方向图像。验证数据可通过在田间对小区样方进行人工麦穗计数获得，也可在后期处理中直接对图像内的麦穗进行计数。图像处理算法包含三个步骤：首先有效去除图像中无关成分，继而实现对所获取图像中单个麦穗的分割与计数。第一步采用拉普拉斯频率滤波器，利用 ImageJ 默认滤波设置（无需调整窗口核大小）检测图像在不同空间方向上的变化。Find Maxima 分割技术在中值空间滤波步骤之后确定局部峰值，此时与麦穗相关的像素值高于土壤或叶片区域。因此，通过 Find Maxima 对图像中的高值区域进行分割，并将这些区域标记为麦穗，从而在识别麦穗的同时减少重叠麦穗的误判。Analyze Particles 随后应用于二值化图像，对 Find Maxima 步骤生成的黑白表面对比所形成的区域进行计数和/或参数测量。接着通过分析每个局部最大值周围最近邻像素的方差，对结果进行处理，以在滤波后的图像中识别麦穗形状。最后，采用 Fiji 中实现的 Analyze Particles 功能进行麦穗密度统计15。Find Maxima 与 Analyze Particles 均为独立功能模块，可作为插件在 Fiji 中使用（https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html）。尽管本方案未具体展示，但作为补充材料提供的初步结果表明，只要分辨率足够高，该技术或可适用于无人机（UAV）平台开展的麦穗计数调查14。
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方案
1. 播前作物生长阶段与环境条件
- 确保作物生长阶段大约处于灌浆期至接近成熟期之间，即使叶片已衰老，但穗部仍保持绿色（以小麦为例，对应Zadoks生长发育标准的60-87期16）。叶片出现部分黄化可以接受，但并非必需。
- 制定采样计划，在田间小区内进行多次重复取样（每个小区拍摄多张图像），以反映小区或区域内的变异情况；图像处理算法将统计图像中的穗数，并根据相机参数将其换算为每平方米穗数（ears/m2）。
- 安排田间调查时间，尽量在正午前后两小时内进行图像采集，或选择阴天在漫射光照条件下拍摄，以避免穗部阴影对计数算法造成的不利影响。
- 到达田间后，检查作物冠层顶部，确保其表面干燥，以避免水分引起的镜面反射。
注意：在实施本方案前，应首先明确作物生长阶段是否适合开展穗数统计。若在推荐生长阶段之外采集图像，可能导致结果不理想或无意义（例如穗未出现或未完全抽出）。图像质量对后续结果处理具有显著影响，包括分辨率和传感器尺寸等参数，同时一些环境因素，如拍摄时间与云量覆盖情况，也需在图像采集前仔细考虑。
2. 在自然光条件下野外成像采集
- 按照图1所示准备一个“表型杆”（phenopole），或使用其他类似的采集系统（甚至手持设备），以便在每个样地或目标位置快速、标准化且一致地采集图像。
图1：穗数统计系统。 使用左侧田间展示的“phenopole”进行穗数统计，系统配备远程控制的自然彩色（RGB）大传感器高分辨率数码相机，可调节相机倾斜角度和高度，并标明了调整图像处理算法所需的关键参数。传感器类型和图像分辨率可由图像属性自动识别，而用户需手动输入镜头焦距及冠层距离。这些参数对于校正每穗所占像素数的估算值，以及将基于图像的总穗数换算为单位面积穗密度（穗/m2）至关重要。因此，建议在所有田间拍摄中使用相同的相机和镜头焦距。请点击此处查看该图的放大版本。
- 将相机安装在合适的独脚架或“自拍杆”上，利用水平气泡或相机内置的稳定系统保持相机水平，以获取天顶方向的图像。
- 使用手机、平板电脑或其他设备连接相机，以实现远程控制拍摄和图像预览，从而获得最佳效果，并确保图像正确对焦。将相机设置为自动对焦模式，以减少因用户对相机或摄影技术不够熟悉而未能正确设置手动对焦所导致的误差，如图2中所示正确对焦和曝光的天顶图像示例所示。
图 2：顶部冠层图像。 硬粒小麦和大麦穗部的顶部图像示例，用于穗数计数数据集，生长和衰老阶段适中，根据扎多克斯（Zadoks）标准约为61至87期。（左）硬粒小麦顶部图像数据集示例。（右）大麦顶部图像数据集示例。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 在拍摄图像前记录图像编号，以便将图像与田间图谱正确匹配。在开始时记录一次田间区域的整体图像，并在各小区之间的地面/田间记录一次图像，用于后期处理的对照。
- 将相机置于作物冠层顶部上方约80 cm处，使用直尺或测量绳定期检查相机距冠层的高度。确保相机水平后拍摄图像。该操作可能需要1至2名研究人员。
- 若除手动图像计数验证外还需额外的田间果穗数验证，可在支架上安装一个扩展臂（例如一个小圆圈），并将其置于图像中央，以便对精确的图像子集进行人工田间计数；该操作可能需要2至3人共同完成。
注意：因此，选择相机时需考虑三个主要因素：（1）相机规格，此处指传感器的物理尺寸；（2）镜头的焦距；（3）冠层与相机之间的距离：距离越小或使用变焦倍数越大的镜头，拍摄范围越小；而距离越远拍摄的作物区域则越大。相关相机规格的详细信息见图1。
3. 算法实现与调整
注意：本文介绍了针对不同相机规格（传感器尺寸、百万像素、焦距、作物距离）以及不同作物（硬粒小麦或大麦）进行自动麦穗计数的算法实现与调整方法。该算法的概述在图3中以图示形式展示。
图 3：用于二行大麦麦穗计数的图像处理流程。 该图像处理流程用于二行大麦的麦穗计数，可通过特定计算机代码或 CerealScanner 软件实现，两者均在 Fiji（ImageJ）环境中运行。图 1 显示原始图像。图 2 显示应用拉普拉斯滤波器后的结果。图 3 显示中值滤波器的应用效果，图 4 显示最终通过“查找最大值”和分割处理得到的麦穗计数结果。随后，根据 图 1 所示方法，将图像中的计数值换算为单位面积麦穗密度。这些图像示例采集于西班牙东北部阿腊苏里（Arazuri）试验田（42°48'33.9"N 1°43'37.9"W），拍摄条件为散射光环境。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 下载并安装 Fiji、Java 8 以及巴塞罗那大学专有的 CerealScanner 插件（https://fiji.sc/、https://www.java.com/en/download/ 以及 https://integrativecropecophysiology.com/software-development/cerealscanner/ [信息] 或 https://gitlab/sckefauver/CerealScanner [代码仓库]）；请联系通讯作者以获取访问权限。该插件可通过将其复制到插件文件夹中，在 Fiji 内完成安装。
- 通过顶部菜单中的 Plugins > CerealScanner > Open Cereal Scanner 打开插件。
注意：除了本文所展示的工作外，CerealScanner 插件还包含多个基于 RGB 的植被指数，用于反映作物活力、胁迫或叶绿素含量17,18。其中特定的 CerealScanner 模块包含用于早期活力（Fernandez-Gallego，正在审稿中）、麦穗计数14 和 作物衰老19 的专用算法，如 图 4 所示。 - 如果相机参数和图像采集细节与默认值不同，请输入相应的调整参数（详见 图 1 和 图 4）。
- 调整算法中相机焦距的参数。
- 调整算法中作物冠层距离的参数。
图4：CerealScanner 2.12 Beta 软件在两个层级上的中央选项卡，标示出 CerealScanner 算法集合中的麦穗计数功能。 用户必须点击批量输入右侧的…按钮，以选择存储图像文件的文件夹；如果H距离（相机到作物冠层顶部的距离）和焦距与默认值不同，则需修改其默认值；然后点击结果文件右侧的…按钮，以指定最终结果文件的名称和保存位置。CerealScanner 的其他选项卡提供了基于性状的表型分析算法，用于早期活力和成熟期起始，属于 CerealScanner 代码套件的一部分。在生物量选项卡下，包含多个用于估算更广泛作物活力和生物量的算法，同样适用于RGB数字图像。本示例以二行型大麦为例，如图3中详细展示。请点击此处查看此图的放大版本。
图5：算法调整。 为了使用同一算法成功计数小麦和大麦的麦穗，在图像处理流程中所需的调整会作为相机特异性参数（H Distance（相机与作物冠层之间的距离）和焦距）校正的一部分自动完成，以确保在不同应用之间每个麦穗所占像素数基本保持恒定。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 选择中间的标签页 CerealScanner，然后选择其中的中央标签页 Ear Counting，以计算田间数据集中每张图像中的麦穗数量。
- 在 Options 下方的 Batch Inputs 中输入待分析照片的存储位置。
- 在 Results Files 中选择结果文件的保存路径。结果文件将包含两列：图像文件名和麦穗计数结果。
- 最后，点击 Process，系统将自动在几分钟内生成结果文件（具体时间取决于计算机速度），其中包含单位面积麦穗密度（ears/m2）。该密度值通过一个简单比例计算得出，该比例利用相机设置参数以及冠层与相机之间的距离，将图像面积转换为实际的冠层面积（平方米），如 图1 所示。
- 在数据采集完成后进行后处理验证：通过人工方式统计图像中小麦或大麦的麦穗数量，然后将其换算为每平方米的麦穗数（ears/m2），如 图1 所示，以便将人工计数结果与算法计算结果进行比较。
- 使用 Fiji 软件内置的简单点标记工具，该工具为此过程提供便捷支持，并结合 Fiji 的 Analyze Particles 功能实现自动计数；该过程的图示见 图6。
- 可选地，在田间数据采集过程中使用小范围圆形区域进行验证，方法如步骤 2.6 所述；随后，可将田间人工计数结果与实验室图像人工计数结果用于算法验证，如 图7 所示。
图6：利用图像内人工计数穗数进行算法验证。对（左）硬粒小麦和（右）大麦进行图像内人工计数穗数。 小点是使用 Fiji 的 Point Tool 创建的，然后在应用 Hue Saturation Intensity 颜色空间中由 Point Tool 指定颜色的 Color Threshold 后，通过设置 0.90–1.00 的 Circularity constraint，使用 Analyze Particles Function 进行计数。该方法可确保基于图像的人工穗数计数更加准确。请点击此处查看该图的放大版本。
图 7：使用田间人工计数和图像内麦穗人工计数（采用圆形区域）对算法进行验证，对象为小麦和大麦。（左）使用圆形区域的小麦图像计数验证示例。（右）使用圆形区域的大麦图像计数验证示例。白色圆形区域内麦穗子集的计数采用与图 6中所述相同的技术，依次使用点工具、颜色阈值，然后使用基于色调的颜色选择及圆形度约束条件下的分析颗粒功能进行计数。请点击此处查看该图的放大版本。
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结果
在图8中，结果显示了通过人工计数与小麦和大麦在三个不同生育期的穗数算法所获得的穗密度（每平方米穗数）之间的决定系数。第一个为硬粒小麦，Zadoks生育期在61至65之间（R2 = 0.62）；第二个为二棱大麦，Zadoks生育期在71至77之间（R2 = 0.75）；最后一个为硬粒小麦，Zadoks生育期在81至87之间（R2 = 0.75）。
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讨论
提高灵活性、一致性和精确性对于开发有用的新型表型分析工具至关重要，这些工具可协助作物育种领域在应对全球气候变化带来的不利影响的同时，提升谷物产量。对作为重要主粮作物产量关键农艺性状之一的谷类作物穗密度进行高效且准确的评估，将有助于提供满足未来人口粮食需求所必需的技术手段。本研究聚焦于田间条件下作物育种工作的改进与支持，使本研究及相关技术更贴近真实气候变化情景以及育种群体的实际需求，但同时也带来了技术上的挑战。因此，不仅需要严格遵循本方案中的数据采集与图像处理步骤，还必须重视关于最佳环境条件和作物生长阶段的建议，以确保该方法的成功实施11。作为产量的重要农艺构成因素，穗密度被认为是提高谷类作物产量的关键目标性状之一（参见Slafer等人20的文章及其引用文献）。本方案致力于实现一种成本效益最优、灵活高效且操作简便的田间表型分析技术，因为这些特性被认为是该技术能否被广大育种群体广泛采纳和应用的关键。相比之下，以往旨在评估穗密度或其他产量构成因子的研究通常采用更为复杂的数据采集方式和环境控制装置，例如封闭式结构、固定相机支架甚至人工光源输入，这些措...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究的作者谨向西班牙国家农业与食品技术研究所（INIA）科莱马尔德奥雷哈（阿兰胡埃斯）实验站和卡斯蒂利亚-莱昂农业技术研究所（ITACyL）萨马杜埃尼亚斯（巴利亚多利德）实验站的田间管理工作人员致以感谢，感谢他们为本研究试验作物提供的田间支持。本研究得到了西班牙经济与竞争力部（MINECO）资助项目 AGL2016-76527-R 以及与先正达公司（Syngenta, 西班牙）合作项目的支持。“托利马省高层次人才培训计划，托利马省省政府—托利马大学，哥伦比亚”（"Formación de Talento Humano de Alto Nivel, Gobernación del Tolima - Universidad del Tolima, Colombia"）提供的 BPIN 2013000100103 奖学金为第一作者 Jose Armando Fernandez-Gallego 的研究提供了唯一资金支持。通讯作者 Shawn C. Kefauver 的主要资金来源为 ICREA 学术奖计划，该资助由 Jose Luis Araus 教授获得。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ILCE-QX1 相机 | Sony | WW024382 | 配备 23.2 x 15.4 mm 传感器尺寸的紧凑型大传感器数码相机。 |
| E-M10 相机 | Olympus | E-M10 | 配备 17.3 x 13.0 mm 传感器尺寸的紧凑型大传感器数码相机。 |
| Multipod Monpod | Sony | VCT MP1 | "Phenopole" 在 JoVE 文章中的名称 |
| 计算机 | 任意 PC/Mac/Linux | -- | 用于数据和图像分析 |
| ImageJ/FIJI（FIJI 即 ImageJ） | NIH | http://fiji.sc | 用于数据和图像分析的插件与算法 |
| 圆环/金属环 | 通用 | 通用 | 用于野外验证的金属环 |
| 螃蟹钳夹 | Newer | 90087340 | 用于圆环支撑和延长臂 |
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