使用生物素-链霉亲和素策略纯化的RNA/蛋白质复合物在变性条件下洗脱至溶液中，其形式不适合进一步的纯化和功能分析。在此，我们描述了该策略的一种改进方法，该方法在RNA中利用光裂解接头并结合温和的紫外洗脱步骤，从而获得天然且完全具有功能的RNA/蛋白质复合物。
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摘要
摘要
多年来，生物素与链霉亲和素之间异常强且快速形成的相互作用已被成功用于部分纯化具有重要生物学意义的RNA/蛋白质复合物。然而，该策略存在一个主要缺点，限制了其更广泛的应用：生物素与链霉亲和素的相互作用只能在变性条件下被破坏，而这些条件同时会破坏洗脱复合物的完整性，从而无法进行后续的功能分析和/或通过其他方法进一步纯化。此外，洗脱样品常常被非特异性结合到链霉亲和素磁珠上的背景蛋白所污染，这使得通过银染和质谱分析纯化后的复合物变得复杂。为克服这些局限性，我们开发了一种生物素/链霉亲和素策略的改进方法，其中生物素通过光裂解连接子共价连接至RNA底物，将复合物固定在链霉亲和素磁珠上后，利用长波紫外光照射选择性地以天然构象形式将目标复合物洗脱至溶液中，而背景蛋白则保留在磁珠上。较短的RNA结合底物可通过化学合成方法制备，将生物素和光裂解连接子共价连接至RNA的5'端；而对于较长的RNA底物，则可通过互补寡核苷酸引入这两个基团。这两种紫外光洗脱方法均已被用于纯化依赖U7 snRNP的加工复合物（该复合物负责在3'端切割组蛋白前体mRNA），结果表明其性能优于此前开发的其他纯化方法。经紫外光洗脱的样品中含有可清晰检测到的U7 snRNP，且基本无主要蛋白污染物，适用于直接进行质谱分析和功能检测。所述方法可轻松适用于其他RNA结合复合物的纯化，并可结合单链或双链DNA结合位点，用于纯化DNA特异性蛋白及大分子复合物。
引言
在真核生物中，由RNA聚合酶II生成的信使RNA前体（pre-mRNA）在进入细胞质作为蛋白质合成的成熟mRNA模板之前，需在细胞核内经历多个成熟过程。其中一项关键步骤是3'端加工。对于绝大多数pre-mRNA而言，3'端加工包括与多聚腺苷酸化偶联的切割反应。这一两步反应由一个包含15种以上蛋白质的相对丰富的复合物催化1。而动物中依赖复制的组蛋白pre-mRNA则通过另一种不同的机制进行3'端加工，其中U7核小核糖核蛋白（U7 snRNP）发挥关键作用。U7 snRNP是一种丰度较低的复合物，由长约60个核苷酸的U7 snRNA和多种蛋白质组成2,3。U7 snRNA通过与组蛋白pre-mRNA中的特定序列碱基配对，其复合物中的一个亚基催化切割反应，从而产生成熟的、不带poly(A)尾的组蛋白mRNA。组蛋白pre-mRNA的3'端加工还需要茎环结构结合蛋白（Stem-Loop Binding Protein, SLBP），该蛋白结合于切割位点上游保守的茎环结构，并促进U7 snRNP向底物的募集2,3。由于U7 snRNP在动物细胞中浓度极低，且在纯化过程中容易因使用温和去污剂4,5,6、高盐洗涤和/或多次层析步骤7,8,9而发生解离或部分蛋白水解，因此针对U7 snRNP各个组分的鉴定研究一直面临挑战。
最近，为了确定依赖U7的加工机器的组成，将带有生物素标记的组蛋白前体mRNA短片段（位于3'端或5'端）与核提取物共同孵育，并利用链霉亲和素包被的琼脂糖磁珠捕获组装形成的复合物5,6,10。由于生物素与链霉亲和素之间的结合极为牢固，固定在链霉亲和素磁珠上的蛋白质需在变性条件下通过SDS煮沸洗脱，并通过银染和质谱分析进行检测。尽管这种简单的方法鉴定出了U7 snRNP的多个组分，但所获得的样品纯度相对较低，常常被大量非特异性结合到链霉亲和素磁珠上的背景蛋白污染，这可能掩盖加工机器中的某些组分，从而阻碍其在银染凝胶上的检测5,6,10。更重要的是，该方法排除了对分离材料进行任何功能性研究的可能性，也无法通过其他方法进一步纯化至均一状态。
为了应对生物素/链霉亲和素相互作用几乎不可逆的特性，人们陆续提出了多种改进方法，其中大多数旨在削弱该相互作用，或在含生物素的试剂中引入可化学切割的间隔臂11,12。然而，这些改进方法的缺点在于会显著降低方法的效率，和/或在洗脱步骤中常常需要非生理条件，从而可能损害纯化后蛋白质的完整性或活性。
此处，我们描述了一种不同的方法，通过使用在5'端共价连接生物素的RNA底物，以解决生物素/链霉亲和素策略的固有缺陷。 通过 对长波紫外光敏感的光裂解性1-(2-硝基苯基)乙基部分13,14我们测试了该方法用于从限速的依赖U7的加工机器中进行纯化 果蝇 哺乳动物核提取物15在将含有生物素和光裂解连接子的组蛋白前体mRNA与核提取物进行短暂孵育后，组装形成的加工复合物被固定在链霉亲和素磁珠上，经充分洗涤后，通过暴露于约360 nm的紫外光下，以天然形式温和地释放至溶液中。该紫外洗脱方法高效、快速且操作简便，可获得足量的U7 snRNP，通过银染即可观察其组分 仅需 100 µL 提取液15紫外光洗脱的产物不含背景蛋白，可直接用于质谱分析、进一步纯化步骤以及酶学检测。该方法也可用于纯化其他需要相对较短RNA结合位点的RNA/蛋白质复合物。生物素和光裂解连接子还可共价连接至单链和双链DNA，因而有望将紫外光洗脱法拓展应用于多种DNA/蛋白质复合物的纯化。
化学合成含有共价连接的生物素和光裂解连接臂的RNA底物仅适用于长度不超过约65个核苷酸的序列，对于显著更长的序列则变得昂贵且效率低下。为解决这一问题，我们还开发了一种适用于更长RNA结合靶标的替代方法。该方法可生成任意长度和核苷酸序列的RNA 体外 通过T7或SP6转录生成，并与一条短的互补寡核苷酸退火，该寡核苷酸在5'端含有生物素和光裂解连接子（转 构型）。随后利用链霉亲和素磁珠，按照与共价连接光裂解生物素的RNA底物相同的纯化方案，对形成的双链进行单个结合蛋白或大分子复合物的纯化。顺式 构型）。通过这一改进，光裂解生物素可与 体外 含有数百个核苷酸的转录产物，扩展了紫外洗脱法在多种RNA/蛋白质纯化中的应用。
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方案
1. 底物制备
注意：短于约65个核苷酸的RNA底物可通过化学合成方法制备，其5’端共价连接有生物素（B）和光裂解连接子（pc）（二者合称为光裂解型生物素或pcB）顺式 构型）。需要生成包含显著更长结合位点的RNA底物 体外 通过T7（或SP6）转录生成，随后与一条在5’端含有pcB基团的短互补接头寡核苷酸退火转 构型）（图1).
- 对于长度少于约65个核苷酸的结合位点，应使用商业供应商合成材料表) 通过化学方法合成目标RNA，并在RNA的5'端共价连接pcB图1A 和 图2A）。用无菌水溶解至所需浓度，并分装成小份于 -80 °C 保存。
- 对于显著长于约65个核苷酸的结合位点，可形成部分双链结构 体外 目标RNA及在5’端含有pcB基团的互补接头寡核苷酸图3A).
- 对线性化的质粒DNA或合适的PCR模板进行T7转录，以生成在3’端延伸约20个核苷酸任意序列的含有目标结合位点的RNA。
- 使用商业生产商（材料表) 化学合成一种接头寡核苷酸，该寡核苷酸与T7生成的RNA的3’延伸端互补，并在5’端含有pcB (图 3A).
注意：可在寡核苷酸5’端添加两个18原子间隔基和2-3个非互补核苷酸，以减少结合复合物与链霉亲和素磁珠之间可能的空间位阻。此外，建议对寡核苷酸均匀修饰2’-O-甲基基团，以增强双链稳定性并提高对多种核酸酶的抗性。 - 将T7体外转录生成的RNA与pcB接头寡核苷酸退火。
- 将20 pmol的RNA与100 pmol的接头pcB寡核苷酸（摩尔比1:5）混合于1.5 mL离心管中，加入100 µL结合缓冲液，其组成为：75 mM KCl、15 mM HEPES（pH 7.9）、15%甘油、10 mM乙二胺四乙酸（EDTA）。
注意：在退火反应中，应使用足以与大多数（即使不是全部）pre-mRNA底物形成双链的最少量衔接子寡核苷酸。该用量可通过将RNA底物的5’端标记来方便地确定 32P，通过使用不同的缓冲条件，将标记的底物与不断增加量的衔接寡核苷酸进行退火，并在用结合缓冲液多次洗涤链霉亲和素磁珠后，检测磁珠上放射性信号的保留情况。 - 将试管放入沸水中5分钟。
- 让水冷却至室温。
- 将20 pmol的RNA与100 pmol的接头pcB寡核苷酸（摩尔比1:5）混合于1.5 mL离心管中，加入100 µL结合缓冲液，其组成为：75 mM KCl、15 mM HEPES（pH 7.9）、15%甘油、10 mM乙二胺四乙酸（EDTA）。
2. 复合物组装
- 向1 mL小鼠核提取物（或其他选定的提取物）中加入80 mM EDTA（pH 8），使其终浓度达到10 mM，以抑制提取物中存在的非特异性金属依赖性核酸酶。
注意：这将使提取物中的缓冲液成分调整至与结合缓冲液相同（参见步骤 1.2.3.1）。EDTA 不影响 体外 组蛋白前体mRNA的加工过程可能会受到干扰，但在纯化以镁离子依赖方式组装的蛋白质或蛋白质复合物时，EDTA可能产生不利影响。在这些情况下，应避免使用EDTA。 - 加入5-10 pmol带有pcB基团标记的RNA底物 顺式 （参见步骤 1.1）或 转 （参见步骤 1.2.3.3）至含有 10 mM EDTA 的 1 mL 提取液中。
注意：RNA 的用量需要通过一系列预实验仔细评估。当使用过量的 RNA 底物来纯化有限量的复合物时，可能会适得其反，导致非特异性 RNA 结合蛋白的背景显著增加，而对特异性蛋白的得率并无改善。 - 将RNA底物与提取物在冰上孵育5分钟，期间偶尔混合样品。
注意：孵育的时间和温度需通过实验确定，可能因RNA/蛋白质复合物的具体性质不同而有显著差异。 - 在预冷的微量离心机中以10,000 × g离心10分钟，去除可能存在的沉淀物，并小心收集上清液，避免转移沉淀。
3. 将RNA/蛋白质复合物固定在链霉亲和素磁珠上。
- 从商业供应商处（材料表）取约 100 µL 链霉亲和素琼脂糖珠悬浮液，加入结合缓冲液（75 mM KCl，15 mM HEPES pH 7.9，15% 甘油，10 mM EDTA）使总体积增加。
注意：该缓冲液的组成应与退火混合物及用于复合物组装的提取物（步骤 2.1）中的缓冲液相同。 - 在 25 × g 条件下离心 2–3 分钟，使珠子沉降至管底，吸除上清液。
- 重复相同的洗涤/离心步骤 2–3 次，使珠子与结合缓冲液达到平衡。
注意：此步骤结束时，珠子沉淀的体积应约为 30 µL。 - 将含有已组装复合物的上清液（步骤 2.4）加载至已平衡的链霉亲和素琼脂糖珠上。
- 在 4 °C 下旋转孵育 1 小时，使 RNA 及其结合的复合物固定在珠子上。
- 在 25 × g 条件下离心 2–3 分钟，使珠子沉降至管底。
注意：若使用角转子时珠子容易粘附于管壁，建议使用水平转子以避免珠子大量损失。 - 吸除上清液，并用 1 mL 结合缓冲液洗涤珠子两次，每次均采用相同的离心条件。
- 加入 1 mL 结合缓冲液，在 4 °C 下旋转孵育 1 小时。
注意：若底物上形成的复合物容易解离，此步骤可适当缩短。 - 在 25 × g 条件下离心 2–3 分钟使珠子沉淀，加入 1 mL 缓冲液，将悬浮液转移至新管中。
- 若复合物不稳定，可额外旋转孵育 1 小时或更短时间，随后在 25 × g 条件下离心 2–3 分钟，将珠子用 200 µL 结合缓冲液重悬并转移至 500 µL 管中。
4. 紫外洗脱。
- 在使用高强度紫外灯照射前，先开启发射365 nm紫外光的紫外灯，预热5-10分钟，直至达到最大亮度。
注意：此步骤对于在照射开始时获得最大紫外发射能量至关重要。 - 将一个培养皿（100 mm × 15 mm）底部装满紧密堆积的冰块，并将其倒置放置在培养皿盖上。
- 短暂涡旋含有固定化复合物的离心管，将其水平放置于冰上，并用预热的紫外灯覆盖，确保样品位于灯泡表面2-3 cm的距离范围内。
注意：若距离过远，可使用额外的培养皿或其他合适物体将样品调整至更接近灯泡的位置。 - 总共照射30分钟，期间频繁翻转并涡旋离心管，以确保悬浮液均匀暴露于紫外光下，并防止过热。
注意：为提供额外冷却，紫外洗脱步骤可在低温房间内进行。若冰块融化过多，应更换为装有新鲜冰块的培养皿。 - 在25 × g条件下离心2-3分钟，收集上清液。
- 使用相同条件再次离心上清液，并收集上清液。
注意：保留底部少量上清液，以避免转移残留的微珠。
5. 样品分析：银染后接质谱检测。
- 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离部分紫外光洗脱的上清液以及紫外光洗脱后留在珠粒上的等量组分。
注意：分析时也可包括在紫外光洗脱前从样品中取出的部分珠粒。 - 使用市售的银染试剂盒对含有分离蛋白的凝胶进行染色。
- 通过比较紫外光洗脱上清液中蛋白质与紫外光照射后仍留在珠粒上的蛋白质条带强度，评估紫外光洗脱效率。
- 切下目标蛋白条带，按照标准方案通过质谱法确定其身份10,15。
6. 通过质谱法对紫外洗脱样品进行全局分析。
- 通过质谱直接分析部分紫外洗脱上清液，以无偏倚的方式确定纯化材料的完整蛋白质组。
注意：可通过将纯化样品在溶液中用胰蛋白酶处理，然后采用标准质谱分析流程，鉴定所生成肽段的序列10,15。
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结果
采用UV洗脱法对两种在5'端共价连接pcB基团的化学合成RNA底物进行了测试（顺式 配置）：pcB-SL（图1）和 pcB-dH3/5m RNA（图2）。31个核苷酸的pcB-SL RNA包含一个茎环结构，其后接一个5个核苷酸的单链尾部，其序列与成熟组蛋白mRNA的3'端相同（即，发生在U7 snRNP对组蛋白前体mRNA进行切割之后）。这一独特序列是哺乳动物细胞质组分中两种蛋白质SLBP和3'hExo的已知结合位点16,17,18.pcB-dH3/5m 是一段 63 个核苷酸的片段 果蝇 H3组蛋白pre-mRNA除茎环结构外，还含有一段结合序列 果蝇 U7 snRNP（
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讨论
本文所述方法简便易行，除引入光裂解接头和紫外洗脱步骤外，其余操作与常规利用生物素和链霉亲和素之间极强相互作用的方法并无差异。紫外洗脱步骤效率很高，通常可释放超过75%的固定化RNA及其结合蛋白，但会留下大量非特异性结合于微珠的蛋白质背景。通过消除这一背景干扰，紫外洗脱步骤可获得纯度极高的样品，可直接用于银染、质谱分析及功能实验。
由于步骤相对较少且操作简单，紫外洗脱法具有高度可重复性，仅需100 µL小鼠和Drosophila核提取物即可获得足量的U7 snRNP，适用于银染分析15。该方法为以往用于纯化RNA/蛋白质复合物的其他实验策略提供了一种理想的替代方案，后者包括在RNA底物上标记MS2结合位点，并通过MS2-MBP融合蛋白将相关复合物固定在麦芽糖珠上。尽管MS2策略在分离相对丰度较高的剪接体和经典的3'端加工复合物方面已取得成功22,23，但无法获得足量的含有U7 snRNP的加工复合物（Z...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
感谢我们的同事和合作者对本研究工作的贡献。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 GM 29832 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 链霉亲和素-琼脂糖 | Sigma | S1638-5ML | |
| 高强度长波紫外灯 | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| 替换灯泡 | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 瓦汞 H44GS-100M 灯泡，发射 366 nm 紫外光（Sylvania） |
| 含有生物素和光裂解接头的 RNA 和寡核苷酸，位于 cis | Dharmacon (科罗拉多州拉法叶) 或 Integrated DNA Technologies, Inc. (爱荷华州科勒维尔) | 向 Dharmacon 申请报价 | |
| Beckman GH 3.8 摆桶转子 | Beckman | ||
| RiboMAX 大规模 RNA 生产系统（T7 聚合酶） | Promega | P1300 | |
| RiboMAX 大规模 RNA 生产系统（SP6 聚合酶） | Promega | P1280 | |
| Pierce 银染试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 24612 |
参考文献
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