生物素和光裂解链接器所附 rna 对高分子配合物的单步纯化

Summary

采用肉毒分蛋白策略纯化的 rna* 蛋白复合物在变性条件下被洗脱, 以不适合进一步纯化和功能分析的形式进行溶液处理。在这里, 我们描述了这种策略的修改, 利用光裂解链接器在 rna 和温和的紫外线洗脱步骤, 产生本地和全功能的 rna 蛋白复合物。

Abstract

多年来, 生物素与链霉素之间异常强烈和快速形成的相互作用已被成功地用于生物重要 rna 蛋白复合物的部分纯化。然而, 这一战略有一个主要的缺点, 限制了其更广泛的利用: 生物素/链霉素相互作用只能在变性的条件下打破, 这也会破坏洗脱的复合物的完整性, 从而排除了它们的随后的功能分析和/或其他方法的进一步纯化。此外, 洗脱的样品经常被背景蛋白污染, 这些蛋白质与链霉素珠没有特别的联系, 使银染色和质谱分析对纯化的配合物的分析复杂化。为了克服这些限制, 我们开发了一种生物素/链霉素策略的变种, 在这种策略中, 生物素通过光裂解链接器附着在 rna 基板上, 而固定在链霉素微珠上的配合物被选择性地洗脱, 以溶液。原生形式由长波 uv, 留下的背景蛋白上的珠子。较短的 rna 结合底物可以用生物素和光裂解链剂共价地合成到 rna 的 5 ' 端, 而较长的 rna 底物可以通过互补的寡核苷酸与这两组一起提供。这两个变种的 uv 洗脱法的纯化纯化 u7 snnp 依赖的加工复合物, 在 3 ' 端切割组蛋白前 mrna, 他们都证明与其他以前开发的纯化方法相比是有利的。uv 洗脱样品含有易于检测的 u7 snrnp, 该样本不含主要蛋白质污染物, 适合通过质谱和功能分析进行直接分析。所述方法可很容易地用于纯化其他 rna 结合物, 并与单链和双链 dna 结合位点结合使用, 以纯化 dna 特异性蛋白质和大分子复合物。

Introduction

在真核生物中, rna 聚合酶 ii 生成的 mrna 前体 (预 mrna) 在成为细胞质中蛋白质合成的全功能 mrna 模板之前, 在细胞核中经历了几次成熟事件。其中一个事件是 3 ' 结束处理。对于绝大多数的前 mrna, 3 ' 的端部处理涉及裂解结合到多腺苷酸化。这种两步反应是由一个相对丰富的复合体催化的, 该复合物^由15个以上的蛋白质1组成。动物复制依赖性组蛋白前 mrna 在 3 ' 端由 u7 snrnp 发挥关键作用的不同机制进行处理, u7 snrnp 是一种低丰度复合体, 由 ~ 60 核苷酸的 u7 snRNP 和多个蛋白质^2,3组成。.u7 snrna 碱基对具有组蛋白前 mrna 中的特定序列, u7 snrnp 的一个亚基催化裂解反应, 在没有聚 (a) 尾的情况下产生成熟的组蛋白 mrna。3 ' 组蛋白前 mrna 的最终处理还需要 stem-loop 结合蛋白 (slbp), 它结合位于裂解部位上游的保守茎环, 并增强了 u7 snRNP 在基板 2^,3中的招募。旨在确定 u7 snrnp 的各个成分的研究一直具有挑战性, 因为 u7 snrnp 在动物细胞中的浓度较低, 而且该复合体在纯化过程中倾向于分离或接受部分....

Protocol

1. 基板准备

注: 短于 ~ 65 核苷酸的 rna 基板可以用生物素 (b) 和光裂解 (pc) 文色剂 (统称为光裂解生物素或 pcb) 共价地合成到 rna 5 ' 端 (cis配置)。含有明显较长结合位点的 rna 底物需要通过 t7 (或 sp6) 转录在体外生成, 然后在 5 ' 端退火含有 pcb 的短补充适应剂寡核苷酸 (反式(图 1)。

1. 对于含有少于65个核苷酸的结合位点, 请使用商业制造商 (材料表) 以化学方式合成感兴趣的 rna, pcb 共价连接到 rna 5 的末端 (图 1 a和图 2 a)。溶解在无菌水中, 以达到所需的浓度, 并在-80°c 下储存在小的脂肪中。
2. 对于结合位点明显长于 ~ 65个核苷酸, 形成一个具有意义的体外生成 rna 的部分双工和一个含有 5 ' 端 pcb 基团的互补适应剂寡核苷酸 (图 3 a)。
   1. 在线性化质粒 dna 或适当的 pcr 模板上进行 t7 转录, 以生成在 3 ' 端通过 ~ 20 核苷酸任意序列延伸到感....

Results

uv 洗脱法在 pcb (cis配置) 的 5 ' 端共价连接在 pcb mi众 (cis 配置) 上, 用两种化学合成 rna 基板进行了测试: pcb-sl (图 1) 和 pcb-dh 5 型 rna (图 2)。31核苷酸 pcb-sl rna 包含一个茎环结构, 其次是5核苷酸单链尾, 其序列与成熟组蛋白 mrna 的 3 ' 端相同 (即, 在 u7 snRNP 的组蛋白前 mrna 裂解后)。这个独特的序列是哺乳动物细胞质分数中存在的两种蛋白质的已知结合位点: slbp 和 3 ' hexo^16,17,18。pcb-dh 5 是德索菲拉h3 组蛋白的63核苷酸片段, 除了茎环之外, 还含有一个结合五合五.......

Discussion

这里描述的方法很简单, 除了纳入光裂解链接器和 uv 洗脱步骤没有区别于常用的方法, 利用生物素和链霉素之间的极强的相互作用。uv 洗脱步骤是非常有效的, 通常释放75% 以上的固定化 rna 和相关的蛋白质从链霉素珠, 留下了一个高背景的蛋白质, 非专门结合到珠子。通过消除这种背景, uv 洗脱步骤产生了非常纯净的样品, 适用于银染色、质谱和功能分析的直接分析。

由于涉及相对较少和简单的步骤, uv 洗脱方法是高度可重复的, 提供足够数量的 u7 snrnp 银染色从只有100μl 的小鼠和果蝇核提取物 15.该方法是以前用于纯化 rn·蛋白复合物的其他实验策略的一个有吸引力的替代方法, 包括用 ms2 结合位点标记 rna 底物, 并通过 ms2-mbp 融合在直链淀粉珠上固定相关复合物蛋白。ms2 策略虽然成功地分离出相对丰富的分裂体和规范 3 ' 的末端处理复合物22^,23, 但未能产生足够数.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
链霉亲和素-琼脂糖	Sigma	S1638-5ML
高强度、长波紫外灯	Cole-Parmer	UX-97600-00
替换灯泡	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 瓦汞 H44GS-100M 灯泡发射 366 nm 紫外光 （Sylvania）
RNA 和寡核苷酸，含有生物素和光>顺式	中的生物素和光可切割接头Dharmacon（科罗拉多州拉斐特）或 Integrated DNA Technologies， Inc.（爱荷华州克拉尔维尔）		在 Dharmacon
Beckman GH 3.8 摆斗转子	克曼
RiboMAX 大规模 RNA 生产系统（T7 聚合酶）	Promega	P1300
RiboMAX 大规模 RNA 生产系统（SP6 聚合酶）	Promega	P1280
Pierce 银染试剂盒	赛默飞世尔科技	24612