在研究隐球菌-阿米巴相互作用中,显微技术和荧光读数的补充应用

Summary

本文详细介绍了利用静止光图像和高分辨率透射电子显微镜图像进行制备隐球细胞和阿米巴共同培养的协议。此处说明定量数据如何补充此类定性信息。

Abstract

为了模拟隐球菌感染,阿米巴是环境中隐球细胞的天然捕食者,可以作为巨噬细胞的模型。这种食肉生物,类似于巨噬细胞,利用噬菌体杀死内化细胞。借助共聚焦激光扫描显微镜,可以捕获描述隐球细胞和阿米巴之间交互时刻的图像。电子显微镜的分辨率也有助于揭示隐球细胞的超结构细节,当被困在阿米巴食物真空中时。由于噬菌体是一个连续的过程,因此定量数据随后被集成到分析中,以解释捕获图像的时间点时发生的情况。具体来说,读取相对荧光单位是为了量化阿米巴在隐球细胞内化中的效率。为此,隐球细胞被染色的染料,使他们荧光一旦被困在食物的酸性环境中。当一起使用时,通过此类技术收集的信息可以提供关键信息,以帮助得出细胞在阿米巴内部化时以及可能由其他噬菌体细胞内化时的行为和命运的结论。

Introduction

微生物经过一段时间的进化,在不同的生态区中占据并茁壮成长,如土壤和水的开放物理边界,^等等。在这些利基中,微生物往往直接争夺有限的资源;重要的是,对于营养,他们用来支持他们的生长或空间,他们需要容纳不断扩大的人口2,3。在某些情况下,一些霍洛索生物,如阿米巴甚至可能早于隐球细胞,作为从生物量4,5中提取营养物质的一种方式。反过来,这允许这些生物通过控制猎物的数量来确立领土优势。由于这种掠夺性压力,一些猎物可能被选择来产生微生物因子,如隐球胶囊6,以调和压力的负面影响。然而,作为这种压力的意外后果,一些微生物获得一些因素,使它们能够跨越物种屏障,寻找新的利基来殖民7,如人体的封闭空间,富含营养,具有理想条件。后者可以解释陆地微生物如何像隐球菌(C.新福曼人可以转化为致病性。

为此,必须研究隐球细胞与阿米巴的初始接触,以及如何选择它们成为致病菌。更具体地说,这可能为隐球细胞在感染期间受到巨噬细胞作用时的行为提供线索。正是出于这个原因,阿米巴被选为这里巨噬细....

Protocol

隐球新毒杆菌和一些阿坎塔莫埃巴卡斯特兰尼菌株被视为生物安全-2级(BSL-2)病原体;因此,研究人员在使用这些生物时必须采取适当的预防措施。例如,实验室人员应接受专门的培训和个人防护设备 (PPE),如实验室外套、手套和眼睛防护。生物安全柜(2级)应用于可能导致感染^{的程序14。}

1. 真菌细胞的培养和标准化(从Madu等人改^性15)

1. 在酵母-肽-dextrose (YPD) 琼脂板上从库存培养物(不超过 9 个月)中分离出测试真菌菌株(即 C.新福曼 S UOFS Y-1378 和C. 新福曼LMPE 046)。有关YPD琼脂的成分资料,见表1。
   注:C.新福曼UOFS Y-1378 已被证明能产生 3 羟基脂肪酸,而C. 新福曼LMPE 046 不产生 3 羟基脂肪酸。有关如何确定这些分子存在的信息,请参阅补充文件1。
2. 在30°C下孵育琼脂板48小时。
   注:一个盘子可以在4°C下储存长达2个月,然后被丢弃或用于制作股票^培养16。
3. 从 48 h 型旧板中刮去一圈隐球细胞(C.新福利斯....

Results

微生物是肉眼无法感知的微生物。然而,它们的影响可能导致可观察到的临床明显疾病,如皮肤感染。在研究微生物的某些方面时,从微生物的形态、副产品和相互作用,能够提供图片和视频证据至关重要。

我们首先试图可视化隐球细胞和阿米巴之间的相互作用。为此,首先研究了显示2小时共育细胞的明亮场图像。一张图片显示一个隐球细胞,它靠近阿米巴。其中一个阿米巴细胞被看到与扩展的伪波迪亚捕获隐球细胞(图1A)。接下来,捕获荧光中的相应图像以进行引用(图1B)。染色细胞表面的绿色荧光有助于确认隐球细胞的存在。未染色的阿米巴也自动荧光。除了明显的差异大小和形态外,这还有助于进一步区分两种细胞类型。

当生物结构自然.......

Discussion

在本文中,成功地使用了不同的技术来揭示当阿米巴与隐球菌细胞相互作用时可能出现的结果。此外,我们有兴趣展示3-羟基脂肪酸对隐球菌-阿米巴相互作用结果的影响。

第一种技术是共聚焦显微镜,它渲染静止图像。此处此技术的主要缺点是,它只为我们提供了仅限于特定时间点的信息。任何可以根据结果得出的结论都有助于归纳推理,其中人们可以根据一组观察^结果32得出结论。但是,仅仅因为观察存在模式的几种情况并不意味着该模式适用于所有情况。因此,在研究中,它被显示并可能告诫这种有限的信息如何可能导致毫无根据的结论。在这一点上,在没有矛盾或支持性的补充证据的情况下,可以得出结论,内化可能导致细胞的噬菌体。

成像的发展速度带来了新的机会,使科学发现,如发现沃莫细胞症29,30。为了说明这一点,不使用显微镜,可以记录延时视频,这一发现是不可能的。因此,在资源.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-二氮杂双环-[2.2.2]-辛烷	Sigma-Aldrich	D27802-1.5-mL
塑料管	Thermo Fisher Scientific	69715-15
mL 离心管	Thermo Fisher Scientific
7252018-50 mL 离心管	Thermo Fisher Scientific		1132017-8
孔室载玻片	Thermo Fisher Scientific	1109650	-
丙酮	Merck
SAAR1022040LC-Amoeba 菌株	ATCCÒ	30234TM	-
ATCC 培养基 712	ATCCÒ	712TM	阿米巴培养基
黑色 96 孔微量滴定板	Thermo Fisher Scientific	152089
-离心	Hermle	-
-氯仿	Sigma-Aldrich	C2432	-
共聚焦显微镜	Nikon	Nikon TE 2000	-
环氧树脂：
[1] NSA	[1] ALS	[1] R1054	-
[2] DER 736	[2] ALS	[2] R1073	-
[3] ERL Y221树脂	[3] ALS	[3] R1047R	-
[4] S1（2-二甲氨基乙醇）	[4] ALS	[4] R1067	-
异硫氰酸荧光素	Sigma-Aldrich	F4274	-
甲酸	Sigma-Aldrich
489441-Fluoroskan Ascent FL	Thermo Fisher Scientific	374-91038C	酶标仪
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	-
戊二醛	ALS	R1009	-
血细胞计数器	Boeco	-	-
柠檬酸铅	ALS	R1209	-
液相色谱质谱仪	Thermo Fisher Scientific		-
甲醇	Sigma-Aldrich	R 34,860	-
轨道摇床	Lasec	-	-
四氧化锇	ALS	R1015-pHrodo
Green Zymosan A BioParticles	Life Technologies	P35365	这是 pH 敏感染料
生理缓冲溶液	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	-
旋转振荡器	Labcon	-	-
磷酸钠缓冲液：
[1] 正磷酸氢二钠二水合物	[1] 默克	[1] 106580	-
[2] 正磷酸二氢钠	[2] 默克	[2] 106345
透射电子显微镜	Philips	Philips EM 100	-
台盼蓝	Sigma-Aldrich	T8154	-
超薄切片机	Leica	EM UC7	-
乙酸铀酰	ALS	R1260A	-
真空干燥器	Lasec	-	-
	Sigma-Aldrich	29651-U-YNB
	Lasec小瓶	239210-YPD
琼脂	Sigma-Aldrich	Y-1500	-