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方法文章

一种基于高内涵成像分析的视紫红质转运检测方法

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DOI：

10.3791/58703

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2019年1月16日

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of Pittsburgh, 2McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

本文内容

摘要

本文介绍了一种高内涵成像方法，用于定量分析与视网膜色素变性相关的视紫红质突变体的转运情况。采用多波长评分分析法，对细胞表面或全细胞内的视紫红质蛋白进行定量。

摘要

视紫红质错误折叠突变可导致视杆感光细胞死亡，表现为常染色体显性遗传性视网膜色素变性（RP），这是一种进行性致盲疾病，目前尚无有效治疗手段。我们假设，通过药物稳定突变型视紫红质蛋白，可减轻其细胞毒性。在众多II类视紫红质突变中，P23H突变编码一种结构不稳定的视紫红质突变蛋白，该蛋白在内质网（ER）中积聚，而野生型视紫红质则可转运至哺乳动物细胞的质膜。我们此前曾开展基于发光信号的高通量筛选（HTS），并鉴定出一组可促进P23H视紫红质从内质网转运至质膜的药理分子伴侣。在此，我们采用免疫染色结合高内涵成像分析方法，定量检测了全细胞及质膜上的突变视紫红质蛋白含量。该方法有助于在高通量筛选后有效区分真实阳性信号与假阳性结果。此外，高内涵成像分析使我们能够从单次实验中获取多个参数，以评估各化合物的药理特性。利用该检测方法，我们分析了11种不同化合物对6种与RP相关的视紫红质突变体的作用，获得了二维药理学图谱，从而对这些视紫红质突变体的结构稳定性及不同化合物对其作用效果实现了定性与定量的综合理解。

引言

蛋白质错误折叠与肌肉营养不良、神经退行性疾病以及致盲性疾病（包括视网膜色素变性（RP））有关1。RP是一种遗传性、进行性视网膜变性疾病，与超过60个基因的突变相关，这些突变影响视杆感光细胞或视网膜色素上皮细胞（RPEs）的功能和稳态2,3。目前尚无有效的RP治疗方法。Rhodopsin基因突变约占常染色体显性遗传（ad）RP病例的25-30%。在已报道的150多个rhodopsin突变中4（人类基因突变数据库，http:/www.hgmd.cf.ac.uk/），II类突变会导致视紫红质蛋白结构不稳定，从而导致视杆感光细胞死亡和视力丧失5,6,7,8。P23H是北美地区最常见的rhodopsin突变，也是II类视紫红质突变的典型代表9,10。由于其固有的结构不稳定性，错折叠的视紫红质在哺乳动物细胞的内质网（ER）中积聚，而野生型视紫红质则定位于质膜上5。错折叠的P23H视紫红质突变体表现出显性负性细胞毒性，这种毒性并非源于单倍剂量不足，而是与内质网相关蛋白降解通路的激活以及视杆外节结构的破坏有关。为了减轻视杆感光细胞的应激状态，一种策略是使用药物分子伴侣来稳定突变视紫红质的天然折叠构象。

为实现这一目标，我们采用基于细胞的高通量筛选（HTSs）11,12,13，利用β-半乳糖苷酶片段互补实验来定量检测P23H视紫红质突变体在质膜上的转运情况。该HTS实验具有稳健且简便的实验流程，使我们能够在每次筛选中检测约79,000种小分子的活性。然而，由于该HTS实验依赖发光信号读数，因此初筛命中列表中可能包含一些假阳性化合物，如β-半乳糖苷酶抑制剂、有色化合物或细胞毒性化合物，这些均需通过二次实验进一步鉴定。

传统的免疫染色和荧光成像方法已被用于研究哺乳动物细胞中视紫红质运输多年5,14,15,16。然而，这些常规方法无法用于量化超过10种化合物对视紫红质运输的药理学效应，因为可靠的成像分析需要在高度一致的条件下获取大量图像，而常规成像方法难以满足这一要求。在此，我们开发了一种基于免疫染色的高内涵成像方案，作为二级检测手段，用于量化错误折叠的视紫红质突变体在细胞表面的运输情况11,13,17。为了标记细胞质膜上的视紫红质，我们省略了细胞膜通透化步骤，并使用一种单克隆抗体（B6-30）对视紫红质突变体进行免疫染色，该抗体识别位于细胞膜外侧的视紫红质N端表位18。为了在全细胞范围内可视化突变型视紫红质，我们将视紫红质与Venus荧光蛋白融合。通过量化不同荧光通道中的荧光强度，我们能够在单次实验中获得多个参数，包括全细胞内的总视紫红质荧光强度、细胞表面的视紫红质荧光强度，以及细胞表面与全细胞视紫红质荧光强度的比值。将该方法应用于稳定表达共六种错误折叠视紫红质突变体的细胞，可生成多种小分子分子伴侣针对这些突变体的药理学谱型。在本方案中，所有细胞均在384孔板中进行免疫染色，并在高度一致的成像条件下使用自动化成像系统进行成像。对每个孔进行图像分析，每孔包含超过600个细胞的图像，以减少因细胞形态和蛋白表达水平差异所导致的异质性影响。本方案的工作流程总结于图1。该方法的优势在于，我们能够从基于图像的分析中获得高分辨率图像以及多参数定量数据。总体而言，该方案可经适当修改后应用于量化任何感兴趣的错误折叠膜蛋白的运输过程。

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方案

注意：视紫红质运输实验。

1. 细胞的准备与培养

  1. 复苏表达野生型（WT）或突变型小鼠视紫红质-Venus融合蛋白的U2OS稳定细胞。将细胞在37 °C下解冻，直至冻存管中仅剩少量冰晶。
    注意：本实验方案使用U2OS细胞，因为目前尚无可用的感光细胞系 体外 研究显示，在哺乳动物细胞中，视紫红质的纤毛前生物合成受到类似的分子机制调控。此外，U2OS细胞能够紧密贴附于培养板底部，且具有较大的细胞体，因此非常适合用于视紫红质运输检测。本文以表达野生型（WT）及T4R、P23H、P53R、C110Y、D190N和P267L突变型视紫红质的七种U2OS稳定细胞系为例，展示该检测方法的质量与可靠性。根据实验目的，也可使用表达其他视紫红质突变体或其他膜蛋白的稳定细胞系。若可获得表达人源视紫红质的稳定细胞，亦可用于本检测。本研究中采用小鼠视紫红质，因其与人源视紫红质蛋白序列同源性达95%，且通过该检测所鉴定出的化合物将被进一步验证 在体 使用携带视紫红质P23H突变的小鼠adRP模型8稳定细胞系的构建方法如前所述。19通过q-PCR定量检测野生型和突变型视紫红质转录本，并筛选表达水平相近的稳定细胞克隆用于本实验。视紫红质蛋白的表达通过免疫印迹和免疫染色予以确认。本实验所用细胞代数应低于20代。
  2. 将每层细胞转移至含有10 mL培养基（高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），含10%胎牛血清（FBS）和5 µg/mL Plasmocin）的15 mL锥形管中。
  3. 将离心管在200 x g 5分钟。弃去上清液，每种细胞系用5 mL细胞生长培养基重悬细胞沉淀。将每种细胞悬液转移至60 mm组织培养皿中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育。2.
  4. 当组织培养皿中的细胞融合度达到90%时，按参考文献所述进行细胞传代12.

2. 每孔接种5,000个细胞

注意：以下操作需在组织培养罩内进行。

  1. 用多聚赖氨酸处理培养板。
    1. 在接种细胞前一天，向黑色壁透明底的384孔板中每孔加入20 µL多聚赖氨酸溶液，处理30分钟。
    2. 吸除液体，使所有孔自然干燥1小时。盖上板盖，于4 °C保存过夜，用于后续细胞接种。
  2. 制备细胞悬液。
    1. 将每种细胞系在100 mm组织培养皿中用生长培养基培养至90%融合度。
    2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每个培养皿，并在37 °C条件下用1 mL 0.05%胰蛋白酶消化使细胞脱落。
    3. 将每种细胞系重悬于10 mL检测培养基中（高糖DMEM，含10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素和100 μg/毫升链霉素）。
    4. 计数细胞，并用检测培养基将每种细胞系稀释至1.25 x 105 个细胞/毫升。
  3. 接种细胞。
    1. 使用电子多通道移液器或自动化试剂分配仪，将细胞悬液以每孔40 µL的量接种至384孔板中，每种细胞系接种三列，共填充第1–21列（图2）。
    2. 作为对照，在第22–23列每孔加入40 µL U2OS (P23H-Rhodopsin-Venus) 细胞悬液，第24列每孔加入40 µL U2OS (Rhodopsin-Venus) 细胞悬液。
    3. 将培养板在300 x g 条件下离心30秒，使所有细胞沉降至384孔板底部。
      注意：细胞接种后避免对培养板造成物理震动。否则细胞会聚集在孔的一角，导致该板不适用于高内涵成像。
    4. 将384孔板置于37 °C、5% CO2条件下孵育3小时，使细胞贴附于培养板底部。

3. 用化合物处理细胞

  1. 按照图2所示的处理条件生成一个孔板图谱。
  2. 在96孔板中配制最多15种化合物的300 µL 5倍工作液。
    1. 将化合物1至15用检测培养基稀释至其最终浓度的5倍，分别加入96孔板的A1至G2孔中（图2A）。在H2孔中加入300 µL检测培养基。
      注：每种化合物的最终浓度采用高通量筛选（HTS）实验中对挽救P23H视紫红质转运最有效的浓度12,13。
    2. 分别向第11列和第12列的每孔加入100 µL用检测培养基稀释的2%二甲基亚砜（DMSO）和25 µM 9-cis-视黄醛。在避光条件下加入9-cis-视黄醛。
  3. 向培养有细胞的384孔板中每孔加入10 µL的5倍工作液（图2B）。
    1. 使用电子多通道移液器，将化合物1、3、5、7、9、11、13和15加入第1至21列的A、C、E、G、I、K、M和O行（图2）。将化合物2、4、6、8、10、12、14和M加入第1至21列的B、D、F、H、J、L、N和P行。
    2. 向第22列和第24列的每孔加入10 µL的2% DMSO。向第23列的每孔加入10 µL的25 µM 9-cis-视黄醛。
      注：由于所有化合物的储备液均以DMSO溶解，因此使用DMSO作为溶剂对照。表达P23H视紫红质并经DMSO处理的细胞所在的第22列为0%对照。表达P23H视紫红质并经9-cis-视黄醛处理的细胞所在孔为100%对照。
  4. 用铝箔纸覆盖384孔板，并在37 °C下孵育24小时。

4. 无需膜通透处理的免疫染色法用于标记细胞表面的视紫红质蛋白。

注意：在整个免疫染色过程中避免使用任何去污剂，以保持细胞膜完整。

  1. 在通风橱中，将16%的多聚甲醛（PFA）与PBS按1:4的体积比稀释，配制4%的多聚甲醛溶液。将配好的4% PFA转移至试剂储液槽中。
  2. 在暗室红光条件下取出384孔板。使用连接至真空收集瓶的8通道移液器，轻柔地吸除各孔中的培养基。使用电子多通道移液器向整个384孔板的每个孔中加入20 µL新配制的4% PFA，室温孵育20分钟。为避免细胞脱落，每次吸液时均应将移液器吸头对准每个孔的同一侧壁，切勿触碰孔底中央区域。成像时应选择避开移液器接触区域的视野。若孵育时间超过10分钟，需用孔板盖覆盖384孔板以防止蒸发。
    注意：在暗室中进行固定是为了避免再生异视紫红质发生光漂白，从而影响100%对照组的实验结果。固定完成后，可将384孔板移至正常光照条件下。
  3. 使用8通道移液器吸除各孔中的PFA溶液，再使用电子多通道移液器向每个孔中加入50 μL PBS。重复此步骤两次，共进行三次PBS洗涤。
    注意：含PFA的废液应收集于带盖瓶中，并在实验结束后作为危险化学品废弃物妥善处理。
  4. 向整个384孔板的每个孔中加入20 µL 5%山羊血清，用于封闭非特异性结合位点，室温孵育30分钟。
  5. 吸除5%山羊血清，向A至O行的每个孔中加入15 µL含20 µg mL-1 B6-30抗视紫红质抗体的1%山羊血清溶液。向P行的每个孔中加入15 µL 1%山羊血清溶液，作为仅二抗对照组。
  6. 将384孔板在室温下孵育90分钟，或在4 °C下过夜孵育。用铝箔纸包裹384孔板以避免荧光染料发生光漂白。
  7. 用PBS对孔板进行三次洗涤，每次每孔加入50 µL。
  8. 吸除PBS，向每个孔中加入15 µL 5 µg mL-1 Cy3标记的山羊抗小鼠IgG抗体。用铝箔纸包裹384孔板，室温孵育1小时，或在4 °C下过夜孵育。
  9. 用PBS对孔板进行三次洗涤，每次每孔加入50 µL。随后每孔加入50 µL含1 µg mL-1 Hoechst 33342的PBS溶液，室温孵育15分钟以染色细胞核。
  10. 成像前用透明封板膜密封384孔板。若需立即成像，可将孔板用铝箔纸包裹后于4 °C避光保存，最长可保存一周。

5. 成像.

注意：本高内涵成像流程适用于 材料表 中列出的成像系统。若使用其他高内涵成像系统，操作步骤可能有所不同。

  1. 取下盖子，将384孔板放入高内涵成像仪中，确保A1孔位于板的左上角。
  2. 打开图像采集软件以设置图像采集参数。
    1. 打开“板式采集设置”窗口，创建新设置或加载现有的设置文件。
    2. 选择20倍物镜，并将像素合并（pixel binning）设为2，使校准后的像素尺寸为0.80 × 0.80 µm。将扫描线设为2,000，每视野图像尺寸（宽×高）设为1,000 × 1,000像素（800.00 × 800.00 µm）。
    3. 选择要成像的板类型。根据384孔板制造商提供的信息填写板的尺寸参数。
    4. 选择384孔板中需要成像的孔。
    5. 每孔选择四个成像位点。避免选择被移液吸头接触过的孔壁边缘区域。
    6. 选择激发激光波长为405 nm、488 nm和561 nm。为DAPI、FITC和Texas Red通道选择相应的发射滤光片。优化各通道的激光功率和增益，确保阳性对照孔图像的亮度低于饱和阈值。
    7. 选择“孔间聚焦”作为自动对焦模式。将首个采集的孔设为寻找样本的初始孔。将位点自动对焦设置为所有位点。
    8. 每个通道每行选择四次平均扫描。优化各通道的Z轴偏移值（Z-offset）。
    9. 在384孔板对角线角落测试2至3个孔，确保所有测试孔的图像均在焦内，每孔各成像位点的细胞汇合度超过40%，且在100%对照孔中所有通道的荧光强度约为半饱和状态。
    10. 保存图像采集方法。
  3. 运行整块板的成像。在离开成像仪前，观察仪器直至完成第一列孔的图像采集，以再次确认图像质量。成像结束后取出384孔板，并于4 °C保存以备后续使用。
    注意：根据每孔选择的成像位点数量及采集的通道数，完成一块384孔板的成像通常需要40分钟至3小时。

6. 图像分析。

  1. 使用高内涵图像分析软件提取图像数据。选择一个100%对照孔（第23列）以设置参数。
  2. 选择多波长细胞评分作为分析方法，并开始配置设置。
    1. 使用DAPI通道的图像定义细胞核。预览以确保所选孔中定义的细胞核形状与细胞核图像吻合良好。
    2. 在FITC通道中定义细胞形态，该通道用于成像视紫红质-Venus（rhodopsin-Venus）。
    3. 在Texas Red通道中定义细胞表面视紫红质染色区域。
    4. 在5个孔中测试当前算法，以确定设置是否已优化。保存设置并关闭配置窗口。
  3. 使用优化后的分析方法对所有孔进行分析。
  4. 导出对象数量作为完整细胞数。将FITC通道的平均强度导出为视紫红质-Venus强度（Rhodopsin-Venus INT）。将Texas Red通道的平均强度导出为细胞表面视紫红质强度（Rhodopsin INT on the cell surface）。
  5. 在电子表格软件中打开导出的数据。将细胞表面视紫红质强度除以视紫红质-Venus INT，得到膜定位与总蛋白比值（MEM-to-total ratio）。计算每个参数的Z'因子以评估实验质量。Z′=1−3×(STD100% control+STD0% control)/|Mean100% control−Mean0% control|。
    注意：Z'因子大于0表明该实验具有中等质量，适用于高内涵筛选；Z'因子介于0.5至1之间表明实验质量优异，适用于高通量筛选20,21。
  6. 使用电子表格软件为每个参数生成双色热图。将细胞系名称排列在X轴，化合物排列在Y轴。

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结果

我们使用三个参数来表征视紫红质的运输情况：整个细胞中的视紫红质-Venus 荧光强度（Rhodopsin-Venus INT）、质膜上视紫红质的免疫染色强度（细胞表面视紫红质 INT），以及细胞表面视紫红质染色强度与整个细胞中视紫红质-Venus 荧光强度的比值（膜-总量比值）。视紫红质运输实验的代表性结果展示于图 3和图 4。以表达 P23H-视紫红质-Venus 的 DMSO 和 9-cis-视黄醛处理的细胞分别作为 0% 和 100% 对照，这三个参数的 Z' 因子范围在 0 到 0.5 之间，表明该实验具有中等质量，足以进行高内涵成像21。尽管由于其实验步骤相对于高通量筛选实验较为复杂，优化后的 Z' 因子低于 0.5，但该实验对于基于图像的分析而言仍然是稳健可靠的。能够挽救错误折叠视紫红质的活性化合物，其细胞表面视紫红质 INT 和膜-总量比值应显示出高于 DMSO 处理组的值，...

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讨论

本文展示了一种高内涵成像检测方法，用于表征高通量筛选（HTS）中鉴定出的阳性化合物。这些实验方案中唯一涉及的自动化设备是高内涵成像仪。视紫红质的免疫染色与荧光成像已被广泛用于研究视紫红质的定位5,14,15,16。然而，传统成像方法所获取图像的定量分析受到以下因素限制：每种实验条件下获得的细胞图像数量不足、每次实验的成像通量较低，以及缺乏质量控制参数。我们将传统的免疫染色方案优化为适用于384孔板的格式，并以高内涵成像替代传统成像。利用该高内涵成像方案，我们成功筛选并表征了通过高通量筛选鉴定出的阳性化合物活性11,13,17。与传统免疫染色和成像方法相比，本方案显著提高了成像条件的一致性、成像通量以...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢马克·E·舒尔达克博士（Dr. Mark E. Schurdak）以及匹兹堡大学药物发现研究所提供高内涵成像仪及初始培训。克日什托夫·帕尔泽夫斯基博士（Dr. Krzysztof Palczewski，凯斯西储大学）慷慨提供了1D4和B630抗视紫红质抗体。含有小鼠视紫红质-Venus融合基因cDNA的质粒由尼文·兰伯特博士（Dr. Nevin Lambert，奥古斯塔大学）提供。本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金项目EY024992（资助对象：YC）以及匹兹堡大学视觉研究中心核心基金P30EY008098的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
U2OS（视紫红质-Venus）细胞NANA由U2OS细胞构建的稳定细胞系
U2OS（T4R-视紫红质-Venus）细胞NANA由U2OS细胞构建的稳定细胞系
U2OS（P23H-视紫红质-Venus）细胞NANA由U2OS细胞构建的稳定细胞系
U2OS（P53R-视紫红质-Venus）细胞NANA由U2OS细胞构建的稳定细胞系
U2OS（C110Y-视紫红质-Venus）细胞NANA由U2OS细胞构建的稳定细胞系
U2OS（D190N-视紫红质-Venus）细胞NANA由U2OS细胞构建的稳定细胞系
U2OS（P267L-视紫红质-Venus）细胞NANA由U2OS细胞构建的稳定细胞系
DMEM高糖培养基Genesee Scientific25-500含L-谷氨酰胺、丙酮酸钠
胎牛血清（FBS）Gibco16140071经热灭活处理
PlasmocinInvivoGenant-mpt支原体清除试剂
青霉素-链霉素（100X）Gibco15140122100倍浓缩的抗生素溶液，用于防止细胞培养中的细菌污染
胰蛋白酶-EDTAGenesee Scientific25-5100.25%胰蛋白酶，含1 mM EDTA，溶于无钙镁的HBSS中
聚-L-赖氨酸溶液Sigma-AldrichP4707-50ML分子量70,000–150,000，0.01%，经无菌过滤，BioReagent级，适用于细胞培养
CellCarrier-384超微孔板PerkinElmer6057300384孔组织培养处理微孔板，黑色孔壁，环烯烃共聚物光学透明底，适用于高内涵细胞成像分析
无菌96孔板Eppendorf30730119组织培养处理，平底带盖，无菌，无检测出的热原、RNase、DNase和DNA，无细胞毒性
磷酸盐缓冲液（PBS）InvitrogenAM962510倍浓缩PBS缓冲液，pH 7.4
DMSOSigma-AldrichD4540>99.5%，经细胞培养测试
9-cis-视黄醛Sigma-AldrichR5754
测试化合物Selleckchem/Life Chemicals/定制合成NA化合物购自不同供应商或定制合成
B6-30抗视紫红质抗体NovusNBP2-25160由Krzysztof Palczewski博士惠赠
Cy3标记的山羊抗小鼠二抗Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc115-165-146
16%多聚甲醛Thermo Fisher Scientific28908无甲醇
10%正常山羊血清Thermo Fisher Scientific50062Z封闭缓冲液
Hoechst 33342三盐酸InvitrogenH3570细胞核染色液
高内涵成像仪Molecular DevicesImageXpressImageXpress® Micro共聚焦高内涵成像系统
MetaXpress高内涵图像采集与分析软件Molecular DevicesMetaXpress高内涵图像采集与分析软件
多通道移液器（0.5–10 µL）Rainin17013802手动8通道移液器，0.5–10 µL
多通道移液器（0.5–10cRainin17013805手动8通道移液器，20–200 µL
电子多通道移液器（10–200 μL）Thermo Scientific14-3879-56BT适用于96孔和384孔微孔板加样操作的电子多通道移液器
50 mL试剂储液槽Genesee Scientific28-125用于多通道移液器加样操作的试剂储液槽
8通道吸液器ABC ScientificEV5038通道不锈钢适配器，用于从96孔或384孔板中吸取液体
Excel电子表格软件MicrosoftExcel2016用于数据分析和热图生成的电子表格软件
Origin2018科学数据分析与绘图软件OriginLabOrigin2018用于生成剂量-反应曲线的数据分析软件

参考文献

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